Name: הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: למדו הדמיה תוך-חיים של תאי T CD4 בעור דלקתי. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת תאי חיסון בעכברים בצורה מינימלית פולשנית וללמוד על תנועתם בבלוטות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים אוניברסיטת מתקן Core רוצ&#39;סטר multiphoton מיקרוסקופ לעזרה עם הדמיה לחיות. נתמך על ידי NIH AI072690 ו AI02851 כדי DJF; AI114036 כדי AG ו AI089079 כדי MGO.

החוקרים אין לי מה לחשוף.

מַשְׁמָעוּת כאן אנו מציגים פרוטוקול מלא עבור להדמית 4D של עבירה, מפעיל-specific antigen תאי Th1 בדרמיס אוזן עכבר השלם. שיטה זו מספקת יתרונות על פני כמה שיטות הדמיה נוכחיות מכמה סיבות. על ידי הדמית הדרמיס אוזן הגחון, אנו מסוגלים לוותר על הסרת שיער כי נדרשה עבור פרוטוקולי הדמיה מעורבים אתרי עור אחרים. למרות מסירי שיער הם קלים בדרך כלל, הם הוכחו לגרום להפרעת מחסום העור 42, תהליך שיכול לעורר תגובה...

תפקוד האפקטור של תאי CD4 T תלוי באופן קריטי ביכולתם להיכנס במהירות ולחצות מגוון רחב של רקמות היקפיות כדי לסקור נזק, לאתר מוקדי זיהום או לגרום לפתולוגיה מזיהום כרוני או אוטואימוני. בעוד שתהליכי הביות לאתרים מודלקים1-4 והאקסטרוואזציה5-7 מכלי הדם לרקמות אופיינו היטב, הגורמים המניעים ומווסתים את התנועתיות הבין-רקמית של תאי T נותרו לא מוגדרים. נדידת תאי T בסביבות תלת מימד מורכבות נחקרה במבחנה באמצעות שימוש במטריצות מלאכותיות8-10 או מכשירים מיקרופלואידיים11,12, אך אלה אינם מצליחים לסכם את הסביבה המורכבת והדינמית של מערכת in vivo. רק לאחרונה, עם הופעת הדמיה תוך-חיונית רב-צבעונית ברזולוציה גבוהה, ניתן לחקור את ההתנהגות הדינמית של תאי חיסון באתרם, מה שמאפשר הבנה טובה יותר של תגובות חיסוניות שלמות.
לפני למעלה מעשור פורסמו מספר מחקרים משפיעים שהשתמשו לראשונה במיקרוסקופיה מולטיפוטונית כדי לענות על שאלות אימונולוגיות. מחקרים מוקדמים התמקדו בהתנהגות של תאים חיסוניים בתוך איברי לימפה מושתלים13-16, ואחריהם במהרה החלו טכניקות להדמיית בלוטות לימפה חשופות בעכברים מורדמים17. הדמיה אפשרה תצפיות בסיסיות חדשות על שלבי ההתחלה של בלוטות הלימפה של תאי T18, המנגנונים שבאמצעותם תאי T נודדים באיברי לימפה משניים19, אינטראקציות של תאי T עם תאים חיסוניים אחרים20,21, ומיקום דינמי של תאי T בתוך בלוטת הלימפה22. למרות שמחקרים מוקדמים רבים התמקדו בדינמיקה של בלוטות הלימפה, הדמיה תוך-חיונית שימשה מאז להדמיית התגובה החיסונית ברקמות היקפיות רבות, כולל המוח23-25, כבד26, ריאות27 ועור28-30. 
דרמיס אוזני העכבר מוכן במיוחד להדמיה, בשל עור האוזניים הדק, מחסור יחסי בשיער והקלות שבה ניתן לבודד אותו מתנועות נשימה31. ואכן, דרמיס האוזן שימש להדמיית התנהגות אינטרסטיציאלית של תאים דנדריטיים32,33, תאי T28,29,34,35 ונויטרופילים36,37, והוא אתר מבוסס היטב לחקר דלקת עורית. יותר ויותר, הליכים לא פולשניים מחליפים תכשירים כירורגיים של העור, כולל דרמיס מפוצל38,39, צד39,40, או דגמי חלון דש עור גבי39,41, שיכולים לגרום לשינויים בסביבה הדלקתית המקומית. השימוש בתאי T אפקטור CD4 מועברים, במבחנה, ספציפיים לאנטיגן מאפשר לחקור אוכלוסייה הומוגנית של תאים בהקשר של תגובה דלקתית עורית30. כאן אנו מתארים הליך הדמיה לא פולשני המאפשר הדמיה של תאי CD4 T אפקטור ספציפיים לאנטיגן באינטרסטיציום העורי של אוזן העכבר המודלקת, ואת היכולת לתפעל תאים אלה בזמן אמת על ידי החדרת נוגדנים חוסמים דרך קטטר ורידי. אנו מראים כי מודל זה יעיל למעקב אחר תנועת תאי CD4 T בדרמיס ולשאילתות על המנגנונים השולטים בתנועתיות זו.

<table><tbody><tr><td>עכברי BALB/c</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>000651</td><td>עכברים ששימשו גודלו בבית</td></tr><tr><td>DO11.10 עכברים</td> מעבדות <td>ג'קסון</td><td>003303</td><td>עכברים ששימשו גודלו בבית</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>10-013-CV</td><td>Multiple Equivalent</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum (NCS)</td><td>Thermo/HyClone</td><td>SH30118.03</td><td>חום מושבת ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות</td></tr><tr><td>משלים שרקנים</td><td>Cedarlane</td><td>CL-5000</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד CD8</td><td>ATCC</td><td>3.155 (ATCC TIB-211)</td><td>נוגדנים שמקורם ב&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן היברידומה זה נגד MHC Class II</td><td>ATCC</td><td>M5/114.15.2 (ATCC TIB-120)</td><td>נוגדנים שמקורם ב&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן היברידומה זה נגד CD24</td><td>ATCC</td><td>J11d.2 (ATCC TIB-183)</td><td>נוגדנים הנגזרים מ&nbsp; </td></tr><tr><td>נוגדן היברידומה זה נגד Thy1.2</td><td>ATCC</td><td>J1j.10 (ATCC TIB-184)</td> <td>נוגדנים שמקורם ב&nbsp; היברידומה זו</td></tr><tr><td>Ficoll (Fico/Lite-LM)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>I40650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>21-040-CV</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>15323591</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-CD62L ביוטיניל (שיבוט MEL-14)</td><td>BD</td><td></td><td></td>553149</tr><tr><td>חרוזי הפרדה מגנטית סטרפטווידין</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS עמודת הפרדה</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד IFNg (שיבוט XMG 1.2)</td> <td>eBioscience</td><td>16-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד IL-4 (שיבוט 11b11)</td> <td>eBioscience</td><td>16-7041-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>VWR</td><td>45000-412</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>פישר</td><td>15303641</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>פישר</td><td>15323671</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>פפטיד אובאלבומין</td><td>Biopeptide</td><td></td><td>ISQAVHAAHAEINEAGR-OH פפטיד</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>Thermo/HyClone</td><td>SV30014.03</td><td>מושבת בחום ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות</td></tr><tr><td>צלחת תרבית 24 בארות</td><td>LPS</td><td>3526</td><td>CFSE</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>28 G1/2 מזרקי אינסולין, 1 מ"ל</td><td>BD</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>28 G1/2 מזרקי אינסולין, 300&mu; l</td><td>מזרקי BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>27 G1/2 TB, 1 מ"ל</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 מחטים</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 צינורות רפואיים</td><td>BD</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>ציאנואקרילט דבק וטרינרי (Vetbond)</td> <td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>צלחת חימום</td><td>WPI</td><td>61830</td><td></td></tr><tr><td>בקר צלחת חימום</td><td>WPI</td><td>ATC-2000</td><td></td></tr><tr><td>בקר שמיכת מים</td><td>Gaymar</td><td>TP500</td><td>כבר לא בייצור, שמיכת מים זמינה שווה ערך חדשה</td></tr><tr><td></td><td>יותר Kent Scientific</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane וופורייזר</td><td>LEI Medical</td><td>Isotec 4</td><td>כבר לא בייצור, שווה ערך חדש יותר</td></tr><tr><td>זמין איזופלורן</td><td>הנרי שיין</td><td></td><td>הוזמן דרך וטרינריה </td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td> לצוות <td>VWR</td><td>20170-038</td> סרט רפואי <td>שווה ערך מרובה</td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן אף</td><td></td><td></td><td>מובנה בבית, ראה איור 2</td></tr><tr><td>פלטפורמת</td><td></td><td></td> הדמיה <td>מובנית בבית, ראה איור 2</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>WPI</td><td>15915-G</td> מספריים <td>מקבילים</td></tr> <tr><td></td><td>מרוביםRoboz</td><td>RS-6802</td><td>כיסויי זכוכית שווים מרובים</td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td></td> שוות <td>ערך מרובות</td></tr><tr><td>שוות ערך גריז ואקום גבוה</td><td>פישר</td><td>146355D</td><td></td></tr><tr><td>ספוגיות</td><td></td><td></td> כותנה <td>מספר מקבילות</td></tr><tr><td>למשימות</td><td>פישר</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף מקביל מרובה Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM עם ספקטרה-פיזיקה MaiTai HP DeepSee Ti:Sa לייזר</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>קריאה להצעת מחיר</td></tr><tr><td>טבלה אופטית עם בקרת רטט</td><td>ניופורט</td><td></td><td>שיחה להצעת מחיר</td></tr><tr><td>25x NA 1.05 מטרת טבילה במים להדמיה מרובת פוטונים</td><td>אולימפוס</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>מחמם אובייקטיבי</td><td>Bioptechs</td><td>PN 150815</td><td></td></tr><tr><td>קוביית מסנן זיהוי</td><td>אולימפוס</td><td>FV10-MRVGR/XR</td><td>קובייה קניינית, ניתן להעריך ממסננים בודדים / דיכרואיקה</td></tr><tr><td>אנטי אינטגרין ובטא; 1 נוגדן (שיבוט hMb1-1)</td> <td>eBioscience</td><td>16-0291-85</td><td>נטול אזיד, אנדוטוקסין נמוך</td></tr><tr><td>אנטי אינטגרין ובטא; 3 נוגדנים (שיבוט 2C9. G3)</td><td>eBioscience</td><td>16-0611-82</td><td>נטול אזיד, אנדוטוקסין נמוך</td></tr><tr><td>טקסס אדום דקסטרן (70,000 מגה-וואט)</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמית תא cd4 t גירת ביניים בדרמיס המוסת

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

היכולת של תאי CD4 T לבצע פונקציות מפעיל תלויה ההגירה המהירה ויעילה של תאים אלה ברקמות פריפריה מוסתות באמצעות מנגנון שטרם מוגדר. היישום של מיקרוסקופיה multiphoton לחקר מערכת החיסון מספק כלי למדוד את הדינמיקה של תגובה חיסונית בתוך רקמות ללא פגע. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה multiphoton intravital לא פולשנית של תאים מסוג CD4 T בדרמיס האוזן העכבר מוסת. שימוש פלטפורמת הדמיה מותאם אישית צנתר ורידים מאפשר ההדמיה של דינמיקת תא CD4 T ב interstitium עורי, עם היכולת לחקור תאים אלה בזמן אמת באמצעות התוספת של חסימת נוגדנים לרכיבים מולקולריים מפתח המעורבים תנועתיות. מערכת זו מספקת יתרונות על פני הן במבחנת מודלים ונהלי הדמיה פולשנית כירורגית. הבנת מסלולים בשימוש על ידי תאים מסוג CD4 T עבור תנועתיות עשוי בסופו של דבר לספק תובנה בשיאפונקציה ג תאי CD4 T וכן בפתוגנזה של שתי המחלות והפתולוגיה אוטואימוניות מדלקות כרוניות.

היכולת ללמוד תגובות חיסוניות באתרו מבלי לשנות את הסביבה החיסונית חיונית בלימוד אינטראקציות בזמן אמת של תאי מפעיל T עם רקמה דלקתית. הדמיה של הדרמיס האוזן ללא פגע על ידי פרוטוקול זה, המתואר באיור 1 א &#39;וב&#39;, מאפשרת ההדמיה של תאי מפעיל T שסומנו הועברו fluorescently ב interstitium עורי. הליך זה יגרום גם ברזולוציה גבוהה (איור 1 ג) ו הזמן לשגות (האיור 1D, סרט 1)</s...

המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

המטרה הכללית של פרוטוקול הדימות הזה היא להדגים את הדינמיקה של תאי T חיוביים ל-CD4 בעור דלקתי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון, מהם המנגנונים העומדים בבסיס הניידות והתפקוד של תאי מערכת החיסון ברקמות דלקתיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת דרך פולשנית באופן מינימלי לחקר ההתנהגות הדינמית של תאי CD4 T באופן In Situ.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים להכנת האוזן להדמיה קשים ללמידה, ומיקום נכון של האוזן הכרחי להשגת תמונות באיכות גבוהה. אני אליסון גיילו, סטודנטית לתואר מתקדם, ואני אדגים את הפרוטוקול הזה. התחילו בשאיבת 300 µL של תרחיף תאי T אפקטורים מסומנים פלואורסצנטית עבור כל עכבר לתוך מזרק המצויד במחט במידה 27.5 gauge.לאחר מכן, הפכו את המזרק כך שהמחט תפנה כלפי מעלה, והקישו בעדינות על דופן המזרק, תוך הנעת הבוכנה מעלה ומטה במידת הצורך כדי להוציא בועות אוויר. כאשר התאים מוכנים, העבירו את העכברים לכלוב נקי והניחו אותם תחת מנורת חימום, עד להתרחבות ורידי הזנב. לאחר מכן, העבירו את העכבר הראשון למכשיר הריסון, ונגבו את הזנב בעזרת סבון אלכוהול.לאחר זיהוי וריד זנב צדי, הזרק לאט 200 µl של תאים לתוך הווריד. כאשר כל התאים הועברו, שאב 50 µL של fluorescens emulsion מלא למזרק אינסולין בכיול 28.5 G ולחץ בחוזקה על הבוכנה כדי להוציא בועות אוויר גדולות. לאחר מכן, הנח קליפה (thimble) על האצבע המורה השמאלית, ואחוז בזהירות באוזנו של העכבר בין האגודל השמאלי לקליפה, כאשר הצד הוונטרלי של האוזן פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, החליקו את המחט, כאשר הצד האלכסוני פונה כלפי מעלה, אל תוך הדרמיס בשליש החיצוני של הפינה (pinna), במרחק קל מהמרכז, והזריקו באיטיות 10 µL של אמולסיה אל תוך הרקמה. לאחר ההזרקה לכל החיות, עקבו אחר העכברים עד להחלמתם המלאה. שלושה ימים לאחר החיסון, בצעו הרחבה של ורידי הזנב (vasodilate) בחיות המוזרקות, כפי שהודגם זה עתה.לאחר ההרדמה, קבע את זנבו של העכבר הראשון באמצעות פינצטה. נקה את הזנב בעזרת סמרטוט אלכוהול, ולאחר מכן החלק בזהירות קטטר מחט במידה 30.5 לתוך וריד צדי בזנב, ובדוק את פתוחותו על ידי הפעלת לחץ עדין על בוכנת המזרק. כאשר הקטטר במקומו, מרח טיפה אחת עד שתיים של דבק רקמות סיאנואקרילט על נקודת ההזרקה, והמתן לייבוש הדבק למשך כ-30 שניות.לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לקצץ בזהירות את השפם ואת הפרווה מהחלק האחורי ומצדי האוזן. בשלב הבא, השתמשו במקלון צמר גפן כדי להרטיב את המשטח הפנימי של האוזן ב-PBS. לאחר מכן סובבו את העכבר, והצמידו את האוזן המוזרקת לזכוכית כיסוי (cover slip) מספר 1.5 בגודל 24 על 50 מילימטר, עד שהיא תהיה מיושרת עם הזכוכית.ספגו את ה-PBS העודף. לאחר מכן, השתמשו בשני זוגות של פינצטות קמורות כדי לתפוס פיסת סרט בד באורך של כ-20 מילימטרים לאורכה בפינות העליונות, והניחו את חלקו התחתון של הסרט על לוכית הכיסוי בחלקו העליון של אוזן העכבר. גלגלו את הסרט על שאר האוזן, תוך דחיפת שיער עודף מהדרך בעזרת הפינצטות במידת הצורך, והשתמשו במקלון צמר גפן יבש כדי להצמיד בעדינות את הסרט סביב האוזן כדי להבטיח איטום הדוק, תוך הקפדה לא ללחוץ על האוזן עצמה.חיוני להדביק את האוזן כראוי לזכוכית כיסוי עם אטום טוב משני הצדדים ובמינימום בועות אוויר, שכן הדבר ישפיע על איכות התמונות שניתן יהיה להשיג. כעת הדביקו פלטפורמת דימוי למיקרוסקופ פלואורסצנטי לבלוק חימום של 37 degree Celsius, ומרחו גריז ואקום לשני צידי אזור האוזן של הפלטפורמה. סובבו את העכבר כדי להניח את זכוכית הכיסוי על הפלטפורמה, תוך הקפדה ליישר את האוזן במרכז הלבד.לאחר שהאוזן הונחה במקומה, הצמדו את קונו האף של ה-isoflurane למחזיק שעל הפלטפורמה, תוך וידוא שהקונו יציב ומכסה לחלוטין את אפו של העכבר. לאחר מכן, השתמשו במקלון צמר כדי ללחוץ בחוזקה אך בזהירות את זכוכית הכיסוי על פלטפורמת הדימיג', כדי לפרוס את גריז הוואקום מתחת לזכוכית הכיסוי. גלגלו שתי חתיכות סרט דביק באורך 20 מילימטר ושתי חתיכות ארוכות יותר סביב החלק העליון של הפלטפורמה כדי להצמיד את זכוכית הכיסוי לפלטפורמה.כעת, העבירו את העכבר לבמה של המיקרוסקופ.יבתו את הפלטפורמה בעזרת סרט דבק נוסף, ומרחו שכבה כפולה של גריז ואקום על לית הסגירה מסביב לאוזן. לאחר מכן, עטפו את העכבר בשמיכה מחממת מלאה במים, ומלאו את מאגר גריז הוואקום במים מזוקקים בטמפרטורה של 37 °C.עבור דימוי Time lapse In Vivo, התחילו במיקום העדשה מעל מרכז האוזן, והורידו את העדשה עד שתבוא במגע עם פני השטח של המים במאגר. לאחר מכן, באמצעות מקור אור חיצוני, הורידו לאט את העדשה עד שפני השטח של האוזן יתמקדו. לאחר מכן, הורידו את הווילונות הפנימיים והחיצוניים מסביב לבמה של המיקרוסקופ, וכווננו את אורך גל הלייזר ל-900 nanometers בחלון בקרת הלייזר של ה-MP, את עוצמת הלייזר בחלון הגדרות הלייזר של הרכישה, ואת מתחי ה-PMT בחלון בקרת רכישת התמונה.בחלונות הגדרות הגודל והמצב (size and mode) של הרכישה, הגדירו את המיקרוסקופ לרזולוציה של 512 על 512 פיקסלים, עם זמן שהייה (dwell time) של 2 µs לפיקסל, ובחרו ב-XY repeat כדי להפעיל מצב דימוי חי לסריקה דרך הרקמה. לאחר איתור שדה דימוי מתאים, אתרו את התא הגבוה ביותר בדרמיס, ולחצו על כפתור set zero כדי להגדיר את מיקום ה-Z לאפס. גלגלו מטה בכיוון ציר ה-Z כדי למדוד את עומק התא.לאחר מכן, הגדירו את נקודות ההתחלה והסיום בחלון הגדרות הרכישה של המיקרוסקופ, וכווןו את מתחי ה-PMT של המכשיר ואת הספק הלייזר בחלון ה-Z בהיר כדי למטב את ויזואליזציית התאים לכל עומק שדה הדמיון. בדקו את כפתורי העומק והזמן, והגדירו מסנן משותף לסריקת התמונה שלוש פעמים לשורה בחלון מצב המסננים של בקרת רכישת התמונה. התאימו את עומק פרוסות ה-Z בחלון המיקרוסקופ של רכישת התמונה כך שדרוש כדקה אחת ללכידה של מחסנית (stack) מלאה, כפי שמופיע בחלון תצוגת הזמן.לאחר מכן, כדי להעריך את יציבות הרקמה, הגדירו את מספר החזרות לחמש בחלון הגדרות הרכישה של סריקת הזמן (time scan), ולחצו על כפתור הסריקה כדי ללכוד תמונת Time-lapse של האזור למשך חמש דקות. אם הרקמה יציבה לאחר חמש דקות, הגדירו את מספר החזרות לבין 30 ל-45 בחלון הגדרות הרכישה של סריקת הזמן, ואספו תמונת Time-lapse למשך 30 עד 45 דקות, תוך ניטור כל סחיפה (drift) מינורית של הרקמה בזמן איסוף התמונה. שמרו את התמונה שלפני הוספת הנוגדן בפורמט המתאים, ולאחר מכן שאבו את תערובת הנוגדנים למזרק טוברקולין של 1 mL, תוך הקפדה על הסרת כל בועות האוויר.לחצו בעדינות על הבוכנה כך שתיווצר טיפה של תמיסת הנוגדנים בקצה המחט, והרימו את המסכים מסביב לבמה כדי לאתר את הקתטר. החליפו את מזרק ה-PBS במזרק הנוגדנים, ולאחר מכן הזריקו לאט את הנוגדנים אל תוך הקתטר. לאחר שהנוגדנים הוזרקו בהצלחה, הורידו שוב את המסכים ורשמו את זמן ההזרקה.לאחר מכן, התחילו מיד באיסוף רצף הדמיה חדש של 20 עד 40 דקות, באותו מיקום, תוך שימוש בהגדרות המכשיר ששימשו להדמיה שלפני מתן הנוגדן. לבסוף, שמרו את קובץ ההדמיה שאחרי מתן הנוגדן בפורמט המתאים, והסירו בזהירות את העכבר משולחן המיקרוסקופ, תוך מעקב אחר בעל החיים עד להחלמה מלאה. הדמיה של דרמיס האוזן השלם באמצעות פרוטוקול זה מקלה על רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה ובשיטת time lapse של דינמיקת תאי T אפקטוריים בדרמיס המודלק.בסרטון זה, ניתן להבחין בתאי T אפקטורים שעברו העברה אדופטיבית (בצבע ירוק) נעים ברחבי רקמת העור. עם זאת, לאחר מתן נוגדנים חוסמי entogrin מסוג antibeta one ו-antibeta three דרך הקטטר, התאים שהיו ניידים קודם לכן נעצרים בתוך הדרמיס. התאים מראים מהירות ממוצעת מופחתת לאחר מתן הנוגדנים, וכן ירידה משמעותית במדד הטיול (meandering index) שלהם.כלומר, היחס בין ההעתקה הכוללת לאורך המסלול הכולל. פלואורסצנציה עצמית מזקיקי שיער, הצללה ופלואורסצנציה עצמית משיער המכסה את האזור, ובועות אוויר הלכודות בין פני האוזן לכיסוי הזכוכית, עלולים לגרום לארטיפקטים של דימוי, אשר מסתירים את הדמיון של תאי T ומפריעים לתוכנה האוטומטית לניתוח תמונות. בנוסף, שימוש במקורות חום מרובים עלול לגרום לבעיות ביציבות הרקמה, מה שמוביל לתנודות גדולות במהלך הדימוי המקשות על פרשנות התוצאות.לאחר השליטה בטכניקה, דימוי תאי CD4 T בדרמיס יכול להסתיים בתוך שתיים עד שלוש שעות, אם הפרוצדורה בוצעתה נכון. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לפעול לפי הנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המתאימות לעבודה עם עכברים. ניתן להתאים פרוצדורה זו לצורך ויזואליזציה של תתי-אוכלוסיות אחרות של תאי T או סוגים אחרים של תאי מערכת החיסון באוזן, באמצעות מודלים שונים של זיהום, או שיטות שונות להשראת דלקת.לאחר פיתוחה, סלילה הדרך של הדמיה תוך-חיה (intravital imaging) אפשרה לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את הדינמיקה של תגובות חיסוניות מתמשכות בבעלי חיים חיים. זכרו כי עבודה עם לייזר רב-פוספורי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון מיגון מתאים, בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות דלקת בדרמיס של אוזן עכבר, וכיצד להשתמש בהדמיה תוך-חיה כדי ללכוד תמונות Time-lapse של פעילות תאי CD4 T לפני ואחרי מתן נוגדנים.

imaging-cd4-t-cell-interstitial-migration-in-the-inflamed-dermis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר הדמיה של תאי CD8 T חודרי גידול תושבים המסומנים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטית בתוך פרוסות גידולי ריאה אנושיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי CD8 T באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T באזורי גידול שונים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

הפרוטוקול כדי לזהות תאי T מסוג CD4 עצמי תגובתי במוח ולב על ידי צביעה ישירה עם הכיתה השנייה dextramers המורכב histocompatibility הגדול תואר בדוח זה. לניתוח מקיף, שיטה אמינה כדי למנות את התדרים של תאים מסוג CD4 + T אנטיגן הספציפי באתר היא גם המציאה.

באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility

הדמיה תוך-חיונית יציבה ברזולוציה גבוהה של תאי חיסון בכבד היא מאתגרת. כאן אנו מספקים שיטה רגישה ואמינה ביותר לחקר נדידה ואינטראקציות תאים-תאים של תאים חיסוניים בכבד עכבר לאורך תקופות ארוכות (כ-6 שעות) על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר רב-פוטוני תוך-חיוני בשילוב עם ניטור טיפול נמרץ.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

מתואר מבחן בעכברים למעקב אחר נדידת תאים מהעור לבלוטת הלימפה המנקזת המאפשר אפיון של תאים דנדריטיים בעור המגויסים לבלוטת הלימפה לאחר זיהום כרית כף הרגל ב-Bacille Calmette-Guérin.

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש תאים חיסוניים בתוך מטריצה תלת מימדי (3D) קולגן באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. פרוטוקול זה מרחיב כיצד לעקוב אחר נדידת תאים ב- 3D. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים השעיה מטריקס תלת-ממד.

מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

. הנה, נדגים את שיטות ויוו כימות של ליקוציט יציאה מן תמימה, מודלק, והעור מאתר ממאיר. אנו לבצע השוואת עפות בשני דגמים: transdermal FITC יישום, בחיי עיר photoconversion. יתר על כן, נדגים את התועלת של photoconversion עבור מעקב אחר ליקוציט היציאה של גידולים עורית.

לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

הדמיה ב-vivo של המפרקים היא טכניקה חשובה לחשיפת התנהגות הנדידה של לויקוציטים ודינמיקה מולקולרית בתוך המפרקים הדלקתיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להדמיה בתוך המפרקים באמצעות מודל עכברי לדלקת מפרקים מסוג II המושרה על ידי קולגן (CIA).

In Vivo הדמיה חושפת את ההתנהגות הנדידה של לויקוציטים בתוך המפרקים

למדו הדמיה תוך-חיים של תאי T CD4 בעור דלקתי. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת תאי חיסון בעכברים בצורה מינימלית פולשנית וללמוד על תנועתם בבלוטות.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

גלה סרטונים נוספים