תלת ממדי טכנולוגיה Biomimetic: רומן Biorubber יוצר מוגדרת מיקרו מאקרו בקנה מידה ארכיטקטורות ב הידרוג קולגן
12 בפברואר 2016
טכניקת ייצור ביולוגי חדשנית פותחה כדי להנדס מבנים תלת מימדיים הדומים לתכונות האדריכליות, הרכיבים והתכונות המכניות של רקמת in vivo. טכניקה זו כוללת חומר קורבן שפותח לאחרונה, גומי BSA, המעביר תכונות מרחביות מפורטות, ומשחזר את ארכיטקטורות in vivo של מגוון רחב של רקמות.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להנדס פיגומי קולגן תלת מימדיים שיכולים להידמות למאפיינים הארכיטקטוניים, ההרכב והתכונות המכניות של רקמת in-vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות, כגון אינטראקציות בין תאי ECM, השפעת מאפיינים אדריכליים ביצירת רקמות מהונדסות ופיתוח תחליפי רקמות, בין היתר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הליך בר-קיימא לסיכום המיקרו-גיאומטריה של תעלות זרימה פנימיות ושבילים בנאמנות גבוהה בחומר מתכלה.
מי שתדגים את ההליך תהיה ורוניקה רודריגז-ריברה, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. יש לאחסן את החומרים המשמשים להכנת גומי ה-BSA ולשמור אותם קרים עד שהם מוכנים לשימוש כדי שגומי ה-BSA לא יתייצב בטרם עת. סטריליות חשובה מאוד גם להליך זה.
ראשית, יש לעקר את המתקן. במכסה מנוע שאינו תרבית תאים, הניחו את טבעות ה-O, המזרק, המכסה, קצה התערובת והמתקן לארבעה לאחד. UV מעקר חומרים אלה למשך 30 דקות.
ראשית, הברג את שני חלקי תבנית הנירוסטה יחד וחבר את מנעול Luer. לפני הרכבת המתקן, רססו פיפטות וריאגנטים לפני הכנסתם למכסה המנוע עם 70% אתנול. ראשית חבר את מכסה הקצה למחזיק התמיסה.
לאחר מכן, טען את תמיסת ה-30% BSA לתא הגדול יותר מבלי לזהם את החדר השני. השאירו מספיק מקום לחיבור טבעת ה-O. לאחר מכן, טען את תא המתקן הקטן יותר בשלושה אחוז גלוטרלדהיד והצמד טבעת O נוספת.
כעת, חבר את המזרק למתקן. לאחר מכן הטה את המכלול כך שהמכסה יהיה למעלה, והחלף את המכסה בקצה ערבוב. לאחר מכן הקש בעדינות על הצדדים כדי לאפשר לבועות האוויר לנוע כלפי מעלה.
לאחר מכן, הנח את המתקן בתוך שקית חיטוי כדי להכיל את תמיסת הפליטה. בשקית, כשהמתקן זקוף, הוציאו כמות קטנה של תמיסה כדי לנקות את כל האוויר מהמזרק. הוצאת האוויר חשובה מאוד.
לאחר מכן, במהירות, חבר את מנעול ה-Luer של תבנית Y מנירוסטה לקצה המזרק. כעת, עם העובש ביד הלא דומיננטית שלך, תמיסת פליטה חלופית לתוך האגזוזים השמאלי והימני של תעלות הזרימה. לחץ על האגזוזים ובכך מלא את החללים הפנימיים בתמיסה.
לאחר מכן, מקם את התבנית בצורה אופקית והזריק לה תמיסה נוספת עד שנעשה שימוש במחצית מנפח המתקן. כעת יש להניח את התבנית בצלחת, לעטוף אותה בפרפילם ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הליך זה מורחב לארבעה גרם של קולגן מחומצן.
שמור אותו מקורר עד לשימוש. לאחר שקלול הקולגן, המשך לעקר את התמיסה על ידי קרינת גמא. בהכנה, הכינו תמיסת HEPES רגילה 0.2 במים.
לאחר מכן העבירו את התוכן לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. התאם את ה-pH לתשע באמצעות נתרן הידרוקסיד מרוכז. הקפד לעקר את מכסה המנוע באמצעות UV ולחטא את המלקחיים, המרית והאזמל.
במכסה המנוע, מערבבים 1.5 מיליליטר מתמיסת HEPES עם 1.5 מיליליטר של 10x MEM. אחסן את התערובת הזו על קרח. כמו כן, מצננים צלחת 12 באר ומזרק 20 מיליליטר במקפיא למשך 10 דקות.
לסטריליות נוספת, יש לרסס את הצינורות והצלחות המעורבים ב-70% אתנול לפני הנחתם במכסה המנוע. מרססים את צלחת התבנית ומניחים אותה במכסה המנוע. לאחר מכן, הסר את תבניות הגומי של BSA בעזרת מלקחיים.
לאחר מכן, חותכים את תעלות הפליטה מהתבנית בעזרת אזמל. לאחר מכן, מערבל לזמן קצר את תערובת HEPES-MEM והוסף מיליליטר אחד לקולגן. לאחר מכן, מערבבים היטב את התמיסה בעזרת מרית סטרילית.
עקוב עם מערבולת קצרה, והעביר במהירות את התמיסה למזרק הקר של 20 מיליליטר. כעת, תוך כדי אבטחת גומי ה-BSA בתוך הבאר, הוצא מחצית מתמיסת הקולגן הידרוג'ל לתחתית הבאר. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, מקם את התבנית כך שקצוות זרימת הגומי ויציאת הגומי נוגעים בקירות הבאר.
לאחר מכן, מכסים את התבנית בהידרוג'ל קולגן. כעת, אטמו את הבאר עם פרפילם, והעמיסו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. המתינו שעה עד שהקולגן יתפלמר.
במהלך תקופה זו, השאר את אור ה-UV במכסה המנוע. כמו כן, הגדר את מנגנון הצלבת ה-UV לספק 630, 000 מיקרו-ג'אול לסנטימטר מרובע. כעת, רססו את הידיים עטויות הכפפות שלכם באתנול 70%, והעמיסו את הצלחת עם התבניות המכוסות בקולגן לתוך הצלב, והתחילו בתהליך ההקרנה.
לאחר ההקרנה, רססו שוב את הכפפות ופרקו את הצלחת מהמקשר. לאחר מכן, בעזרת מרית סטרילית, הסר את הג'ל מהבאר, הפוך אותו וקשר את תחתית ההידרוג'ל. לאחר מחזור ההצלבה האחרון, המשך בעיכול האנזים.
כדי להסיר את גומי ה-BSA מבלי להפריע לפיגום הקולגן, השתמש בתמיסת טריפסין סטרילית של 0.25% ב-pH 7.8 ולחץ אותה דרך מסנן של 0.20 מיקרון. העבירו מספיק תמיסת טריפסין מסוננת לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו את הקולגן הידרוג'ל לצינור החרוטי המכיל את תמיסת האנזים.
וודאו כי ההידרוג'ל מכוסה לחלוטין בתמיסה. אטמו את הצינור עם פרפילם, ומערבלו אותו בעדינות במשך כדקה. לאחר מכן, דגרו את הצינור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ותנו לעיכול להימשך 15 עד 24 שעות.
בארבע השעות הראשונות, הוציאו את הצינורית כל 15 עד 30 דקות וסובבו אותה בעדינות כדי לעזור להשלים את עיכול הגומי של BSA. למחרת, העיכול נחשב למושלם כאשר לא צף גומי בתמיסה או שאין חתיכות מפורקות של הגומי בהידרוג'ל. כעת, החלף את תמיסת הטריפסין בתמיסת מוסקונאס סטרילית, ותן לצינור לרעוד בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
מאוחר יותר, שאפו את תמיסת Mosconas וחזרו על שלב זה פעמיים נוספות כדי לנקות לחלוטין את פיגום הקולגן. מספר רב של בדיקות שימשו לייעול השימוש בביו-גומי ותוארו בפירוט בפרוטוקול הטקסט. באמצעות הפרוטוקול האופטימלי ושלוש חתיכות תבנית מוצקות, יוצרו הידרוג'לים של קולגן ונבדקו בפירוט.
תבנית ה-Y הדרושה נוצרה במכונת מיקרולוציה. לתבנית Y הוזרק 30% BSA ושלושה אחוז גלוטרלדהיד, שהגיב בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, גומי ה-BSA נוצק עם הקולגן וחומם ל-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
הגומי עוכל על ידי אנזים במשך 15 שעות, מה שהחליש אותו עד כדי נפילה מבלי להשפיע על הגיאומטריה של הקולגן הידרוג'ל. תעלת הזרימה של ארבעה מילימטר שיוצקת על ידי התבנית נמדדה בקליפרים לארבעה מילימטרים בדיוק בהידרוג'ל הקולגן. בבדיקת יציבות התבנית, נמצא כי ניתן להנדס באופן אמין מידות קטנות עד 300 מיקרון.
בנוסף, הפיגומים נבדקו לשאריות גלוטראלדהיד לאחר שטיפת המוסקונס, ולא נמצאו שאריות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר פיגומי קולגן תלת מימדיים עם פוטנציאל לחקות גיאומטריות in-vivo. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות המשלימות טכניקה זו, כגון יצירת מודלים תלת מימדיים של רקמות in-vivo וייצור תבניות בעלות מאפיינים אדריכליים ספציפיים כדי לענות על שאלות נוספות.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור את האינטראקציה בין מאפיינים ארכיטקטוניים פנימיים ורכיבי מטריצה עם תאים במודלים במבחנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקת ביו-פבריקציה חדשנית להנדסה של פיגומים תלת-ממדיים מקולגן, המדמים את המאפיינים הארכיטקטוניים והתכונות המכניות של רקמה in vivo. השיטה עושה שימוש בחומר הקרבה שפותח לאחרונה, גומי BSA, כדי לשחזר במדויק את המיקרו-גאומטריה של רקמות שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת רקמות
- בייו-פבריקציה
- פיתוח פיגומים
רקע
- המחקר נותן מענה לצורך במודלים של רקמות ריאליסטיים לצורכי מחקר.
- הוא בוחן את האינטראקציות בין תאים ל-ECM ואת חשיבותן ברקמות מהונדסות.
- הטכניקה שואפת לשפר את רמת הדיוק והנאמנות של תחליפי רקמות.
- שמירה על סטריליות ואחסון נאות של החומרים חיונית להצלחת התהליך.
מטרת המחקר
- להנדס פיגומים הדומים באופן הדוק לרקמה in vivo.
- לחקור את השפעתן של תכונות ארכיטקטוניות על הנדסת רקמות.
- לפתח שיטה מהימנה ליצירת פיגומים biodegradable.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של גומי BSA תחת תנאים מבוקרים.
- שימוש בחומר הקרבה להעברה מפורטת של מאפיינים מרחביים.
- הדגמה של הפרוטוקול על ידי עמית פוסט-דוקטורט מיומן.
- הבטחת סטריליות ואחסון נאות של החומרים.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה משחזרת בהצלחה את המיקרו-גיאומטריה של רקמות.
- הושגה רמת דיוק גבוהה ביצירת תעלות זרימה פנימיות.
- התוצאות מעידות על יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות ובהחלפת רקמות.
- הוכח כי טיפול נכון בחומרים הוא מרכיב חשוב בתהליך.
מסקנות
- שיטה זו מציעה גישה מעשית להתמודדות עם אתגרי הנדסת רקמות.
- היא משפרת את ההבנה של אינטראקציות ה-ECM ברקמות מהונדסות.
- הממצאים עשויים להוביל להתקדמות בטכנולוגיות להחלפת רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
טכניקת ביו-פבריקציה זו מאפשרת שכפול מדויק של מיקרו-ארכיטקטורת רקמות בתוך הידרוג'לים של קולגן, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בדיוק של מודלים פרה-קליניים. באמצעות אספקת שיטה ניתנת להרחבה להנדסת תעלים מוגדרים בקנה מידה מיקרוסקופי ומקרוסקופי, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בפיתוח טיפולים המכוונים לרקמות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בהערכת אינטראקציות בין תרופות לרקמות בתוך סביבות תלת-ממדיות רלוונטיות פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר לבחון כיצד מאפיינים ארכיטקטוניים משפיעים על אינטראקציות בין ה-ECM לתאים ועל הפעלת מסלולים במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: מספק גאומטריות של פיגומים הניתנות לשחזור עבור בדיקות תיקוף של מטרות באופן עקבי בין סדרות ניסויים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: יצירת פיגומים (scaffolds) סטנדרטיים של קולגן עם ממדי תעלות מדידים לסריקת תרכובות מהימנה בסביבות ביומימטיות.
- ערך תפעולי: תמיכה בסטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות יציקה עם תבנית מקריבה (sacrificial molding), להפחתת השונות במודלים של רקמה דמויי מיקרופלואידיקה.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- ערך מדעי: מקל על חקר תופעות של פרפוזיה והובלה בפיגומים המדמים ארכיטקטורה של רקמות in vivo, ובכך משפר את הרלוונטיות של סמנים ביולוגיים (biomarkers) בתהליך התרגום הקליני.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף פרה-קליני באמצעות יצירת פיגומים בעלי גיאומטריות מוגדרות המתאימות למחקרי הבשלה ארוכים של רקמות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים באמצעות אספקת פיגומים מתכלים וככלים הניתנים לכיוונון, המגשרים בין מודלים פשוטים בדו-מימד (2D) לבין אורגנואידים מורכבים, ובכך תומכים בתיקוף מטרות מבוסס היפותזה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לבדיקה מבוקרת של האופן שבו ארכיטקטורת הפיגום משפיעה על תגובות תאיות למועמדים טיפוליים.
- סריקה: מספקת הידרוגלים הניתנים לשחזור ומוגדרים ארכיטקטונית להערכה כמותית של חדירת תרכובות ומעורבות מטרה.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה מדויקת של ממדי התעלים (למשל, 3 mm ו-4 mm) ושל השלמות המבנית עד לרזולוציה של 300 microns, ובכך מספקת קריאות מורפומטריות אובייקטיביות.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם רציפות פרה-קלינית על ידי יצירת פיגומים שניתן להקרין את מאפייניהם הארכיטקטוניים לתוצאות תפקודיות של רקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת פלטפורמה ליצירת חיקויי רקמה סטנדרטיים במגוון פרויקטים באמצעות תבניות שתוכננו ב-CAD ויציקת גומי מסוג BSA.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במודלים של הנדסת רקמות על ידי בידוד משתנים ארכיטקטוניים במחקרי איתות של ECM-cell.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות ייצור סטנדרטי של גומי BSA והסרה אנזימטית, ובכך ממזער שונות בין סדרות ייצור.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go באמצעות אספקת נתונים מפיגומים המשחזרים טוב יותר את מגבלות הרקמה in vivo על התפלגות תרופות והתנהגות תאים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרופיהים מותאם סיכון, בהתבסס על ביצועים במערכות מוגדרות ארכיטקטונית ורלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחומרי ביו-מטריאל, בטכניקה סטרילית ובאופטימיזציה של עיכול אנזימטי.
- תלוי בגישה לתוכנת CAD, לציוד יציקה מדויק (למשל, Microlution) ולמערכות דגירה/קישור צולב מבוקרות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תכנון התבניות, הכנת גומי BSA ופרוטוקולי הידרוג'ל קולגנ למטרת הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת הטכניקה לריכוזי קולגן שונים או לפולימרים טבעיים חלופיים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך באחסון קר של חומרי מוצא לגומי BSA וזמני עיכול ממושכים (15–24 שעות) להסרה מלאה של החומר ההקרבתי.
