כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית
11 במרץ 2016
אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תומך ברשתית התחושתית, באמצעות מיחזור תוצרי לוואי של מחזור הראייה, המצטברים כליפופוסין. מוצרים אלה הם אוטו-פלואורסצנטיים וניתן לצלם אותם באופן איכותי in vivo. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה כמותית של ליפופוסין RPE באמצעות אופטלמוסקופיה בלייזר סריקה קונפוקלית.
המטרה הכללית של פלואורסצנציה עצמית כמותית, או qAF, היא להעריך את הרמה הכללית של ליפופוסין בתאי התמיכה של הרשתית, האפיתל הפיגמנטי של הרשתית, או RPE, הן בעיניים בריאות והן בעיניים חולות. טכניקה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של תאי הרשתית, כגון האופן שבו בריאות האפיתל הפיגמנטי של הרשתית משפיעה על התפתחות של ניוון מקולרי תלוי גיל, או AMD. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לקבוע רמות מוחלטות של פלואורסצנציה עצמית של ליפופוסין בקרקית העין, ובכך מאפשרת מעקב כמותי וניתן לשחזור בין מטופלים, בין מפגשי דימיון של אותו מטופל ובאוכלוסיות מחקר גדולות.
לפני הצילום, הגדירו כראוי את מכשיר ה-confocal scanning laser opthamoscopy, או CSLO, לרכישת נתונים בהתאם להוראות היצרן. כדי להתקין רפרנס פלואורסצנטי פנימי, הנרכש מהיצרן, סובבו את העדשה כדי להסירה, פתחו את הטבעת המתכתית של המכשיר והחליפו אותה בטבעת מתכתית חדשה המכילה את הרפרנס. חיוני שהאישונים יהיו מורחבים ללפחות 6mm כדי לאפשר מעבר רציף של אור.
בעזרת 0.5%tropicamide ו-2.5%phenylephrine, הרחבו את אישוני המטופל לפחות ל-6mm, דבר החיוני למעבר אור רציף כדי לראות ולמדוד את קרנית העין (fundus). מקמו את המטופל כראוי על ה-CSLO, כאשר הסנטר נשען על משענת הסנטר, המצח מונח על משענת המצח, והזוויות החיצוניות של העין (lateral canthi) מיושרות כראוי עם האינדיקטורים. כדי להשיג תמונות בסיס, צלמו תחילה את קרנית העין באמצעות החזר אור בקרן אינפרא-אדומה קרובה, או אור IR, על מנת למרכז את המצלמה מעל המקולה ולהשיג פוקוס ראשוני.
לאחר מיקום נכון של המטופל, העבירו את הגדרת החומרה בלוח הבקרה למצב דימות IR, מקמו את המצלמה באופן ידני עד שהקרקעית תהיה בפוקוס מלא, וצלמו תמונה. שנו את ההגדרה בלוח הבקרה ל-IROCT, המשתמש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטראלי, או SDOCT, בשילוב עם דימות IR, כדי להעריך את המקולה לאיתור מחלה בבסיסה. השתמשו במדריכים המופיעים בחלון הדימות כדי ליישר נכון את ה-OCT לתמונת ה-IR של הקרקעית.
על מנת להשיג איכות SDOCT אופטימלית, מקם את המצלמה כך שתמונת ה-OCT תהיה בשליש העליון של חלון הדמיון. בצע לפחות סריקה קוית אופקית אחת העוברת דרך הפובאה ומקיפה את כל שדה הדמיון. להגדרת דמיון qAF, השתמש ברכישת תמונות במהירות גבוהה, דבר המפחית את הסיכון לאובדן אות כתוצאה מתנועת המטופל או חסימת האור על ידי הקשתית או העפעפיים.
השתמש במיצוע של 9 פריימים (Mean of 9 frames), המצלם במהירות וברצף תשעה פריימים של תמונה, אשר ממוצעים לאחר מכן כדי להפחית רעשים וארטיפקטים. בחר שדה ראייה של 30 x 30 מעלות, המתייחס למעלות של שטח הרשתית הנלכדות במהלך רכישת התמונה. לאחר התרת המטופל על האור הכחול, הפעל את מצב ה-AF ויישר את ציר המצלמה כך שהמסך ימולא באופן מקסימלי ב-AF של קרנית העין, עם הגממה מינימלית של הצדדים והפינות של התמונה.
אם המטופלים מתקשים לסבול את האור הכחול והבהיר, הרחיקו את המצלמה מהעין בתחילת ההדמיה, והקרבו את המצלמה באיטיות לעבר המטופל עד שהקרקית תהיה גלויה במלואה. התאימו את כיוון המצלמה באופן ידני או באמצעות ג'ויסטיק האופתלמוסקופ על ידי הזזת ה-CSLO כדי למקם מחדש את המצלמה כך שאות ה-AF יהיה ברמתו הגבוהה ביותר לאורך כל השדה, במקום לשאוף לקבלת התמונה החדה ביותר. במהלך רכישת התמונה, פיקסלים צבעוניים הנראים ברפרנס הפנימי או בקרקית מעידים על רביית יתר (oversaturation), ולפיכך על אובדן אות.
חשף את הרשתית באופן מלא לאור AF למשך 20 שניות לפחות כדי למזער את ספיגת האור על ידי rhodopsin ברשתית החושית במהלך ההדמיה. השתמש בפרק זמן זה כדי למטב את יישור המצלמה, הפוקוס והרגישות. הנחה את הנבדקים למצמץ לפני כל רכישת תמונה, שכן שכבת דמעות רעננה משפרת את איכות האות.
הימנעו מהעפ eyelids במישור הרכישה וצלמו את התמונה. חשוב להפיק לפחות שתי תמונות באיכות גבוהה בכל סבב הדמיה לצורך ניתוח הנתונים. בצעו עיבוד לאחר צילום באמצעות תוכנת ה-CSLO כדי לחשב את הממוצע של ערימת תשע הפרימים, ובכך להעלות את יחס האות לרעש.
בצעו ניתוח תמונות בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כפי שמוצג כאן, בעיניים בריאות, AF הנפלט מה-RPE מפוזר באופן אחיד יחסית בכל קרקעית העין. ניתן להבחין בעוצמה מופחתת באזור המקולרי המרכזי עקב חסימת אור על ידי פיגמנט המקולה, ובדפנות ובפינות בשל האופטיקה של העין והמצלמה.
הכליים צריכים להיות כהים ובמיקוד ברור. איור זה מייצג הצגה תואמת של מפת חום עבור רמות ה-qAF מהאיור הזה. צבעים קרירים תואמים לאזורים בעלי עצימות AF נמוכה יותר, בעוד שצבעים חמים תואמים לאזורים בעלי עצימות AF גבוהה יותר.
עוצמה מקסימלית נצפית בדרך כלל בטבעת השמינית השנייה הקונצנטרית, והעוצמות הממוצעות באזור זה משמשות למרבית ניתוחי הנתונים. מוצג כאן ניתוח מייצג של עין עם AMD, המדגים אטרופיה גיאוגרפית, צורה מתקדמת של AMD. צורה זו של AMD גורמת לאזורים מקומיים של אובדן RPE, המעידים על AF מופחתת משמעותית או חסרה, וגורמת לאובדן הדרגתי של הראייה המרכזית.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבחור את המטופלים המועמדים בקפידה ולהשיג תמונות באיכות גבוהה באופן עקבי כדי למקסם את איכות הנתונים. שימוש בפרוצדורה זו יכול לאפשר מעקב אורך של בריאות הרשתית כדי לקבוע את התקדמותה של דגנרציה רשתיות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האופתלמולוגיה לעקוב אחר דגנרציות רשתיות ולנתח אותן.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי השימוש באוטופלואורסצנציה כמותית להערכת מטופלים עם דגנרציה של הרשתית. תודה לצפייה, ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בשיטה לדימות כמותי של ליפופוסין באפית הפיגמנט של הרשתית (RPE) באמצעות אופטלמוסקופיה בלייזר סורקת קונפוקלית (CSLO). הטכניקה שואפת להעריך את רמות הליפופוסין בעיניים בריאות ובחולות, ובכך לתרום להבנתנו את הביולוגיה של תאי הרשתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- רפואת עיניים
- ביולוגיה של התא
רקע
- ה-RPE תומך ברשתית החישית על ידי מיחזור תוצרי לוואי של המחזור הראייתי.
- הצטברות של ליפופוסין עשויה להעיד על הבריאות התאית.
- הבנת רמות הליפופוסין היא קריטית לחקר של ניוון רשתית הנגרם מגיל (AMD).
- דימות כמותי מאפשר הערכות הניתנות לשחזור בין מטופלים ומחקרי השוואה.
מטרת המחקר
- להערכה כמותית של רמות הליפופוסין ב-RPE.
- לבחינת הקשר בין בריאות ה-RPE לבין התפתחות AMD.
- לביסוס טכניקת דימות אמינה ליישומים קליניים ומחקריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הגדרה וכיול של מערכת אופתלמוסקופיה לייזר סורקת קונפוקלית (CSLO).
- שימוש ברפרנס פלואורסצנטי פנימי למדידות מדויקות.
- הרחבת אישונים ללפחות 6mm למעבר אור אופטימלי.
- דימות אוטופלואורסצנציה כמותי של קרקית העין.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של רמות ליפופוסין במצבים שונים של העין.
- קביעת רמות בסיס של אוטופלורסנציה לצורך השוואה.
- הדגמת השחזוריות של הטכניקה לאורך מפגשי דימוג.
- תובנות לגבי תפקידו של הליפופוסין בבריאות ובמחלות של הרשתית.
מסקנות
- דימוי כמותי של ליפופוסין הוא כלי בעל ערך במחקרים על הרשתית.
- שיטה זו משפרת את הבנתנו לגבי התפקוד והפתולוגיה של ה-RPE.
- מחקרים נוספים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור AMD ומחלות רשתית אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
פלואורסצנציה עצמית כמותית של קרנית העין (qAF) מאפשרת מדידה מוחלטת וניתנת לשחזור של רמות ליפופוסצין באפיתל הרשתית (RPE), ובכך מספקת סמן ביולוגי למצוקה תאית ודגנרציה במודלים פרה-קליניים של מחלות רשתית. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות טיפוליות על ידי מתאם בין המצב התפקודי של ה-RPE לבין שלמות הרשתית החושית, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים מנגנוניים בתוכניות לגילוי תרופות באופתלמולוגיה. הטכניקה מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מולקולות מובילות (lead identification) על ידי כך שהיא מאפשרת מעקב אורך של התקדמות פתולוגית במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות כימות הצטברות ליפופוסין כמדד לתפקוד הפגוציטוזי והליסוזומלי של ה-RPE במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הערכה סטנדרטית וניתנת לשחזור של בריאות ה-RPE לאורך תנאים ניסיוניים ונקודות זמן שונות.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור רמות הליפופוסין ב-RPE למצב של דחק וניוון של הפוטורספטורים, ובכך מספק מידע לביסוס הביטחון במטרה במהלך תיקוף פרה-קליני.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מודלים מאושרים של רשתית לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי קביעת רמות בסיס של ליפופוסין וספי רגישות לגילוי.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה והדירות באמצעות כיול רפרנס פלואורסצנטי פנימי ופרמטרי דמיוּן מבוקרים.
- ערך סקלאביליות: מאפשר יישום בתפוקה גבוהה באמצעות ממוצע פריימים מהיר ורכישת שטח ראייה סטנדרטי עבור אוכלוסיות מחקר גדולות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רצף תרגומי על ידי קישור דפוסי ליפופוסין ב-RPE לשינויים מבניים ברשתית החיצונית, ובכך תומך במידול מחלה התואם לסמנים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים באמצעות מעקב כמותי ואורכי של התקדמות הניוון במחקרים פרה-קליניים.
- ערך ניבוי: משפר את הפחתת הסיכונים המכניסטית על ידי אספקת נתונים אובייקטיביים ומתואמים על ירידה תפקודית ב-RPE שקדמה לאובדן פוטורצפטורים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
אוטופלורסצנציה כמותית משתלבת ברצף הגילוייםB בתחום הפתלוגיה של העין, החל מאישוש מטרות מוקדם ועד להערכת יעילות פרה-קלינית, ובכך מאפשרת קבלת החלטות מבוססות נתונים (go/no-go) בהסתמכות על מדדי בריאות של ה-RPE.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי כימות הליפופוסצין כמדד תפקודי לפעילות המטבולית וליזוזומלית של ה-RPE.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות דימות הניתן לשחזור עם רעש מופחת, באמצעות רכישת ממוצע של 9 פריימים ודימות של שדה ראייה סטנדרטי של 30x30 מעלות.
- אנליזה: מייצרת מפות כמותיות של עוצמת הליפופוסצין וערכי ממוצע אזוריים (למשל, טבעת ריכוזית שנייה) לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים ומחקרי אורך.
- מחקר תרגומי: מקשרת מדדי ליפופוסצין של RPE לשלמות הרשתית החושית, מה שמאפשר רצף פרה-קליני כאשר סממנים ביולוגיים מבניים ותפקודיים תואמים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר במודלים של מחלות שונות (למשל, AMD, רטינופתיות תורשתיות) הודות לפרוטוקולי כיול ודימות סטנדרטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתקשורת בין ה-RPE לפוטורצפטורים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות שימוש ברפרנס פנימי, בקרת הרחבת אישונים ופרמטרים עקביים לרכישת תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות go/no-go מוקדמות המבוססות על ביומרקרים כמותיים של עקה ב-RPE.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות מעקב אורך, הדיר, אחר התקדמות הניוון במודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות אופתלמולוגי ובתפעול של אופתלמוסקופ לייזר סורק קונפוקלי (CSLO).
- תלוי במכשור CSLO בעל מצב אוטופלורסצנציה ותאימות למסמך פלואורסצנציה פנימי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין הצוותים עבור פרוטוקולים להרחבת אישונים (0.5% tropicamide, 2.5% phenylephrine) ועקביות במפגשי הדימות.
- כולל שיקולי התאמה בין מיני מודלים בשל הבדלים באנטומיה של קרקית העין, פלואורסצנציה של ליפופוסצין וגודל האישון.
- מוגבל בשל סיכון לרוויה של האות כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור כחול ועכירות של המדיה, דבר הדורש תזמון חשיפה קפדני ופרוטוקולי מצמוץ.
