באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעזור למשתמשים להקים צינור איסוף ועיבוד בתפוקה גבוהה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום טומורגרפיה קריו-אלקטרונית, כגון: כיצד אני מטפל בנתונים שנאספו עם גלאים מהדור החדש, ומעבד כמות עצומה של נתונים המופקים על ידי תוכנת איסוף אוטומטית מסדרת הטיה? היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהמשתמש יכול להגדיר חבילות תוכנה מרובות בצורה מאחדת, למציאת צינור יעיל לעיבוד אוטומטי של סדרת הטיה, המאפשר להשקיע זמן רב יותר בניתוח טומוגרפיה.

בדרך כלל, אנשים חדשים ב-cryo-ET יתקשו מכיוון שנדרשים צעדים מייגעים רבים כדי לטפל בנתונים מסיביים שנוצרו ממיקרוסקופ האלקטרונים. הרעיון לפיתוח זה עלה לראשונה לפני חמש שנים כאשר היינו צריכים לעבור ידנית מאות שלבים כדי לקבל שחזור תלת מימדי של חיידק אחד. מראש, עיין בפרוטוקול הטקסט להכנת תאי המיני-שיגלה פלקסנרי.

לאחר מכן, הכן את רשתות מיקרוסקופ האלקטרונים כפי שהוסבר על ידי פרסום קיים של JoVE ומתועד גם בפרוטוקול הטקסט. לאחר שהעמסתם את שלב ה-EM באוסף של תאים זעירים המוטבעים בקרח מזוגג, התחילו לאסוף מפות בהגדלה נמוכה עבור סדרת ההטיה. בעת צפייה במסך הפלואורסצנטי בהגדלה נמוכה, של בערך פי 2300, מצא ריבועי רשת המקובלים לתמונה.

מיקום זה צריך להכיל קרח דק ונושא העניין ללא מזהמים. לאחר מכן, התאם את התצוגה למרכז ריבוע הרשת, ולחץ על הוסף מיקום במה כפתור כדי לשמור את המיקום. לאחר מכן, חזור על התהליך עד שמיקומם של כל ריבועי הרשת המקובלים יישמר.

השלב הבא מתחיל בפתיחת קובץ מונטאז' חדש. בתיבת הדו-שיח של ההגדרה, הגדר את ה-X וה-Y כך שכל ריבוע הרשת יילכד. עבור רשת סטנדרטית של 200 רשת, צור רווח של 10 על 10 עם ערך Binning גבוה, כמו שמונה.

כמו כן, החלף את שלב ההזזה במקום להזיז את אפשרות התמונה ואת אפשרות הדילוג על מתאמים המשמשים ליישור חלקים. כעת, בחלון הנווט, בחר את מיקום השלב הראשון לרכישה באמצעות מתג הרכישה. המשך לעשות זאת עבור כל עמדת שלב.

לאחר מכן, תחת תפריט הנווט, לחץ על רכוש בנקודות. בתיבת הדו-שיח שנפתחת, החלף את תמונת מפת השגת וצנטריות גסה. בטל את ההחלפה של כל האפשרויות האחרות.

לאחר מכן, לחץ על המשך, ומונטאז' ייעשה עבור כל מיקום במה. המשך לעבוד עם תוכנת SerialEM. בנווט, בחר את המפות שנרכשו ולחץ על טען מפה.

לאחר מכן, לחץ על הוסף נקודות, ובחר את הנקודות במפה שבהן יש לרכוש את סדרת ההטיה. לאחר ביצוע הבחירות, לחץ על הפסק הוספת נקודות וחזור על התהליך עם כל מפה שנאספה. לאחר מכן, פתח את הפרמטרים תחת מצלמה תפריט, והגדר את מצבי פוקוס, ניסיון והקלטה.

האפשרות לתעד נתונים מחולקי מינון עשויה להיות מעניינת במיוחד, וניתן לציין זאת תחת אפשרויות הרשומה. כדי להמשיך, בחר אחת מהנקודות במפה המוצגת כעת, והחלף את אפשרות ההטיה של סדרת בחלון הנווט. בתיבת הדו-שיח שנפתחת, בחר את הפרמטרים לסדרת ההטיה.

לאחר מכן, חזור על התהליך של החלפת אפשרות סדרת ההטיה עבור כל אחת מהנקודות שנבחרו במפה. לאחר מכן, מהנווט התחל את האפשרות רכוש בנקודות. תחת תיבת הדו-שיח, החלף את משימות מקדימות , יישור מחדש לפריט, פוקוס אוטומטי וצנטריות גסה.

לאחר מכן, הגדר את המשימה הראשית לרכישת סדרות הטיה, ובחר סגירת ערכי עמודה בסוף כדי לסגור את העמודה כאשר כל הנקודות נאספו. כאשר התהליך יבוצע, תיאסף סדרת הטיה בכל נקודה המוחלפת לאיסוף סדרת הטיה בכל מפה. עם סדרת ההטיה המקורית, יומן הפלט מ-SerialEM והתמונות המפוצלות במינון הבודד כולם בספריית העבודה הנוכחית, במסוף, בצע את הפקודה הבאה כדי להסיר את חפץ התנועה המושרה על ידי האלומה.

המשך ביישור ובנייה מחדש של סדרת ההטיה. הקלד את הפקודה tomoauto בטרמינל באופן הבא. לפקודה, צרף את שם הקובץ של סדרת ההטיה לעיבוד, ואחריו את הקוטר הנאמן בננומטרים.

אם עיבוד CTF אינו רצוי, פשוט השמט את האפשרות מהפקודה. פקודה זו היא השימוש העיקרי ב-tomoauto, המאפשרת למשתמשים לבצע את כל התהליכים הכרוכים ביישור סדרת הטיה, שבמקור דרשה התערבות ידנית של המשתמש, בפקודה אחת, המאפשרת למשתמשים לסקריפט במהירות עיבוד אצווה. כעת, באמצעות הפקודה 3dmod, עיין בסדרת ההטיה המיושרת לאיתור שגיאות בולטות.

כאן שם הקובץ הוא שמה של סדרת ההטיה ללא סיומת. לאחר מכן, בדוק את ה-CTF המשוער עם הפקודה המוצגת כאן. שוב, שם הקובץ הוא שמה של סדרת ההטיה ללא סיומת.

כמו כן, ביומן הפלט המופק על ידי הפקודה tomoauto, בדוק את השגיאה השיורית של היישור. זהו מדד כמותי של האיכות הכוללת של היישור. אם היישור מקובל, המשך בחישוב השחזור.

פקודה זו מוגדרת לתקן את ה-CTF, ולמחוק את הסמנים הנאמנים המשמשים ליישור מסדרת ההטיה. כדי לדלג על הבדיקה החזותית ולעבור ישירות לשחזור, השתמש בפקודה זו. ל-Tomoauto יש אפשרויות נגישות רבות.

אחת מהן במיוחד היא היכולת לכלול תצורות מקומיות המתוארות על ידי קובץ עזר, על פי התיעוד של tomoauto. כלול את שם הקובץ בתיבת הדו-שיח של שורת הפקודה באמצעות אפשרות התצורה המקומית לפני הוספת שם הקובץ של סדרת הטיה. היכולת ליצור קבצי תצורה מקומיים היא התכונה החזקה ביותר של tomoauto, המאפשרת למשתמשים להגדיר באופן מלא כל פקודה בשימוש, לכוונן את הביצוע למערכי נתונים ספציפיים או קשים תוך שמירה על העיבוד האוטומטי.

בתוך פרוטוקול הבדיקה יש הוראות נוספות כיצד לבצע ממוצע תת-טומוגרפיה. בהתאם לפרוטוקולים המתוארים, שתי סדרות הטיה מיושרות יוצרו עם טומואוטו. היישור העדין מחושב ממודל המגדיר באופן אידיאלי קואורדינטות סמן פידוציאליות.

ב-50 מעלות, סדרת הטיה אחת עקבה אחר חלקיקי הזהב בצורה נכונה, מה שמצביע על יישור מקובל. בעוד שבמקרה של סדרת ההטיה השנייה, מספר נקודות דגם, המוצגות באדום, סטו מסומן הזהב המקביל להן, הממחישות את הדגם לא יצר יישור מתאים. כאשר נאספות סדרות הטיה, tomoauto מיישר בהצלחה 80 עד 90% מסדרת ההטיה שנאספה.

לאחר השחזור, הטומוגרמה הסופית היא נפח תלת-ממדי של דגימת התמונה. לאחר מכן ניתן להשתמש בזה לביאור סלולרי על ידי סגמנטציה, או ממוצע תת-טומוגרפיה כדי לקבל מידע ברזולוציה גבוהה יותר של המנגנון המולקולרי בתוך הדגימה. ממוצע תת-טומוגרפיה של 2.7 ננומטר של שיגלה פלקסנרי המחובר שהופקד ב-EMDB מראה את השיפור הגדול של טכניקה זו על פני צפייה בהזרקה בטומוגרפיה יחידה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף ולעבד נתוני טומוגרפיה אלקטרונית קריו באמצעות SerialEM ו-tomoauto בצורה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לאסוף כמעט 100 סדרות הטיה ביום, אם היא מבוצעת כראוי, וליישר סדרת הטיה תוך 20 דקות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק תמיד את איכות יישור סדרת ההטיה.

אם קבוצה של סדרת הטיה אינה מיושרת היטב, נסה ליישר ידנית ולהעביר את הפרמטרים לתצורה מקומית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיצוע תת-טומוגרמה על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו קביעת המבנה ברזולוציה גבוהה יותר של קומפלקסים מקרו-מולקולריים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ה-cryo-EM לחקור מבנים ברזולוציה גבוהה באתרם בחיידקים, וירוסים ואורגניזמים אחרים.