Name: הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למדו עריכת גנום בתאי גזע pluripotent אנושיים באמצעות CRISPR/Cas9 ו-TALENs. הפרוטוקול מדגים שילוב EGFP ועמידות לאנטיביוטיקה בלוקוס AAVS1 ליצירת מודלים מחלתיים מדויקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט זרע מוח קרן המחקר (BRFSG-2014-02) להלן Bateup. דירק Hockemeyer הוא חדש Scholar בהזדקנות של הקרן הרפואית אליסון ונתמך על ידי קרן גלן כמו גם Shurl וקיי קורצ&#39;י הקרן. DH נתמך גם על ידי NIH 1R01CA196884-01.

<ol><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+targetable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with targetable nucleases.</a> Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+zinc-finger+nuclease-induced+gene+targeting+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila.</a> Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>DeKelver, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics%2C+proteomics%2C+and+regulatory+DNA+analysis+in+isogenic+settings+using+zinc+finger+nuclease-driven+transgenesis+into+a+safe+harbor+locus+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome.</a> Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).</li>
<li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+the+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2Fcas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genomes+with+rare-cutting+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases.</a> Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZiFiT+%28zinc+finger+targeter%29%3A+An+updated+zinc+finger+engineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool.</a> Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).</li>
<li>Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+construction+and+in+vitro+testing+of+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), e82(2011).</li>
<li>Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Podhajska, A. J., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+the+FokI+endonuclease+to+a+universal+restriction+enzyme%3A+Cleavage+of+phage+M13mp7+DNA+at+predetermined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites.</a> Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).</li>
<li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation.</a> Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+viral+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors.</a> Cell. 136 (5), 964-977 (2009).</li>
<li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).</li>
<li>Chiba, K., Hockemeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+site-specific+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases.</a> Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+O2+tensions+and+the+prevention+of+differentiation+of+hES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).</li>
<li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).</li>
<li>Southern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Southern+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Southern blotting.</a> Nat Protoc. 1 (2), 518-525 (2006).</li>
<li>Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR%3A+Critical+parameters+and+step-by-step+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol.</a> BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Sexton, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+molecular+identification+of+three+human+TPP1+functions+in+telomerase+action%3A+Recruitment%2C+activation%2C+and+homeostasis+set+point+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation.</a> Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).</li>
<li>Merkle, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+generation+of+knockin+human+pluripotent+stem+cells+lacking+undesired+mutations+at+the+targeted+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus.</a> Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+parkinson+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li>
<li>Forster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+tissue+with+adult+stem+cell+properties+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+specificity+of+TALE-based+genome+editing+using+an+expanded+RVD+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire.</a> Nat Methods. , (2015).</li>
<li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Sci Rep. 4, 5400(2014).</li>
<li>Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244(2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה המוצגת כאן לבידוד אוכלוסיות הומוגניות של תאי pluripotent אדם בעריכת גן הגזע היא גישה רבת עוצמה ליצירת קווי hPSC isogenic השונה רק במוקד הממוקד. תאים אלה הם מערכת אידיאלית לחיטוט מנגנוני התמיינות תאים אנושי ופיתוח, כמו גם להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות monogenic בהגדרה גנטית בשליטה. כפי שהודגם כאן, אפשר להשתמש בשלוש אסטרטגיות עיצוב SSN עצמאיות (ZFNs, TALENs, וCRISPR / Cas9) כדי להשיג אינטגרציה ממוקדת במוקד AAVS1. לכל אחד משיטות אלו יתרונות משלה וחסרונות. יתרון פוטנציאלי של ZFNs ו, במידה מסוימת, TALENs הוא הגמישות בעיצוב שלהם, המאפשר הנדסת איטרטיבי כדי לשפר את ה- DNA מחייב תחומים של nucleases פרט 42. אופטימיזציה nuclease זה יכול להגדיל את הספציפיות של ZFNs וTALENs מעבר למה שהוא בר השגה עם CRIמערכת SPR / Cas9. סלקטיביות כזו עשויה להיות חשובה עבור יישומים קליניים הדורשים רמה גבוהה של היעד ספציפי. היתרון העיקרי של המערכת / Cas9 CRISPR הוא קלות שימוש. למרות ערכות בניית Talen וZFN נעשו זמינות לציבור (כלומר, דרך Addgene 21), CRISPR SSNs / מבוסס Cas9 קל יותר באופן משמעותי לבנייה, כהתאמה ההכרחית היחידה הוא oligonucleotide זוג 20 בסיס (בעת השימוש בפלסמיד px330 עיצוב 14). פשטות זה מוכיחה להיות יתרון עבור מעבדות מחקר מחפשים כולל עריכת הגנום בלימודיהם. קיימות טכניקות transfection חלופיות, כוללים nucleofection 43, כדי ליצור קווי hPSC-גן בעריכה; עם זאת electroporation הוכח להיות יעילים 4,5,25 עקביים ועלות. Nucleofection יכול לשמש כדי transfect ישירות מתחמי ribonucleoprotein RNA Cas9-מדריך לגרעין, הגדלת יעילות SSNנאמנות ד 44. גידול hPSCs על MEFs הוא שיטה חזקה ולא יקרה כדי לשמור על hPSCs במדינת pluripotent ללא הבחנה מוגזמת. בנוסף, היא מאפשרת לבידוד קל של מושבות זהות מבחינה גנטית. לחלופין, ניתן hPSCs התרבות ללא MEFs, אולם תנאי התרבות אלה יכולים להיות יקרים יותר מתרבויות מבוססות מזין. יתר על כן, כל התהליך הוא מדרגי, המאפשר לבידוד של אירועי עריכה מאוד נדירים או הדור של שורות תאים שונות רבות בניסויי עריכה מקבילים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא חזק; עם זאת יש כמה שלבים עיקריים המשפיעים על היעילות שבה ניתן להשיג שיבוטים נערכו כראוי. המרכיב הקריטי ביותר לשיטה זו הוא שיש MEFs באיכות גבוהה וMEFs DR4 עמיד סמים. ההישרדות של hPSCs היחיד היא קלושה, וMEFs באיכות נמוכה יהיה לעכב את הבידוד של קווי hPSC מובחנים. שנית, השימוש של Y-27632 הוא גםמפתח להישרדות לאפשר תא בודד מבלי ליצור לחץ סלקטיבי לתאים עם קריוטיפ לא נורמלי 45. שלישית, לקטוף מושבות היטב במרווחים מבטיח הומוגניות גנטית של שורות תאים נגזרו. לבסוף, חשוב להכין טפטפות זכוכית, כך שהפתיחה היא קטנה מספיק כדי לשבור את המושבה לרבות חתיכות קטנות יותר, להבטיח כי מושבות מרובות תגדל בבאר החדשה. זה מאפשר הקטיף של subclones היטב במרווחים לצלחת העתק שיש בתרבות, שעזבה את הצלחת המקורית של מושבות מבודדות לgenotyping. חלק מאתגר בפרוטוקול זה הוא המדריך למשייכת טפטפות הזכוכית; זה צריך להיות מתורגל מראש. יש לציין שישנן טכניקות רבות של קטיף שיבוט שאינו דורשות פיפטה זכוכית. הנסיינים מוזמנים למצוא אחד שעובד הכי טוב בשבילם. יש מגבלות לפרוטוקול זה, שניתן להתגבר על ידי שינויים פשוטים. ניסוי נועד only לשבש את המוקד של עניין ללא תיקון או אחד תיקון שתבנית אינו מכיל קלטת בחירה, חייב להשתמש בשיטה אחרת של העשרה לתאים שנערכו. שים לב שמספר מושבות שחייבות להיות נטלו למצוא שיבוט חיובי מגביר באופן משמעותי בהיעדר הבחירה. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את היעילות היא לשתף transfect פלסמיד שאינו שילוב שמבטא חלבון פלואורסצנטי. לאחר מאפשר לתאים להתאושש במשך יומיים, ניתן למיין תאים ממוקדים על הקרינה חיובית באמצעות מיון תא הקרינה המופעל וreplated 29. תהליך זה מעשיר את תאים שכבר transfected עם פלסמידים ידי electroporation ובכך מגדיל את ההסתברות לאירוע עריכה במקביל בתא. הטכניקות המתוארות כאן ניתן להרחיב להשתמש RNAs מדריך מרובה למקד כמה 14,46,47 לוקוסים בו זמנית. פרוטוקולים רבים הוקמו כדי לבדל hPSCsלסוגים שונים של תאים, ומאפשר מניפולציות גנטיות שונות בסוגי תאים של עניין 30. בסך הכל, יש לנו הפגנו הפוטנציאל לעריכת הגנום יעיל בhPSCs ללא קשר לבחירת SSN. אנו מציעים כי טכניקה זו יכולה להיות מותאמת ליצירת קווי hPSC isogenic שנערכו-גן בכל מוקד הגנומי.

טכנולוגיות עריכת הגנום במהירות מתפתחות לכלים סטנדרטיים לביולוגיה מולקולרית של תא 1. הנדסה גנטית של תאים האנושיים pluripotent גזע (hPSCs) היא עניין מיוחד כhPSCs מהווה מקור עצמי חידוש של תאים אנושיים עיקריים הגנטית בשלמותה. יכול להיות מובחן hPSCs לסוגי תאים שונים למידול מחלה או כמקור לטיפולי השתלה 2,3. הפגין כאן הוא פרוטוקול שמנצל שלושה סוגים שונים של nucleases אתר ספציפי (SSNs) בשיתוף עם מנגנוני תיקון DNA אנדוגני לשילוב ממוקד של מבנה כתב במוקד AAVS1. לאחר transfection של SSNs לhPSCs, אנו מדגימים כיצד לבודד אוכלוסיות תאי isogenic מחסה הכתב. היכולת לתפעל את הגנום, במיוחד pluripotent גזע הגנום של תאים, SSNs באמצעות אינה תופעה חדשה ככלי של nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וactivat השעתוקnucleases כמו-או מפעיל (TALENs) לעריכת גן הודגם לפני כמה שנות 4-10. עם זאת, עם כניסתו של CRISPR pyogenes ס / טכנולוגית Cas9 11-13, עריכת הגן הפכה לנגישה 14 נרחב. כל SSNs להציג הפסקת DNA גדילים כפולה (DSB) באתר היעד שצוין 1,4,5,11 שתוקן על ידי מנגנונים תאיים אנדוגני או באמצעות תיקון שאינו הומולוגי (NHEJ) מכוון שהצטרף סוף או הומולוגיה (HDR) 15. NHEJ הוא מועדת לטעויות ויכול להציג את מוטציות שינוי מסגרת ותוצאה הוא אובדן של תפקוד גן, בעוד HDR מאפשר להיות הציגו אלמנטי רומן דרך שיתוף transfection של תבנית תיקון עם SSN. בעוד עקרונות היסוד של תיקון DNA המאפשרים עריכת גן נחשבים במידה רבה את אותו הדבר עבור כל SSN, כמה הבדלים בין הפלטפורמות ניתן לציין. דה נובו עיצוב של ZFNs מאפשר גמישות וnuclease אופטימיזציה 16, עם זאת שימוש בבפומביספריות זמינות הרכבה וכלים הקרנה לעצב ZFNs פרט יכולים להיות זמן רב. ברגע שהמוקד הרצוי למיקוד בתיווך ZFN נקבע, יכולים להיות מתוכננים זוגות ZFN עם הכלי המקוון ZiFit 17. לאחר עיצוב, ZFNs ניתן להרכיב באופן מודולארי דרך כמה סיבובים של שיבוט פלסמיד 18. לחלופין, יש ZFNs רב זמין מסחרי,-תוקף לפני 19. nucleases האגדה גם יכול להיות מתוכנן תוך שימוש בכלים מקוונים ורכיבים זמינים בפומבי 17,20. לדוגמא, TALENs ניתן להרכיב במהירות מלוקים של חמש חזרות סיפור, דרך ההרכבה FLASH 21 או באמצעות PCR הרכבה שער זהב היררכי מבוסס 22. קלות עיצוב SSN ומהירות של הבנייה באמצעות CRISPR / Cas9 עשו הגנום עריכת כלי נגיש לציבור רחב. המיקוד בתיווך RNA מדריך הקצר של CRISPR / Cas9 גם מאפשר ריבוב של RNAs המדריך למקד כמה לוקוסים עם מבנה יחיד 14. העיצובשל Cas9 לעריכת גן דורש רק זיהוי של מוטיב protospacer סמוך (PAM; trinucleotide NGG לס pyrogenes Cas9) הפרוקסימלי למוקד היעד. על ידי הוספת oligonucleotide המתאים עד 20 הזוגות הבסיסים 5 &#39;של PAM לפלסמיד px330 14, המבנה ניתן להרכיב בצעד שיבוט אחד. בנוסף לס pyogenes Cas9, Cas9 מנ meningitidis (NmCas9) שמכיר 5&#39;-NNNNGATT-3 &quot;(PAM) הוכח כדי לאפשר לגן-עריכה יעילה בhPSCs 23. בנוסף להבדלים בקלות עיצוב SSN, לכל פלטפורמה מאפיינים ספציפיים. לדוגמא, ZFNs וTALENs לנצל תחום nuclease FokI, אשר מייצר 5 הסככה ארבעה נוקליאוטידים &#39;24 בזמן שהוא חשב Cas9 לייצר בעיקר להקהות DSBs הסתיימה. ZFNs, TALENs, וCas9 שונה בstabilities החלבון שלהם, שיעור ב- off על DNA היעד, ומצב של סריקת ה- DNA, שכולן גולד באופן תיאורטי לגרום להבדלים קטנים בתוצאת 1 העריכה. בעוד שמחקרים נוספים יידרשו כדי להבין את ההשלכות של הבדלים אלה, אנו מתארים כאן פרוטוקול כי הוא חזק מאוד בכל שלוש פלטפורמות וניתן להשתמש בו כדי ליצור בקלות hPSCs המהונדסת גנטי. ללא קשר לבחירת SSN, electroporation הוא הליך חזק כדי transfect SSNs ותבניות תיקון ההומולוגיה לhPSCs 25. מספר שרד מושבות לאחר בחירה לעמידות לאנטיביוטיקה תלויה בפרמטרי מוקד ספציפי ואסטרטגית העריכה (למשל, גודל של הכנס ומצב של בחירה מהונדס). הפרוטוקול המתואר כאן בדרך כלל תוצאות בכ 150-400 מושבות תא בודד נגזרות. במוקד AAVS1 באמצעות פרוטוקול זה עריכה-הגן כבר בעבר בשימוש כדי להדגים את היעילות של SSNs 4,5. תבנית תיקון AAV-CAGGS-EGFP משתמשת str מלכודת גןategy להקנות עמידות לpuromycin באופן ספציפי מוקד. בקצרה, תבנית התיקון מכילה אתר acceptor אחוי במעלה הזרם של קלטת התנגדות puromycin promoterless. עם שילוב נכון לאינטרון הראשון של גן PPP1R12C במוקד AAVS1, קלטת ההתנגדות באה לידי ביטוי מאמרגנו של הגן בעריכה. החוסן של assay AAVS1 הספציפי הזה מאפשר לנו להשוות את היעילות של כל פלטפורמת SSN. עריכת גן באמצעות SSNs היא חזקה נתנה את היכולת לשבש ו / או לשנות באופן תיאורטי כל גן. יישום אסטרטגיה זו לhPSCs מספק צדדיות כhPSCs יכול להיות מובחן בהמשך למספר רב של סוגי תאים אנושיים כגון נוירונים 26, hepatocytes 27, ושריר לב 28. בנוסף, השימוש בתאי גזע pluripotent מושרה נגזר מטופל מאפשר תיקון או הקדמה של מוטציות הגורמות למחלות ידועות ברקע גנטי מטופל ספציפי 29 </sup&gt;, מספק פלטפורמה שממנו ניתן לחקור מנגנוני מחלה ותרופות מבחן שימוש בתאים של חולה 30. לסיכום, עריכת הגן בhPSCs היא גישה יעילה ותכליתית לחקירת הביולוגיה הבסיסית של פיתוח ומחלה 31 בני אדם.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים - Basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 12 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gene pulser II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&times; תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) pH7.4&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר, מחוברות</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 מ"ל Cryotubes</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

הגנום עריכה של תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) מספקת פלטפורמה גנטית מבוקרת ורלוונטית מבחינה קלינית שממנו ניתן להבין את התפתחות אדם ולחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלה. על ידי שימוש בnucleases אתר ספציפי (SSNs) לעריכת הגנום, הגזירה המהירה של קווים החדשים hPSC מחסה שינויים גנטיים ספציפיים בהגדרה אחרת isogenic הופכת אפשרית. אצבע האבץ nucleases (ZFNs), nucleases שעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs) וחוזר palindromic הקצר interspaced באופן קבוע התקבצו (CRISPR) / Cas9 הם SSNs הנפוץ ביותר. כל nucleases אלה לתפקד על ידי החדרת DNA הפסקת פעמיים תקועה באתר שצוין, ובכך לקדם עריכת גן מדויקת במוקד הגנומי. עריכת הגנום מדיטציה-SSN מנצלת שני מנגנונים של התא אנדוגני תיקון DNA, הסוף שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR), או להציג הכנסה / מוטציות מחיקה או altאה הגנום באמצעות תבנית תיקון הומולוגית באתר של הפסקת גדילים הכפולה. Electroporation של hPSCs הוא אמצעי יעיל של transfecting SSNs ותבניות תיקון המשלבים transgenes כגון כתבי ניאון וקלטות עמידות לאנטיביוטיקה. לאחר electroporation, אפשר לבודד רק את אלה ששולב hPSCs מבנה התיקון על ידי בחירה לעמידות לאנטיביוטיקה. מכאני הפרדת מושבות hPSC ומאשר שילוב ראוי באתר היעד דרך genotyping מאפשרת הבידוד של שורות תאים בצורה נכונה וממוקדות גנטיים הומוגני. תוקפו של פרוטוקול זה בא לידי הביטוי כאן על ידי שימוש בכל שלוש פלטפורמות SSN לשלב EGFP והתנגדות puromycin לבנות למוקד הנמל הבטוח AAVS1 בתאי גזע pluripotent אנושיים.

כאן אנו מדגימים פרוטוקול תואם עם שלוש פלטפורמות SSN שונות כדי ליצור קווי hPSC מהונדסים גנטי. אנו ממוקדים # WIBR 3 תאי גזע עובריים אנושיים במוקד AAVS1 באמצעות ZFNs שפורסם בעבר 4, 5 וTALENs CRISPR / Cas9s 37 באמצעות תבנית תיקון שמציגה כתב EGFP וקלטת התנגדות puromycin 4. אנו תרבית hPSCs על MEFs לעבודת תרבית תאים המאפשרת תחזוקה והרחבת hPSCs מובחן (איור 2), שהוא גם חסכוני וניתן להרחבה. אם תאים גדלים יותר מהנחוץ קיים סיכון המוגבר של בידול, צמצום מספר תאי pluripotent כי הם transfected וכתוצאה מכך מספר מושבות hPSC ממוקדות בצורה נכונה שהושגו. אנו electropצטט 5.0 x 10 6 תאים לכל פלטפורמת SSN ומצופה בתאים מכל מיקוד על אחד צלחת גם 6 של MEFs DR4. לאחר בחירה, כל פלטפורמה הביאה מושבות EGFP-חיובי (איור 3) ושילוב של שיבוטים לא ממוקדים, ממוקדים homozygously וממוקד heterozygously (איור 4 א &#39;, ב&#39;; טבלה 3). בתנאים שהוצגו כאן, אנו מוצאים כי TALENs AAVS1 הביא השיבוטים EGFP החיוביים ביותר. התבנית המשמשת לתיקון ניסוי זה מורכב מאתר acceptor אחוי במעלה הזרם של קלטת הכתב והתנגדות puromycin EGFP. באמצעות אסטרטגיה זו &quot;גן-מלכודת&quot; (איור 1), המבנה צריך להכניס לתוך אינטרון הראשון של מוקד AAVS1, באמצעות אמרגן אנדוגני לנהוג ביטוי של קלטת puromycin ההתנגדות. חוסר אמרגן נהיגה הביטוי של גן התנגדות puromycin בתוך תבנית התיקון צריך למנוע ביטוי ב<html> מקרה של שילוב אקראי. לכן, אנו מצפים שכל השיבוטים puromycin עמיד יהיו ממוקדים באתר AAVS1. יש לציין כי קבוצת משנה של שיבוטים לבצע אינטגרציות חריגות במוקד AAVS1 שלזיהוי על ידי כתם דרום באמצעות בדיקה פנימית, אך לא על ידי רוב אסטרטגיות PCR (איור 1; איור 4C) 4. אירועי אינטגרציה אלה הם ככל הנראה התוצאה של אירועים שהובילו למיקוד Heterologous אינטגרציות מרובות של פלסמיד התורם 4. אספנו 24 מושבות מכל ניסוי SSN ומצאתי כי כל פלטפורמות יעילות מיקוד גבוהה מאוד והראו הבדלים מזעריים בלבד. כנחקר על ידי ה- PCR, CRISPR / Cas9 הניב שיבוטים הממוקדים ביותר בצורה הנכונה ואילו פלטפורמת Talen השיבוטים הממוקדים ביותר homozygously (לוח 3). &quot;Width =&quot; 700 /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;/&gt; סכמטי באיור 1. של הגן ערך מוקד AAVS1 באמצעות תבנית תיקון AAV-CAGGS-EGFP. השתנה מHockemeyer et al., 2009. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> 2. מושבות איור של # 3 תאי WIBR. נציג תמונות בהירות שדה של מושבות של # WIBR 3 תאי גזע עובריים אנושיים לפני המיקוד. שים לב לחוסר הבחנה וההפרדה ברורה משיכבת המזין במושבה אידיאלית (משמאל), בניגוד לאחד שאינו אידיאלי (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> איור 3. # WIBR EGFP חיובי 3 תאים. נציג תמונות של # WIBR 3 תאים ממוקדים עם תבנית תיקון להביע EGFP במוקד AAVS1. תמונות של מושבות נציג נערכו עם ZFNs, TALENs וCRISPR / Cas9 מוצגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> אסטרטגיות Genotyping איור 4. כדי לאשר מיקוד נכון. () תוצאות genotyping הנציג PCR מראים שיבוטים ממוקדים ממוקדים, הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים על פני שלוש פלטפורמות SSN. WT CTL = שליטת wild-type. Repre (ב)תוצאות sentative דרום הכתם מראים שיבוט הטרוזיגוטיים ממוקדת ושיבוט הומוזיגוטים ממוקד מזוהה עם בדיקה החיצונית &#39;3. גדלים שבר: WT-6.5 KB, בעריכת-6.9 kb. (ג) תוצאות כתם דרום נציג מראים שיבוט נערך כראוי ושיבוט הטרוזיגוטיים עם דאבל-אינטגרציה אינה אקראית. גדלים שבר:. עריכה-6.9 כראוי kb, kb אינטגרציה-5 נוסף הסוטה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לימוד </td><td> גן ממוקד </td><td> פּלַטפוֹרמָה </td><td> סוג תבנית תיקון </td><td> # של שיבוטים הרים </td><td> יעילות מיקוד </td></tr><tr><td> סקסטון et al., 2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </tד&gt; <td> לא דווח </td><td> לא דווח </td></tr><tr><td> סקסטון et al., 2014 </td><td> טרט </td><td> ZFN </td><td> Hygromycin </td><td> לא דווח </td><td> לא דווח </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 31 </td><td> 39.0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> PITX3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 74 </td><td> 14.9% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2011 </td><td> POU5F1 </td><td> Talen </td><td> GFP-Puro </td><td> 68 </td><td> 91.0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2011 </td><td> PITX3 </td><td> Talen </td><td> GFP-Puro </td><td> 96 </td><td> 13.0% </td></tr><tr><td> מרקל et al., 2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td> כתב-Geneticin </td><td> 139 </td><td> 94.0% </td></tr><tr><td> מרקל et al. &lt;/ Em&gt; 2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td> כתב-Geneticin </td><td> 30 </td><td> 93.0% </td></tr><tr><td> מרקל et al., 2015 </td><td> HCRT </td><td> Cas9 </td><td> כתב-Geneticin </td><td> 154 </td><td> 92.0% </td></tr><tr><td> מרקל et al., 2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td> כתב-Geneticin </td><td> 11 </td><td> 45.0% </td></tr><tr><td> פורסטר et al., 2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> לא דווח </td><td> 30.0% </td></tr><tr><td> פורסטר et al., 2014 </td><td> LRG5-Cterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> לא דווח </td><td> 14.0% </td></tr><tr><td> Soldner et al., 2011 </td><td> סנכ&quot;א </td><td> ZFN </td><td> Puro </td><td> 96 </td><td> 1.0% </td></tr></tbody></table> טבלת 1. תיאור של גנים אחרים ממוקד בשיטה זו, עם קורsponding מיקוד יעילות נלקחה ממחקרים שפורסמו בעבר. 4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לוקוס </td><td> סדר פעולות </td><td> הערות </td></tr><tr><td> פריימר AAVS1-F </td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> תנאי PCR: T מ &#39;= 57 מעלות צלזיוס, 35 מחזורים </td></tr><tr><td> פריימר AAVS1-WT-R </td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> להקת WT: 1,273 נקודות בסיס </td></tr><tr><td> AAVS1 ממוקד-R פריימר </td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td> להקה ממוקדת: 992 נ&quot;ב </td></tr><tr><td> T2-Cas9-מדריך </td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td> ממאלי et al., 2013 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN ימני </td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> מHockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-שמאל </td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> מHockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-Talen ימני </td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> מHockemeyer et al., 2011 </td></tr><tr><td> AAVS1-Talen-שמאל </td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> מHockemeyer et al., 2011 </td></tr></tbody></table> רשימת 2. טבלה של פריימרים ורצפי מיקוד SSN. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מיקוד לבנות </td><td> מספר EGFP + המושבות </td><td> ממוקד שיבוטים הרימו (PCR מאומת) </td><td> יעיל קודם מדווח תיקון מיקוד (על ידי כתם דרום) </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> 86.9% (73.9% Het / 13.0% הומו) </td><td> 56% (50% Het / 6% הומו) </td></tr><tr><td> Talen </td><td> 412 </td><td> 91.3% (47.8% Het / 39.1% הומו) </td><td> 47% (Het 37.5% / 9.3% הומו) </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> 95.7% (69.5% Het / 26.3% הומו) </td><td> לא דווח </td></tr></tbody></table> 3. מספרים השוואתיים השולחן של EGFP חיובי וממוקד Talen, ZFN וCRISPR / מושבות תאי גזע אנושיות Cas9. PCR אומת אינטגרציות במוקד AAVS1 לניסוי זה הם בהשוואה לכתם דרום מאומת אינטגרציות יחידים נכונים בניסויים קודמים 4,5.

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להנדס גנטית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות טכנולוגיה מודרנית לעריכה גנומית. למרות שפרוצדורה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה של תאי גזע, ניתן ליישמה גם כדי להקל על מידול מחלות אנושיות במסגרת מוגדרת גנטית. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יצטרכו להתנסות בבידוד מושבות לפני שיהפכו למיומנים בה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא חיונית כיוון שזיהוי ובחירה של מושבות עלולים להיות קשים. התחילו בתרבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) במצע hESC בלוח של שישה בארות המכיל פיברובלסטים עובריים של עכבר שנוטרלו באמצעות mitomycin C, או תאי מאכיל MEF הגדלים על ג'לטין. בכל יום עוקב לאחר הזריעה, עד שה-hPSCs מגיעים ל-50%confluency, השתמשו בפיפטת זכוכית ובואקום כדי להסיר את כל נפח המצע.החליפו לשלושה מיליליטרים של מצע hESC חם לכל באר. יום אחד לפני היעד, הסירו את מצע ה-hESC והוסיפו מצע hESC טרי שחומם מראש ותומת ב-10 micromolar Y-27632. כמו כן, הכינו אחת עד שתיים פלטות של שש בארות עם תאי מאכילה מסוג MEF עמידים לתרופות מעכברי DR4.ביום התargeting, הכינו את תמיסות הטרנספקציה על ידי פיפוט של 5 µg של פלסמיד ביטוי Zinc finger nuclease 1 ו-2, פלסמיד ביטוי TALON 1 ו-2, או 15 µg של פלסמיד המקודד ל-CRISPR cas9 px330 לתוך מבחנה של 1.5 mL. הוסיפו 30 µg של פלסמיד תורם מתוקן, ולאחר מכן כמות מספקת של 1x phosphate buffered saline להבאת הנפח ל-300 µL. בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא 50% confluency.לאחר מכן, השתמשו בפיפטה מזכוכית ובואקום כדי להסיר את המצע מלוח ה-hPFCs, ולאחר מכן שטפו את התאים עם 2 milliliters של 1x PBS חם. לאחר שאיבת ה-PBS, הוסיפו 0.5 milliliters של תמיסת 0.25%Trypsin-EDTA ישירות על התאים. מקמו את הלוח באינקובטור לתרביות רקמה למשך כ-10 דקות, או עד ששכבת התמיכה (feeder layer) תתחיל להיפרד מהלוח.בעקבות הדגירה, הוסף שני מיליליטר של תמיסת שטיפה ES חמה לכל באר כדי לעצור את תגובת ה-Trypsin. אסוף את התאים מכל באר, תוך וידוא שתאי המזינים (feeder cells) נפרדים כיחידה אחת. העבר באמצעות פיפטה את התוכן של כל באר לשפופרת קונית אחת של 50 מיליליטר, תוך איחוד כל הבארים, ובצע טריטורציה לתאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר.הוסיפו מדיום שטיפה של ES כדי להביא את תרחיף התאים לנפח של 40 milliliters. המתינו דקה עד שתי דקות כדי לאפשר לגושי תאי מאכילה (feeder) גדולים לשקוע לתחתית המבחנה, לאחר מכן הסירו את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פיפט סרולוגית, והעבירו אותו למבחנה קונית נקייה של 50 milliliter. לאחר צנטריפוגציה של תרחיף התאים למשך חמש דקות במהירות של 190 ×g, שאבו את הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע התאים (cell palette).יש להשעות את התאים ב-500 µL של 1x pbs. ערבבו את התאים שהושעו עם תמיסת הטרנספקציה של הפלסמה שהוכנה קודם לכן. העבירו באמצעות פיפט את התאים ותערובת הטרנספקציה לקובטת אלקטרופורציה של 4 mm, והניחו על קרח למשך שלוש עד חמש דקות.הגדירו את הפרמטרים עבור התוכנית האקספוננציאלית (exponential) במערכת האלקטרופורציה ל-250 volts, 500 microfarads, התנגדות אינסופית, וגודל קובטה של ארבעה מילימטרים. בצעו אלקטרופורציה לתאים, ולאחר מכן החזירו את הקובטה לקרח למשך שלוש דקות. השביו את התאים שעברו אלקטרופורציה ב-18 milliliters של מצע hESC חמים, בתוספת של 10 micromolar Y-27632.בחנו את ה-DR4 MEFs תחת מיקרוסקופ. העבירו שלושה מיליליטר של תרחיף התאים הבודדים לכל באער של פלטת שש באערים המכילה תאי מזינים (feeder cells) מסוג DR4, והחזירו לאינקובטור. ביום השלישי לאחר הזריעה, החליפו את המצע במצע hESC ללא Y-27632.ביום הרביעי, החליפו את המצע ללא התוספים במצע המכיל את האנטיביוטיקה הסלקטיבית המתאימה. במקרה זה נעשה שימוש ב-Puromycin. ביום שלפני בחירת המושבות, הכינו פלטת 12 בארות של תאי מזיני MEF עבור כל מושבה שייבחרו.ביום ה-12 לאחר הזריעה, בחנו את הצלחת תחת מיקרוסקופ דיסקציה. זהו מושבות בעלות קוטר של 800 עד 1,200 מיקרון שמוכנות לברירה. ודאו שמושבות אלו אינן מכילות תאים המתחילים להבדיל (differentiate), כגון התא המוצג כאן.בנוסף, ודאו שהתאים מביעים GFP. ביום הבחירה, בחנו את ה-MEFs תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם בריאים. הסירו את כל המצע מהצלחות תאי ההזנה של ה-MEF, והחליפוהו ב-1 mL של מצע hESC.בנוסף, החליפו את מצע ה-hESC בצלחות ה-hPSC בעלות שש בארות שמהן ייבחרו המושבות. לאחר מכן, הכינו פיפטות זכוכית לבחירת המושבות. כדי לבחור מושבות, הניחו תחילה את צלחות ה-hPFCs על הבמה של מיקרוסקופ הדיסקציה בתוך מנדף תרביות הרקמה, והרכיבו את מכשיר הבחירה על ידי הכנסת קצה פיפטת הזכוכית לתוך נורת השאיבה.זהו את המושבה שברצונכם לדגום, והניחו את קצה פיפטת הזכוכית הממשוכת מעל המושבה. לאחר מכן, לחצו על נורת מכשיר הדגימה כדי לחתוך בעדינות מושבה בודדת ל-10 עד 20 חלקים שווים בגודלם. לבסוף, שאבו את חלקי המושבה שנתוךו אל תוך הפיפטה על ידי שחרור הנורת.נסה לשאוב מעט ככל האפשר מהמצע במהלך ההעברה. לחץ על הנבובת כדי להעביר את המושבה המפוצלת כעת ישירות לאחת הבארים בלוח 12-בארים של תאי מאכיל MEF. סמן כל באר כדי לאפשר זיהוי ייחודי של שיבוטים שנגזרו מתא בודד.החליפו את פיפטת הזכוכית וחזרו על הפרוצדורה עבור המושבה הבאה. החזירו את הצלחות לאינקובטור, ונערו אותן בעדינות כדי לפזר את התאים בבאר.חזור על הפעולה במשך 10 עד 12 ימים עד שהתאים יגיעו ל-50% confluence. לאחר 10 עד 12 ימים, בחן את ה-hESCs תחת המיקרוסקופ. בחר אחת עד שתי מושבות מכל באר, והעברן לפלטות חדשות של 12 בארות עם תאי הזנה MEF כדי ליצור פלטת שכפול.הפיקו DNA מהמושבות שנותרו בכל באר בצלחות המקור לצורך גנוטיפיקה באמצעות PCR או southern blot. תאי גזע עובריים אנושיים של Weber Three סומנו בלוקוס AAVS1 באמצעות נוקלאזות ספציפיות לאתר ותבנית תיקון להחדרת רפורטר EFFP וקסטת עמידות לפיורומיצין. תמונות מייצגות אלו מראות מושבות שנערכו באמצעות נוקלאזות אצבעות אבץ, TALENs ו-CRISPR/Cas9.תוצאות PCR מייצגות של גנוטיפינג אלו מציגות שיבוטים שאינם ממוקדים, הטרוזיגוטיים והומוזיגוטיים ממוקדים תוך שימוש בנוקלאזות אצבעות אבץ (zinc finger nucleases), TALENs ו-CRISPR/Cas9, לצד בקרת סוג בר (wild type). טבלה זו מציגה אינטגרציות המאומתות ב-PCR בלוכוס AAVS1 עבור כל נוקלאזה ספציפית לאתר בניסוי זה, בהשוואה לאינטגרציות בודדות תקינות המאומתות ב-Southern Blot בניסויים קודמים. CRISPR-Cas9 הניב את מספר השיבוטים הממוקדים בצורה הנכונה ביותר, בעוד שפלטפורמת ה-TALEN הניבה את מספר השיבוטים הממוקדים בהומוזיגוזיות הגבוה ביותר.לאחר שליטה בטכניקה, היא דורשת כ-שלוש עד חמש שעות של עבודה מעשית, וניתן לקבל תאים ערוכים בתוך כשלושה שבועות מתחילת הניסויים. בטכניקה זו חשוב מאוד לעבוד בבטיחות ולהשתמש בשיטות סטריליות בכל עת. בעקבות המניפולציה הגנטית, ניתן לבחון כיצד היא משפיעה על סוגי תאים אחרים באמצעות גדילה של תאי גזע לסוגי תאים אחרים, כגון נוירונים.פיתוח פרוטוקול זה סלל את הדרך עבור חוקרים להשתמש בעריכה גנומית בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצורך הקמת מודלים של מחלות in vitro. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ביצוע עריכה גנומית בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

סרטון זה מדגים טכניקה של עריכת גנום מבוסס נוקלאז באצבעות אבץ בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). מכיוון שניתן להתמיין לתאי גזעי עוברי אורח לסוגי תאים שונים, טכנולוגיה זו מועילה למחקרים פתולוגיים ופרמקולוגיים במבחנה באופן ספציפי למטופל.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתוכנתים מחדש ומאופיינים ללא גורמים והמרה למצבים קליניים משוערים.

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

עריכת גנים בתיווך TALEN בלוקוס AAVS1 בנמל המבטחים מאפשרת הוספת טרנסגנים ביעילות גבוהה ב-iPSCs אנושיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת iPSCs להעברת TALEN וקטור תורם, טרנספקציה של iPSCs ובחירה ובידוד של שיבוטי iPSC כדי להשיג אינטגרציה ממוקדת של גן GFP ליצירת קווי דיווח.

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

כאן אנו מדווחים על שיטת עריכת גן מהירה ויעילה מבוססת על RMCE שעבר על מקורות AAVS1 של תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) המשפרת על מערכות שתוארו לעיל. באמצעות טכניקה זו, קווי isogenic יכולים להיוצר במהירות ובאמינות ללימודים השוואתיים נכונים, הקלת מחקר בתיווך transgenesis עם hPSCs.

הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב<em&gt; AAVS1</em&gt; לוקוס

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור תיוג endogenously לידי ביטוי חלבונים עם תגי פלורסנט בתאי גזע pluripotent המושרה האנושי באמצעות CRISPR/Cas9. תאים putatively הערוך מועשרים ידי קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא, שורות תאים המשובטים נוצרים.

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

למדו עריכת גנום בתאי גזע pluripotent אנושיים באמצעות CRISPR/Cas9 ו-TALENs. הפרוטוקול מדגים שילוב EGFP ועמידות לאנטיביוטיקה בלוקוס AAVS1 ליצירת מודלים מחלתיים מדויקים.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

גלה סרטונים נוספים