הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

המטרה הכללית של פרוטוקול הדימות הזה היא להדגים את הדינמיקה של תאי T חיוביים ל-CD4 בעור דלקתי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון, מהם המנגנונים העומדים בבסיס הניידות והתפקוד של תאי מערכת החיסון ברקמות דלקתיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת דרך פולשנית באופן מינימלי לחקר ההתנהגות הדינמית של תאי CD4 T באופן In Situ.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים להכנת האוזן להדמיה קשים ללמידה, ומיקום נכון של האוזן הכרחי להשגת תמונות באיכות גבוהה. אני אליסון גיילו, סטודנטית לתואר מתקדם, ואני אדגים את הפרוטוקול הזה. התחילו בשאיבת 300 µL של תרחיף תאי T אפקטורים מסומנים פלואורסצנטית עבור כל עכבר לתוך מזרק המצויד במחט במידה 27.5 gauge.

לאחר מכן, הפכו את המזרק כך שהמחט תפנה כלפי מעלה, והקישו בעדינות על דופן המזרק, תוך הנעת הבוכנה מעלה ומטה במידת הצורך כדי להוציא בועות אוויר. כאשר התאים מוכנים, העבירו את העכברים לכלוב נקי והניחו אותם תחת מנורת חימום, עד להתרחבות ורידי הזנב. לאחר מכן, העבירו את העכבר הראשון למכשיר הריסון, ונגבו את הזנב בעזרת סבון אלכוהול.

לאחר זיהוי וריד זנב צדי, הזרק לאט 200 µl של תאים לתוך הווריד. כאשר כל התאים הועברו, שאב 50 µL של fluorescens emulsion מלא למזרק אינסולין בכיול 28.5 G ולחץ בחוזקה על הבוכנה כדי להוציא בועות אוויר גדולות. לאחר מכן, הנח קליפה (thimble) על האצבע המורה השמאלית, ואחוז בזהירות באוזנו של העכבר בין האגודל השמאלי לקליפה, כאשר הצד הוונטרלי של האוזן פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, החליקו את המחט, כאשר הצד האלכסוני פונה כלפי מעלה, אל תוך הדרמיס בשליש החיצוני של הפינה (pinna), במרחק קל מהמרכז, והזריקו באיטיות 10 µL של אמולסיה אל תוך הרקמה. לאחר ההזרקה לכל החיות, עקבו אחר העכברים עד להחלמתם המלאה. שלושה ימים לאחר החיסון, בצעו הרחבה של ורידי הזנב (vasodilate) בחיות המוזרקות, כפי שהודגם זה עתה.

לאחר ההרדמה, קבע את זנבו של העכבר הראשון באמצעות פינצטה. נקה את הזנב בעזרת סמרטוט אלכוהול, ולאחר מכן החלק בזהירות קטטר מחט במידה 30.5 לתוך וריד צדי בזנב, ובדוק את פתוחותו על ידי הפעלת לחץ עדין על בוכנת המזרק. כאשר הקטטר במקומו, מרח טיפה אחת עד שתיים של דבק רקמות סיאנואקרילט על נקודת ההזרקה, והמתן לייבוש הדבק למשך כ-30 שניות.

לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לקצץ בזהירות את השפם ואת הפרווה מהחלק האחורי ומצדי האוזן. בשלב הבא, השתמשו במקלון צמר גפן כדי להרטיב את המשטח הפנימי של האוזן ב-PBS. לאחר מכן סובבו את העכבר, והצמידו את האוזן המוזרקת לזכוכית כיסוי (cover slip) מספר 1.5 בגודל 24 על 50 מילימטר, עד שהיא תהיה מיושרת עם הזכוכית.

ספגו את ה-PBS העודף. לאחר מכן, השתמשו בשני זוגות של פינצטות קמורות כדי לתפוס פיסת סרט בד באורך של כ-20 מילימטרים לאורכה בפינות העליונות, והניחו את חלקו התחתון של הסרט על לוכית הכיסוי בחלקו העליון של אוזן העכבר. גלגלו את הסרט על שאר האוזן, תוך דחיפת שיער עודף מהדרך בעזרת הפינצטות במידת הצורך, והשתמשו במקלון צמר גפן יבש כדי להצמיד בעדינות את הסרט סביב האוזן כדי להבטיח איטום הדוק, תוך הקפדה לא ללחוץ על האוזן עצמה.

חיוני להדביק את האוזן כראוי לזכוכית כיסוי עם אטום טוב משני הצדדים ובמינימום בועות אוויר, שכן הדבר ישפיע על איכות התמונות שניתן יהיה להשיג. כעת הדביקו פלטפורמת דימוי למיקרוסקופ פלואורסצנטי לבלוק חימום של 37 degree Celsius, ומרחו גריז ואקום לשני צידי אזור האוזן של הפלטפורמה. סובבו את העכבר כדי להניח את זכוכית הכיסוי על הפלטפורמה, תוך הקפדה ליישר את האוזן במרכז הלבד.

לאחר שהאוזן הונחה במקומה, הצמדו את קונו האף של ה-isoflurane למחזיק שעל הפלטפורמה, תוך וידוא שהקונו יציב ומכסה לחלוטין את אפו של העכבר. לאחר מכן, השתמשו במקלון צמר כדי ללחוץ בחוזקה אך בזהירות את זכוכית הכיסוי על פלטפורמת הדימיג', כדי לפרוס את גריז הוואקום מתחת לזכוכית הכיסוי. גלגלו שתי חתיכות סרט דביק באורך 20 מילימטר ושתי חתיכות ארוכות יותר סביב החלק העליון של הפלטפורמה כדי להצמיד את זכוכית הכיסוי לפלטפורמה.

כעת, העבירו את העכבר לבמה של המיקרוסקופ.יבתו את הפלטפורמה בעזרת סרט דבק נוסף, ומרחו שכבה כפולה של גריז ואקום על לית הסגירה מסביב לאוזן. לאחר מכן, עטפו את העכבר בשמיכה מחממת מלאה במים, ומלאו את מאגר גריז הוואקום במים מזוקקים בטמפרטורה של 37 °C.

עבור דימוי Time lapse In Vivo, התחילו במיקום העדשה מעל מרכז האוזן, והורידו את העדשה עד שתבוא במגע עם פני השטח של המים במאגר. לאחר מכן, באמצעות מקור אור חיצוני, הורידו לאט את העדשה עד שפני השטח של האוזן יתמקדו. לאחר מכן, הורידו את הווילונות הפנימיים והחיצוניים מסביב לבמה של המיקרוסקופ, וכווננו את אורך גל הלייזר ל-900 nanometers בחלון בקרת הלייזר של ה-MP, את עוצמת הלייזר בחלון הגדרות הלייזר של הרכישה, ואת מתחי ה-PMT בחלון בקרת רכישת התמונה.

בחלונות הגדרות הגודל והמצב (size and mode) של הרכישה, הגדירו את המיקרוסקופ לרזולוציה של 512 על 512 פיקסלים, עם זמן שהייה (dwell time) של 2 µs לפיקסל, ובחרו ב-XY repeat כדי להפעיל מצב דימוי חי לסריקה דרך הרקמה. לאחר איתור שדה דימוי מתאים, אתרו את התא הגבוה ביותר בדרמיס, ולחצו על כפתור set zero כדי להגדיר את מיקום ה-Z לאפס. גלגלו מטה בכיוון ציר ה-Z כדי למדוד את עומק התא.

לאחר מכן, הגדירו את נקודות ההתחלה והסיום בחלון הגדרות הרכישה של המיקרוסקופ, וכווןו את מתחי ה-PMT של המכשיר ואת הספק הלייזר בחלון ה-Z בהיר כדי למטב את ויזואליזציית התאים לכל עומק שדה הדמיון. בדקו את כפתורי העומק והזמן, והגדירו מסנן משותף לסריקת התמונה שלוש פעמים לשורה בחלון מצב המסננים של בקרת רכישת התמונה. התאימו את עומק פרוסות ה-Z בחלון המיקרוסקופ של רכישת התמונה כך שדרוש כדקה אחת ללכידה של מחסנית (stack) מלאה, כפי שמופיע בחלון תצוגת הזמן.

לאחר מכן, כדי להעריך את יציבות הרקמה, הגדירו את מספר החזרות לחמש בחלון הגדרות הרכישה של סריקת הזמן (time scan), ולחצו על כפתור הסריקה כדי ללכוד תמונת Time-lapse של האזור למשך חמש דקות. אם הרקמה יציבה לאחר חמש דקות, הגדירו את מספר החזרות לבין 30 ל-45 בחלון הגדרות הרכישה של סריקת הזמן, ואספו תמונת Time-lapse למשך 30 עד 45 דקות, תוך ניטור כל סחיפה (drift) מינורית של הרקמה בזמן איסוף התמונה. שמרו את התמונה שלפני הוספת הנוגדן בפורמט המתאים, ולאחר מכן שאבו את תערובת הנוגדנים למזרק טוברקולין של 1 mL, תוך הקפדה על הסרת כל בועות האוויר.

לחצו בעדינות על הבוכנה כך שתיווצר טיפה של תמיסת הנוגדנים בקצה המחט, והרימו את המסכים מסביב לבמה כדי לאתר את הקתטר. החליפו את מזרק ה-PBS במזרק הנוגדנים, ולאחר מכן הזריקו לאט את הנוגדנים אל תוך הקתטר. לאחר שהנוגדנים הוזרקו בהצלחה, הורידו שוב את המסכים ורשמו את זמן ההזרקה.

לאחר מכן, התחילו מיד באיסוף רצף הדמיה חדש של 20 עד 40 דקות, באותו מיקום, תוך שימוש בהגדרות המכשיר ששימשו להדמיה שלפני מתן הנוגדן. לבסוף, שמרו את קובץ ההדמיה שאחרי מתן הנוגדן בפורמט המתאים, והסירו בזהירות את העכבר משולחן המיקרוסקופ, תוך מעקב אחר בעל החיים עד להחלמה מלאה. הדמיה של דרמיס האוזן השלם באמצעות פרוטוקול זה מקלה על רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה ובשיטת time lapse של דינמיקת תאי T אפקטוריים בדרמיס המודלק.

בסרטון זה, ניתן להבחין בתאי T אפקטורים שעברו העברה אדופטיבית (בצבע ירוק) נעים ברחבי רקמת העור. עם זאת, לאחר מתן נוגדנים חוסמי entogrin מסוג antibeta one ו-antibeta three דרך הקטטר, התאים שהיו ניידים קודם לכן נעצרים בתוך הדרמיס. התאים מראים מהירות ממוצעת מופחתת לאחר מתן הנוגדנים, וכן ירידה משמעותית במדד הטיול (meandering index) שלהם.

כלומר, היחס בין ההעתקה הכוללת לאורך המסלול הכולל. פלואורסצנציה עצמית מזקיקי שיער, הצללה ופלואורסצנציה עצמית משיער המכסה את האזור, ובועות אוויר הלכודות בין פני האוזן לכיסוי הזכוכית, עלולים לגרום לארטיפקטים של דימוי, אשר מסתירים את הדמיון של תאי T ומפריעים לתוכנה האוטומטית לניתוח תמונות. בנוסף, שימוש במקורות חום מרובים עלול לגרום לבעיות ביציבות הרקמה, מה שמוביל לתנודות גדולות במהלך הדימוי המקשות על פרשנות התוצאות.

לאחר השליטה בטכניקה, דימוי תאי CD4 T בדרמיס יכול להסתיים בתוך שתיים עד שלוש שעות, אם הפרוצדורה בוצעתה נכון. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לפעול לפי הנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המתאימות לעבודה עם עכברים. ניתן להתאים פרוצדורה זו לצורך ויזואליזציה של תתי-אוכלוסיות אחרות של תאי T או סוגים אחרים של תאי מערכת החיסון באוזן, באמצעות מודלים שונים של זיהום, או שיטות שונות להשראת דלקת.

לאחר פיתוחה, סלילה הדרך של הדמיה תוך-חיה (intravital imaging) אפשרה לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את הדינמיקה של תגובות חיסוניות מתמשכות בבעלי חיים חיים. זכרו כי עבודה עם לייזר רב-פוספורי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון מיגון מתאים, בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות דלקת בדרמיס של אוזן עכבר, וכיצד להשתמש בהדמיה תוך-חיה כדי ללכוד תמונות Time-lapse של פעילות תאי CD4 T לפני ואחרי מתן נוגדנים.