מודל Microfluidic של Biomimetically נשימה ריאתי acinar איירווייס
9 במאי 2016
נעשה שימוש בליתוגרפיה רכה כדי לייצר מודל מייצג בקנה מידה אמיתי של דרכי נשימה ריאתיות המתרחבות ומתכווצות מעת לעת, ומחקות תנועת נשימה פיזיולוגית. פלטפורמה זו משחזרת זרימות אצינריות נשימתיות על שבב, וצפויה להקל על חקירה ניסויית של דינמיקת אירוסול בשאיפה ושקיעה באצינוס הריאתי.
המטרה הכוללת של מערכת מודל זו, היא לחקות את הגיאומטריה ותנועת הנשימה של Acinus הריאתי לחקר דפוסי זרימת האוויר של Acinar ומסלולי מיקרו-חלקיקים הנישאים באוויר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תופעות התחבורה של Acinar. כגון, ההשפעות של כוח הכבידה, התרופה והדיפוזיה על תוצאות שקיעת החלקיקים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהניסויים נעשים בתוך מודל בקנה מידה אחד לאחד ולא במודל מוגדל. זה מאפשר תצפית מדויקת על תנועה בראונית של חלקיקים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול באינהלציה, מכיוון שניתן להשיג הבנה טובה יותר של שקיעת תרופות בתרסיס.
כדי להתחיל, השתמש בתחריט יונים תגובתי עמוק של סיליקון על פרוסת מבודד כדי לייצר פרוסת סיליקון ראשית כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, ערבבו את ה-PDMS וחומר הריפוי ביחס משקל של עשרה לאחד בתוך מיכל קטן ונקי. הסר את התערובת בחומר ייבוש בוואקום עד להסרת כל בועות האוויר.
מניחים את הוופל הראשי בצלחת פטרי, ויוצקים את תערובת ה-PDMS נטולת הגז לגובה של כמילימטר אחד מעל הוופל הראשי. הסר את ה-PDMS שנשפך שוב למשך 40 דקות לפחות, עד שכל בועות האוויר מוסרות מעל הוופל, והבועות מתחת לפרוסה ממוזערות. וודאו שהרקיק קרוב ככל האפשר לתחתית הצלחת.
במידת הצורך, לחץ את הוופל בעדינות לתחתית בעזרת שני מקלות ערבוב ודגאס שוב. לאחר מכן, אופים את ה-PDMS בחום של 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בתנור הסעה טבעי. בזמן שה-PDMS אופה, תייק את חלק הקנה של מזרק פלסטיק של שני מיליליטר, באמצעות נייר חול חצץ דק כדי לשפר את הדבקותו ב-PDMS.
בנוסף, השתמש בנייר החול כדי לשטח את בסיס חבית המזרק על ידי הנחת נייר החול על משטח ישר והחלקת בסיס חבית המזרק מעליו. נקה כל פסולת מהמזרק באמצעות אוויר בלחץ. לאחר מכן הנח את חלק הקנה של המזרק על גבי שכבת ה-PDMS הראשונה כשהפתח הגדול פונה אל פני השטח של ה-PDMS.
יוצקים שכבה שנייה של PDMS על גבי הראשונה, לגובה של כחמישה מילימטרים, תוך הקפדה על כך שה-PDMS לא ייכנס לקנה המזרק. לאחר מכן, הסר את ה-PDMS שוב. אופים את כל הסט-אפ בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות בתנור הסעה טבעי כדי להקשיח את ה-PDMS.
חותכים את תבנית ה-PDMS סביב האזור המעוצב של פרוסת המאסטר בעזרת אזמל. בזמן החיתוך, האזמל צריך לגעת חלש במשטח הוופל. לאחר מכן, הכנס בעדינות כלי דק, כגון מלקחיים רקיקים, לחריץ שנוצר על ידי האזמל, וקילף את יציקת ה-PDMS מהפרוסה הראשית.
הנח את הגבס על משטח רך מכוסה בנייר אלומיניום, כך שהצד המעוצב פונה כלפי מעלה ונקב חור ב-PDMS בכניסת התא וכניסת התעלה, באמצעות אגרוף ביופסיה של מילימטר אחד. לאחר מכן, הוסף חלק מה-PDMS עם חומר ריפוי למגלשת זכוכית נקייה וסובב שכבה דקה ב-3,000 סל"ד למשך 30 שניות. לאחר מכן, אופים את השקופית בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.
נקה את השקופית ואת יציקת ה-PDMS באמצעות סקוטש. טפל במשטחי מגלשת הזכוכית המצופה וב-PDMS המעוצב בפלזמת חמצן באמצעות מטפל קורונה. שימו לב שיש לטפל בכל משטח למשך דקה אחת לפחות.
לאחר מכן, לוחצים בעדינות את המשטחים יחד ואופים אותם למשך הלילה בחום של 65 מעלות צלזיוס. מערבבים מים חלקיקי פוליסטירן פלואורסצנטיים תלויים עם מים וגליצרול בכוס נבלה כדי לקבל יחס נפח לנפח של 64 עד 36 של גליצרול למים המכילים 0.25% חלקיקים לפי משקל. לאחר מכן, הניחו טיפה מתמיסת הגליצרול על גבי כניסת התעלה וטיפה של מי DI על כניסת החדר.
לאחר מכן, הנח את המכשיר בתוך מייבש ומשוך ואקום למשך כחמש דקות. לפני שחרור הוואקום, המתן עד שהבועות שנוצרות בטיפות תמיסת הגליצרול ומי DI יתפוצצו. עם שחרור הוואקום, הנוזלים נשאבים לתוך החללים שבתוך המכשיר.
אם נשאר אוויר שיורי בתוך התעלות, הסר אותו על ידי הפעלת לחץ חיצוני על הנוזלים באמצעות מזרק ואפשר לאוויר להתפזר לתוך ה-PDMS. לאחר מכן, הזריקו כשני מילימטרים של מים נטולי יונים לתא העליון עד שהוא מתמלא במים במלואו. לאחר מכן, כסו את החדר בקצה מזרק קהה בגודל 19
.חותכים את הקצה של קצה מזרק קהה אחר בגודל 19 ומכניסים את הקצה הזה לכניסת התא הצדדי. חבר את שני קצות המזרק למזרק מיליליטר אחד באמצעות צינורות טפלון דקים ומחבר בצורת T. ודא שמזרק מיליליטר אחד, צינורות טפלון, מחבר בצורת T ותא עליון מלאים כולם במים, ללא בועות.
לאחר מכן, חבר את המזרק של מיליליטר אחד למשאבת מזרק ותכנת אותו לחקות מחזור נשימה שקט של כותרת כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. על מנת לקבל תמונות סימטריית וילו של מיקרו-חלקיקים, הנח את המכשיר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. לאחר מכן, הפעל את לייזר Nd:YAG הכפול וטען את תוכנת ניתוח התמונה במחשב.
בזמן הפעלת המכשיר, קבל סדרה של תשעה עד שתים עשרה תמונות מסגרת כפולה נעולות פאזה של זרימת זרעי החלקיקים, באמצעות מערכת סימטריית וילו תמונה של מיקרו-חלקיקים בהתאם למפרט היצרן. כדי להשיג תמונות מסגרת כפולה נעולות פאזה, רכוש סדרת מסגרות כפולות ב-10 הרץ. לאחר מכן, ארגן מחדש את הנתונים כך שכל הזוגות הממוסגרים המופרדים על ידי זמן מחזור מלא יוצרים סדרת זמן חדשה.
השתמש באלגוריתם סכום המתאם כדי לחשב מפת וקטור מהירות נעולה פאזה כך ששדה הזרימה המתקבל מסדרת התמונות. חזור על תהליך זה מספר פעמים עם זמני השהיה משתנים בין המסגרת הראשונה והשנייה של כל זוג מסגרות לפתרון אזורי זרימה שונים בתוך חלל המכתשית. לאחר מכן, השתמש בתוכנית ניתוח נתונים כדי לתפור יחד את מפות הזרימה הבודדות למפה מלאה ומפורטת של דפוסי זרימה על ידי ממוצע נקודות נתונים חופפות.
מאפיין קריטי של פלטפורמת האצינר המיקרו-נוזלית המוצגת כאן, הוא יכולתה לשחזר תנועות נשימה מציאותיות מבחינה פיזיולוגית הגורמות לפרופילי זרימה פיזיולוגיים ומהירויות בתוך צינורות אצינרים ובתוך נאדיות. פרופילי מהירות הזרימה לרוחב הערוצים מראים ירידה מתמדת של קצבי הזרימה לעבר דורות אקינאריים עמוקים יותר. פרופילי זרימה ליד ובתוך חללים מכתשית מראים שעוצמות הזרימה יורדות בתלילות לאורך הפתח של הנאדיות.
כתוצאה מכך מהירות זרימה איטית יותר בשניים עד שלושה סדרי גודל בתוך הנאדיות בהשוואה לתעלות. בנוסף, דפוסי הזרימה משתנים במידה ניכרת עם הגדלת ייצור האצינר. בעוד שהדור הראשון כולל אזור סירקולציה מחדש, החופף בערך למרכז הנאדיות, הדור השלישי מאופיין באזור סירקולציה מחדש המוסט לכיוון הצד הפרוקסימלי של הנאדיות עם דפוס קו זרם פתוח יותר.
לבסוף, קווי זרם רדיאליים ללא אזור מחזור מחדש נצפים בדור החמישי של המכשיר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, המאפשר הדמיית זרימה בגיאומטריות אצינריות, ניתן להשתמש בפלטפורמה כדי לעקוב אחר חלקיקים בודדים הנישאים באוויר על מנת לחקור את הדינמיקה והמיקום של חלקיקים נשאפים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מודל בקנה מידה אמיתי של דרכי נשימה אלבואולריות בריאה, שתוכנן לשחזר את תנועת הנשימה הפיזיולוגית. המודל מאפשר חקר של דינמיקת אירוסול שנשאף והשקעתו בתוך האקינוס הראתי.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- פיזיולוגיה של מערכת הנשימה
- דינמיקת אירוסול
- טיפול בשאיפה
רקע
- האקינוס הריאתי (pulmonary acinus) הוא קריטי להחלפת גזים ולהשקעת אירוסול.
- הבנת דפוסי זרימת האוויר ומסלולי החלקיקים חיונית לבריאות הנשימה.
- ייתכן שמודלים מסורתיים אינם מייצגים במדויק תנאים פיזיולוגיים אמיתיים.
- ליטוגרפיה רכה (Soft-lithography) מאפשרת יצירת מודלים מדויקים בקנה מידה של 1:1.
מטרת המחקר
- לחקות את הגאומטריה ואת תנועת הנשימה של ה-pulmonary acinus.
- לבחון את דפוסי זרימת האוויר ב-acinus ואת מסלולי תנועה של מיקרו-חלקיקים הנישאים באוויר.
- לחקור את השפעות כוח הכבידה, התרופה והדיפוזיה על תוצאות שיקוע החלקיקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ליתוגרפיה רכה לייצור המודל.
- התקנה ניסיונית לסימולציית תנועת נשימה.
- תצפית על תנועה בראונית של חלקיקים בתוך המודל.
- ניתוח של דינמיקת השקעה של תרופות בארוסול.
תוצאות עיקריות
- המודל מדמה בהצלחה תנועת נשימה פיזיולוגית.
- הושגה תצפית מדויקת על מסלולי החלקיקים.
- התקבלו תובנות לגבי השפעתם של גורמים שונים על שיקוע חלקיקים.
- לממצאים יש השלכות על שיפור טיפולים בשאיפה.
מסקנות
- מודל זה, בקנה מידה אמיתי, משפר את ההבנה של דינמיקת אירוסולים ב-pulmonary acinus.
- הוא מספק כלי בעל ערך למחקרים עתידיים בתחום הבריאות הנשימתית.
- טכניקה זו עשויה להוביל להתקדמות באסטרטגיות של טיפול בשאיפה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל מיקרופלואידי זה מאפשר סימולציה רלוונטית פיזיולוגית של זרימת אוויר והסעה של חלקיקים באצינרי פולמונריים, ובכך הוא נותן מענה לפער קריטי בפיתוח טיפולי שאיפה פרה-קליניים. על ידי שחזור תנועות נשימה בקנה מידה אמיתי ותופעות זרימה אצינריות, הפלטפורמה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מועמדים לתרופות באסורול באמצעות תצפית ישירה על דינמיקת השקיעה באזורים אלבולריים. יכולת זו משפרת את הביטחון החוזאי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור תכונות הפורמולציה לתוצאות פולמונריות, ללא הסתמכות על מודלים מוקשריים או מודלים במקריות שונה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות להובלה ולשיקוע של אירוסול בדרכי הנשימה האצינריות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הדירה להערכת האופן שבו משתני פורמולציה משפיעים על מסלולי חלקיקים באזורים אלבאולריים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של זרימה ומעקב אחר חלקיקים המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות במחקרי שאיפה.
- ערך תפעולי: תומך בסריקה ניתנת להרחבה של פורמולציות אירוסול באמצעות ולוסימטריה של תמונות חלקיקים (PIV) התואמת למיקרופלואידיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מגשר בין שלב הגילוי לשלבים הפרה-קליניים באמצעות מידול של גיאומטריות אצינריות רלוונטיות לבני אדם ותנועות נשימה.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים באמצעות ויזואליזציה ישירה של דפוסי שיקיעת חלקיקים באזורי הריאה העמוקים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
הפלטפורמה משתלבת בתהליכי זרימה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי התנהגות הארוזול לפני אופטימיזציית המולקולות המובילות, ובכך מסייעת לתכנון הפורמולציה באמצעות נתונים אמפיריים של זרימה ושיקיעה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי האופן שבו גורמים כבידתיים, דיפוזיוניים וגורמי פורמולציה משפיעים על שיקוע חלקיקים בצינורות האצינריים ובנאדיות.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקה באמצעות יצירה הדירה של פרופילי זרימה ריאליים מבחינה פיזיולוגית לאורך חמישה דורות אצינריים.
- אנליטיקה: מספקת מפות וקטורי מהירות ברזולוציה גבוהה ונתוני מסלול חלקיקים באמצעות μPIV לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני על ידי מידול דינמיקה של נוזלים בנאדיות בקנה מידה אנושי, הרלוונטית להערכת טיפולים בשאיפה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת מודולרית לבדיקה איטרטיבית של פורמולציות על פני מחלקות תרופות ומכשירי הולכה מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בהסעה של אירוסול על ידי אספקת נתונים ישירים ונצפים של זרימה ותנועת חלקיקים במבנים אצינריים (acinar) ביומימטיים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות ייצור בקנה מידה של 1:1 והפעלה של דפנות מונעת לחץ המדמה נשימה פיזיולוגית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי אפשור חיזוי מוקדם של יעילות שיקוע אזורית, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים של פיתוח תרופות ריאתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע לתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפול בשאיפה, בהתבסס על פרופילי שיקוע אצינריים מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בליתוגרפיה רכה, ייצור מיקרופלואידי ווולוסימטריה של תמונות חלקיקים (particle image velocimetry) לצורך הרכבת המכשיר וניתוח הזרימה.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים הפוכים, לייזרים פועמים ומערכות סנכרון לצילום μPIV נעול-פאזה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין מדעני פורמולציה, מהנדסי ביו-רפואה ומומחי דימות לצורך ביצוע ניסיוני עקבי.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת המודל לסוגי חלקיקים מעבר לפוליסטירן פלואורסצנטי, כגון צפיפות או היגרוסקופיות משתנה.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לנגישות אופטית לאזורי אלבולואריים עמוקים ולצורך בנוזלים להתאמת מדד שבירה (index-matching fluids) כדי למזער עיוות אופטי.
