הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להנדס גנטית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות טכנולוגיה מודרנית לעריכת גנום. למרות שהליך זה יכול לספק תובנה לגבי הביולוגיה של תאי הגזע, ניתן ליישם אותו גם כדי להקל על מידול מחלות אנושיות בסביבה מוגדרת גנטית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יצטרכו לתרגל בידוד מושבות לפני שיהיו מיומנים.

הדגמה חזותית של שיטה זו חיונית מכיוון שזיהוי וקטיף מושבות יכול להיות קשה. התחל בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים במדיה hESC על צלחת בת שש בארות המכילה פיברובלסטים עובריים של עכברים מומתים מיטומיצין C, או תאי הזנה MEF הגדלים על ג'לטין. בכל יום לאחר הציפוי, עד שה-hPSCs מגיעים למפגש של 50%, השתמש בפיפטה מזכוכית ובוואקום כדי להסיר את כל נפח המדיה.

החלף בשלושה מיליליטר של מדיית hESC חמה לכל באר. יום אחד לפני המיקוד, הסר את מדיית ה-hESC והוסף מדיית hESC טרייה שחוממה מראש בתוספת 10 מיקרו-מולר Y-27632. כמו כן, הכינו צלחת אחת עד שתיים של שש בארות של תאי הזנה MEF עמידים לתרופות מעכברי DR4.

ביום המיקוד, הכינו את תמיסות הטרנסבקציה על ידי פיפטינג של חמישה מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי נוקלאז אצבע אבץ 1 ו-2, פלסמיד ביטוי TALON 1 ו-2, או 15 מיקרוגרם של CRISPR cas9 px330 המקודד פלסמיד לתוך צינור של נקודה אחת של חמישה מיליליטר. הוסף 30 מיקרוגרם של פלסמיד התורם המתוקן, ואחריו מספיק 1x מי מלח חוצץ פוספט כדי להביא את הנפח ל-300 מיקרוליטר. בדוק את התאים במיקרוסקופ כדי להבטיח מפגש של 50%.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה מזכוכית ובוואקום כדי להסיר את המדיה מהצלחת של hPFCs, ולאחר מכן שטוף את התאים עם 2 מיליליטר PBS חם 1x. לאחר שאיבת ה-PBS, הוסף נקודת אפס חמש מיליליטר של תמיסת 0.25%Trypsin-EDTA ישירות על התאים. מניחים בחממת תרבית הרקמות למשך כ-10 דקות, או עד ששכבת המזין מתחילה להתרומם מהצלחת.

לאחר הדגירה, הוסף שני מיליליטר של חומר שטיפה ES חם לכל באר כדי לעצור את תגובת הטריפסין. אסוף את התאים מכל באר, וודא שתאי ההזנה יורדים כסדין. פיפטה את תכולת כל באר לצינור חרוטי יחיד של 50 מיליליטר, המשלב את כל הבארות ומשולש את התאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר.

הוסף מדיית שטיפה ES כדי להביא את מתלה התא ל-40 מיליליטר. המתן דקה עד שתיים כדי לאפשר לגושי הזנה גדולים להתיישב בתחתית הצינור, ואז הסר את הסופרנטנט, באמצעות פיפטה סרולוגית, והפקיד בצינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של תרחיף התא למשך חמש דקות ב-190 פעמים גרם, שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לפלטת התאים.

השעו מחדש את התאים ב -500 מיקרוליטר של 1x pbs. שלב את התאים התלויים עם תמיסת חתך הפלזמה שהוכנה קודם לכן. שפכו את תערובת התאים והטרנספקציה לקובטה של ארבעה מילימטרים, והניחו על קרח למשך שלוש עד חמש דקות.

הגדר את הפרמטרים עבור התוכנית האקספוננציאלית במערכת האלקטרופורציה ל-250 וולט, 500 מיקרו-פאראד, התנגדות אינסופית וגודל קובטה של ארבעה מילימטרים. אלקטרופוראט את התאים, ולאחר מכן הנח את הקובט בחזרה על קרח למשך שלוש דקות. השעו מחדש את התאים האלקטרופורטיים ב-18 מיליליטר של מדיה hESC חמה, בתוספת 10 מיקרו-מולרי Y-27632.

בדוק את ה-DR4 MEFs תחת מיקרוסקופ. צלח שלושה מיליליטר של תרחיף התא הבודד לכל באר של צלחת בת שש בארות המכילה תאי הזנה DR4, והחזר לחממה. ביום השלישי לאחר הציפוי, החלף את המדיה בתאים hESC ללא Y-27632.

ביום הרביעי, החלף את החומר ללא תוספת בחומר המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה. כאן משתמשים בפורומיצין. ביום שלפני קטיף המושבה, הכינו צלחת אחת של 12 בארות של תאי הזנה MEF לכל מושבה לקטוף.

ביום ה-12 לאחר הציפוי, בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ דיסקציה. זהה מושבות בקוטר 800 עד 1,200 מיקרון המוכנות לקטיף. ודא שהמושבות האלה אינן מכילות תאים שמתחילים להתמיין, כמו זה שמוצג כאן.

כמו כן, ודא שהתאים מבטאים GFP. ביום הקטיף, בדוק את MEFs תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם בריאים. הסר את כל המדיה מלוחות התא של מזין MEF והחלף במיליליטר אחד של מדיית hESC.

כמו כן, שנה את מדיית ה-hESC על לוחות ה-hPSC עם שש הבארות שהולכים להיבחר. לאחר מכן, משוך פיפטות זכוכית לקטיף מושבות. כדי לבחור מושבות, הנח תחילה את הצלחת hPFCs על הבמה של מיקרוסקופ הדיסקציה במכסה המנוע של תרבית הרקמות, הרכיב את מכשיר הקטיף על ידי הנחת קצה פיפטת הזכוכית לתוך נורת היניקה.

זהה את המושבה שיש לקטוף, והנח את קצה פיפטת הזכוכית המשוכה מעל המושבה. לאחר מכן, דחסו את הנורה של מכשיר הקטיף כדי לכרות בעדינות ולחתוך מושבה בודדת ל -10 עד 20 חתיכות שוות בגודלן. לאחר מכן, משוך את חתיכות המושבה שנכרתו לתוך הפיפטה על ידי שחרור הנורה.

נסה לקחת כמה שפחות מדיה בזמן ההעברה. דחוס את הנורה כדי להעביר את המושבה השבורה כעת ישירות לבאר אחת של צלחת תא הזנה MEF בת 12 בארות. סמן כל באר כדי לאפשר זיהוי ייחודי של שיבוטים שמקורם בתא בודד.

החלף את פיפטת הזכוכית וחזור על ההליך עבור המושבה הבאה. החזירו את הצלחות לחממה, ונדנדו בעדינות את הצלחות כדי לפזר את התאים בבאר. למחרת, הסר את הנפח המלא של המדיה והחלף בנקודה אחת של חמישה מיליליטר של מדיית hESC חמה.

חזור על הפעולה במשך 10 עד 12 ימים עד שהתאים יהיו 50% מתלכדים. לאחר 10 עד 12 ימים, בדוק את ה-hESCs תחת ההיקף. בחר מושבה אחת עד שתיים מכל באר, והעביר ללוחות תאי הזנה MEF חדשים עם 12 בארות כדי ליצור צלחת העתק.

חלץ DNA מהמושבות הנותרות בכל באר של הלוחות המקוריים לגנוטיפ על ידי PCR או כתם דרומי. וובר: שלושה תאי גזע עובריים אנושיים כוונו ללוקוס AAVS1 באמצעות נוקלאזות ספציפיות לאתר ותבנית תיקון כדי להציג מדווח EFFP וקלטת עמידות לפורומיצין. תמונות מייצגות אלה מציגות מושבות שנערכו עם נוקלאזות אצבע אבץ, TALENs ו-CRISPR/Cas9.

תוצאות הגנוטיפ המייצגות הללו של PCR מראות שיבוטים ממוקדים לא ממוקדים, הטרוזיגוטיים והומוזיגוטיים באמצעות נוקלאזות אצבע אבץ, TALENs ו-CRISPR/Cas9 לצד בקרה מסוג פראי. טבלה זו מציגה את האינטגרציות המאומתות של PCR בלוקוס AAVS1 עבור כל נוקלאז ספציפי לאתר בניסוי זה, בהשוואה לאינטגרציות בודדות מאומתות של Southern Blot בניסויים קודמים. CRISPR-Cas9 הניב את השיבוטים הממוקדים ביותר בצורה הנכונה, בעוד שלפלטפורמת TALEN היו השיבוטים הממוקדים ביותר באופן הומוזיגוט.

לאחר שליטה, טכניקה זו אורכת כשלוש עד חמש שעות של זמן מעשי, ואתה יכול לקבל תאים ערוכים תוך כשלושה שבועות מתחילת הניסויים. חשוב מאוד בטכניקה הזו לעבוד בבטחה, ולהשתמש בטכניקה סטרילית כל הזמן. בעקבות המניפולציה הגנטית, אתם יכולים לראות כיצד היא משפיעה על סוגים אחרים של תאים באמצעות התמיינות תאי גזע לסוגי תאים אחרים, כמו למשל נוירונים.

פיתוח פרוטוקול זה סלל את הדרך לחוקרים להשתמש בעריכת גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים כדי לבסס מודלים של מחלות מבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לערוך גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.