מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange
5 בפברואר 2016
הקמנו את מערכת ה-PSmOrange הניתנת להמרה ככלי רב עוצמה, ישר קדימה וזול למעקב אחר תאים in vivo ברקעים טרנסגניים של GFP. פרוטוקול זה מתאר את יישומו במערכת המודל של דג הזברה.
המטרה הכוללת של טכנולוגיית המרת התמונות של PSmOrange היא לעקוב אחר תאים בבעל חיים במהלך התפתחות עוברית ומחלות. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית כגון חשיפת מקורם של תאים המתפתחים לרקמות ואיברים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה על רקע טרנסגני GFP.
ניתן ליישם שיטה זו גם בתחומי מחקר שונים כגון התחדשות, התקדמות גידול ופלישה. לאחר יצירה והטמעה של עוברים המבטאים PSmOrange ו-GFP בהתאם לפרוטוקול הטקסט, הנח את העובר מתחת למיקרוסקופ הקונפוקלי והשתמש במטרת האוויר פי 20 ובלייזרים של 488 ו-561 ננומטר כדי לסרוק את הדגימה כדי לזהות אזור להמרת פוטו. כדי לזהות את חלבון ה-PSmOrange לפני המרת האור, השתמש בלייזר 561 ננומטר בהספק של 0.74 מילי-וואט הנמדד במישור המיקוד מעל המטרה והתאם את עוצמת הלייזר לפי הצורך.
התאם את גורמי הזום כדי להדגיש את אזור העניין ולהפחית את זמן רכישת התמונה ואת רעילות הצילום. באמצעות הלייזרים 488 ו-561 ננומטר במצב רציף וצעד Z בין 1.0 ל-2.0 מיקרומטר, רכשו מחסנית Z המכסה את המבנים המעניינים. התאם את ממוצע הקווים ואת תדירות הסריקה כדי למטב את איכות התמונה.
לאחר מכן סרוק את הדגימה ובחר את אזור העניין, או את כלי ההחזר על ההשקעה, כדי להדגיש את האזור להמרת פוטו לפני תיקון ההחזר על ההשקעה כאזור הגירוי. בחר את מודול ההלבנה של הפוטו-אקטיביזציה, סמן את התיבה כדי להפעיל את הלייזר של 488 ננומטר, ולאחר מכן הגדר את הלייזר של 488 ננומטר ל-80% ואת מהירות הסריקה ל-0.5 שניות למסגרת. לאחר מכן, פתח את כלי השירות להמרת תמונות ולחץ על הוספה כדי לציין את פרוטוקול המרת התמונות.
בתפריט גירוי הרכישה, הגדר את שלב ראשון לרכישה ובתפריט הלולאות, ציין את מספר התמונות שיש לרכוש לפני המרת התמונות. הגדר את השלב השני לגירוי והזן את מספר אירועי הגירוי שיש לבצע. התאם את השלב השלישי כמתואר עבור השלב הראשון.
לחלופין, הוסף שלב המתנה לאחר שלב שני על-ידי הזנת זמן ההמתנה לפני הסבב האחרון של רכישת התמונה. לאחר הגדרת הפרמטרים, החל את הגדרת הגירוי והפעל את המרת הצילום. הגדרות מיזרוסקופיות הן חיוניות להמרת פוטו של PSmOrange.
כדי להבטיח המרה מוצלחת באור, העובר מצולם מיד לאחר הניסוי כדי לזהות את חלבון ה-PSmOrange שהומר לאור. אם ההמרה לא הצליחה, ההליך חוזר על עצמו. שימוש בלייזרים של 488, 561 ו-640 ננומטר, והגדרת הלייזר של 640 ננומטר להספק גבוה, עד 4.5 מילי-וואט, רוכשים מחסנית z סופית עם ההגדרות שתוארו זה עתה.
כדי להוריד את העובר, הסר את החדר מהמיקרוסקופ והשתמש במלקחיים כדי להוציא את העובר מהאגרוז. העבירו את העובר לצלחת פטרי חדשה מפלסטיק מעוקרת, או צלחת מעוקרת בת 6 בארות, המכילה 0.2 מילי-מולרי PTU ב-E3. דגירה על העובר בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד לשלב ההתפתחות הרצוי. כדי לנתח את גורלם של תאים המבטאים חלבון PSmOrange שהומרו לאור, הטמיעו מחדש את העובר בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
תחת המיסקרוסקופ הקונפוקלי, סרוק את הדגימה כדי לזהות תאים שהומרו באור במבנה הטרנסגני GFP המעניין. השתמש בלייזרים 488, 561 ו-640 ננומטר כדי לרכוש ערימת z עם ערימה קבועה של 1 עד 2 מיקרומטר באופן רציף המכסה את המבנים. באמצעות תוכנת Image J Fiji, זהה תאים המבטאים במשותף GFP וחלבון המרת האור.
שכפל את ערימת המקור, השתמש בתוסף Gaussian Blur ובמחשבון התמונות כדי להחסיר את הערימות החלקות מהמקור. החל ספים ספציפיים על הערוצים הירוקים והאדומים הרחוקים על מנת להדגיש את התאים שהומרו לאור. לאחר מכן השתמשו בכלי Analyze Particles כדי לזהות את אזורי הסף בערוץ הירוק עם הגדרה מתאימה.
חזור על שלב זה עבור הערוץ האדום הרחוק. פתח את תוסף מחשבון התמונות כדי לזהות את התאים המשותפים. הצג בצהוב את ההחזר על ההשקעה החופף בערוץ הירוק או האדום הרחוק באמצעות הכלי ניתוח חלקיקים.
באמצעות תוכנת NIS-Elements, בצע הערכת תאריך תלת-ממדית והצג את הערימה בתלת-ממד באמצעות האפשרות Show Volume View. לאחר מכן השתמשו בממשק הגרפי לבחירת הערוצים הירוק, האדום והאדום הרחוק, התאימו את הבהירות והניגודיות וחתכו את הערימה התלת-ממדית כדי להדגיש את האזור שהומר לאור. מוצגת כאן דוגמה למערכת הפוטו-קוגרסיה PSmOrange בעוברי GFP טרנסגניים של דגי זברה FOXD3 עם ראש צף.
26 שעות לאחר ההפריה, שני אשכולות תאים בחלק הקדמי של בלוטת האצטרובל הומרו לאור וצולמו מיד. החלבון זוהה בלייזר אדום רחוק של 640 ננומטר אך לא בלייזר של 561 ננומטר. בתאים אלה, ביטוי GFP הופחת בתחילה עקב פוטו-הלבנה.
ב-52 HPF, GFP ו-H2B PSmOrange זוהו בתאים המבטאים חלבון H2B PSmOrange שהומרו לאור. כמה מהתאים הללו יצרו את ה-parapineal בצד שמאל של המוח. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על מקור התא הפראפינאלי באצטרובל הקדמי ומראה את הישימות של טכניקת PSmOrange בעובר חולייתנים טרנסגני GFP חי.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע את ניתוח מעקב התאים בעוברים שעברו מניפולציה גנטית על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות להיררכיות המולקולריות העומדות בבסיס התפתחות התא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מערכת PSmOrange היא כלי יעיל מבחינה כלכלית למעקב אחר תאים in vivo ברקעים טרנסגניים של GFP, ובמיוחד במודלים של דגי זברה. פרוטוקול זה מקל על חקר מקור התאים במהלך ההתפתחות העוברית ובמחלות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- מעקב אחר תאים
- התפתחות עוברית
רקע
- טכנולוגיית המרת תמונות של PSmOrange מאפשרת מעקב אחר תאים באורגניזמים חיים.
- שיטה זו ישימה בתחומי מחקר שונים, כולל רגנרציה והתקדמות גידולים סרטניים.
- ניתן להשתמש בה ברקעים טרנסגניים של GFP, דבר המגביר את ורסטיליותה.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת להדמיה ולהמרה פוטונית של תאים.
מטרת המחקר
- למעקב אחר תאים במהלך ההתפתחות העוברית ותהליכי מחלה.
- לחשיפת מקוריהם של תאים המתפתחים לרקמות ואיברים.
- לספק תובנות לגבי התנהגויות תאיות בהקשרים ביולוגיים שונים.
שיטות שהשתמשו בהן
- יצירת עוברים המבטאים PSmOrange ו-GFP.
- הטמעת עוברים לצורך ניתוח במיקרוסקופיה קונפוקלית.
- שימוש בלייזרים בעלי אורך גל של 488 ו-561 nm לצורך הדמיה.
- פוטו-המרה של חלבון PSmOrange למטרות מעקב.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר תאים במודלים של דגי זבראפיש באמצעות מערכת PSmOrange.
- הדגמה של יכולת ויזואלית של מקורות התאים והתנהגותם.
- הדגשת התאימות של השיטה לתחומי מחקר ביולוגיים מגוונים.
- אספקת פרוטוקול פשוט וברור לביצוע על ידי חוקרים.
מסקנות
- מערכת ה-PSmOrange היא כלי יעיל למעקב אחר תאים in vivo.
- היא מציעה יתרונות משמעותיים בחקר הביולוגיה ההתפתחותית.
- שיטה זו יכולה לשפר את ההבנה של תהליכים ביולוגיים מורכבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מערכת החלבון הפוטו-המירי PSmOrange מאפשרת מעקב מדויק אחר תאים in vivo בעוברי דגי זהב טרנסגניים ל-GFP, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית במחקרי ביולוגיה התפתחותית שבהם לקווים טרנסגניים קיימים חסרים רפורטרים תואמים למעקב אחר שושלות תאים. יכולת זו תומכת בהורדת סיכונים מכניסטית בתהליכי תיקוף מטרות (target validation) על ידי אפשור ויזואליזציה ישירה של מקורות תאיים והחלטות גורל תאי במערכות רלוונטיות למחלות, ובמיוחד עבור יישומים באונקולוגיה ורפואה רגנרטיבית הכוללים התקדמות גידולים, פלישה והתחדשות רקמות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי אספקת נתונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית על נדידה והבדלה של תאים בתוך אורגניזמים חיים ושלמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות באמצעות מעקב אחר אוכלוסיות תאים מוגדרות ברקעים טרנסגניים, כדי להבהיר את המקור התאי של רקמות ואיברים.
- ערך תפעולי: תואם לקווי GFP טרנסגניים קיימים, מה שמבטל את הצורך ביצירת פרומוטרים חדשים ומקצר את זמן פיתוח המודל.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על החלטות גורל התאים, ובכך משפר את הביטחון בקשרי הסיבתיות בין המטרה למנגנון המחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים מרחביים וזמניים כמותיים על נדידת תאים שעברו המרה פוטוכימית, מה שמאפשר השוואה אובייקטיבית של הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- ערך תפעולי: משתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית עם עירור לייזר סדרתי (488, 561, 640 nm), ואינו דורש ציוד מיוחד מעבר למעבדות דימיג טיפוסיות.
- יכולת הרחבה: תואם לדימיג תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה ולכלי עיבוד נתונים (ImageJ Fiji, NIS-Elements) לצורך ניתוח קולוקליזציה הדיר השמיכה עם GFP.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ישים באופן ישיר לחקר פלישה של תאי גידול ומודלים של גרורות במודלים של סרטן בשימוש בטרנסגנים או בקסנוגרפט של דגי זברה.
- המשכיות תרגומית: מאפשר מעבר חלק משלב הגילוי (מעקב אחר מקור התאים) לוולידציה פרה-קלינית על ידי ניטור השתחתו (engraftment), נדירה והשתלבות של תאים שעברו המרה פוטו-כימית in vivo.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק נקודות קצה ויזואליות וכמותיות להחלטות go/no-go בשלבים מוקדמים של פיתוח פרה-קליני, בהתבסס על התנהגות תאית בהקשרי מחלה רלוונטיים.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
מערכת ה-PSmOrange משתלבת ברצף שבין הגילוי המוקדם לשלב הפרה-קליני, ומשמשת ככלי לסריקה פנוטיפית ותיקוף מכניסטי המגשר בין מניפולציה גנטית לבין תוצאות תפקודיות תאיות במודלים של חולייתים חיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי אפשור מיפוי גורל (fate mapping) של אוכלוסיות תאים ספציפיות בתגובה להפרעות גנטיות או סביבתיות בעוברי GFP טרנסגניים.
- סריקה: מייצרת פלטיים כמותיים סטנדרטיים הניתנים לשחזור (אחוזי קו-לוקליזציה, מרחקי נדידה) המתאימים לסריקות של תרכובות או של מדכאים/מגבירים (suppressor/enhancer) גנטיים.
- אנליטיקה: מפיקה נתוני פלואורסצנציה רב-ערוציים (GFP, PSmOrange כתום/אדום, PSmOrange שהומר פוטו-כימית לאדום רחוק) המאפשרים קו-לוקליזציה וניתוח חלקיקים קפדניים לצורך פנוטיפיקה אובייקטיבית.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מעקב אחר התנהגות תאים במודלים של רגנרציה והתקדמות גידולים, ובכך מספק מידע על התקפות המכניסטית של מטרות.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת של פלטפורמה לשימוש חוזר; הזרקת mRNA מאפשרת פריסה מהירה על פני מספר קווי טרנסגנים מבלי לייצר זנים יציבים חדשים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות על ידי אספקת ראיות ויזואליות ישירות של דינמיקה תאית באורגניזמים שלמים.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות פרוטוקולי פוטו-המרה והגדרות לייזר מוגדרות (488 nm בהספק של 80%, 0.5 sec/frame; 640 nm עד 4.5 mW לזיהוי).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מינוף משאבי GFP טרנסגניים קיימים, ובכך מונע זיהוי פרומוטורים ויצירת קווים de novo יקרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי אספקת נתונים פונקציונליים מוקדמים in vivo על התנהגות תאים, ובכך מפחית כישלונות בשלבים מאוחרים עקב מורכבות ביולוגית בלתי צפויה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית, בטכניקות של המרה פוטונית (photoconversion) ובפירוק ספקטרלי של פלואורסצנציה (fluorescence spectral unmixing).
- תלוי בגישה למערכות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר הכוללות לייזרים של 488, 561 ו-640 nm וערכות מסננים מתאימות.
- מחייב סטנדרטיזציה של בחירת ה-ROI, הספק הלייזר, מהירות הסריקה ופרמטרי z-stack בין משתמשים שונים להשגת תוצאות הדירות.
- התאמה למינים של דגי teleost שאינם דג זברה עשויה לדרוש אופטימיזציה של מנת ה-mRNA ויעילות ההמרה הפוטונית.
- מגבלה מעשית: יעילות ההמרה הפוטונית תלויה ברמות ביטוי החלבון ובנגישות התאים המטרה לחדירת הלייזר ברקמות עבות יותר.
