פליטת אור מבוסס שיטת כימות גידול עבור התקדמות גידול ניטור שפעות טיפול מודלים לימפומה העכבר

המטרה הכללית של הליך הדמיה זה היא להסדיר את נהלי רכישת הביולומנסינציה ואת ניתוחי התמונות על מנת להשיג נתונים כמותיים להשוואה בתוך ניסויים שונים או בינם. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הדמיות הביולומנסינציה, כגון: כיצד ניתן לכמת נתוני הדמיה באופן הניתן לשחזור? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הקלות בהקמתה בכל מתקן לבעלי חיים המחזיק במכשיר להדמיית ביולומנסינציה, והעובדה שהיא אינה דורשת חישובים מורכבים.

הפעל את המדמם ופתח את תוכנת הרכישה (Acquisition). לחץ על Initialize כדי לאתחל את המצלמה, את הבמות ואת העדשות. לאחר אישור רמת הסדציה המתאימה על ידי היעדר תגובה ללחיצה על הרגל, הנח עכבר על פד חימום ומרח משחה לעיניים.

לאחר מכן, השתמש במחט בכילוג 25 להזרקת 100 µL של תמיסת D-Luciferin potassium salt שהוכנה טרי, באופן תוך-פעਤוני (intraperitoneally). במקרה זה, תאי הגידול מביעים firefly luciferase. חלבון זה מחמצן את ה-D-Luciferin ומייצר אור שניתן לזיהוי באמצעות המדמייר.

לאחר 10 דקות, מקמו את העכבר, במצב שכיבה על הבטן, בתוך מכשיר הדימיג'ר כך שגבו פונה למצלמה ובמיקום שטוח ככל האפשר. בחרו בתכונת החשיפה האוטומטית ולחצו על Acquire כדי לקבל תמונה של החלק האחורי של בעל החיים. לאחר מכן, מקמו את העכבר במצב שכיבה על הגב, תוך פריסת הגפיים הקדמיות כך שלא יחסמו את בית החזה.

וודאו שתיבת הסימון של החשיפה האוטומטית (auto exposure) עדיין מסומנת, ורכשו תמונה קדמית של בעל החיים. לאחר מכן, החזירו את העכבר למצע החימום עד להחלמתו המלאה, שבשלב זה ניתן להחזיר את בעל החיים לכלובו. כדי לכמת את הביולומינסנציה, לחצו על View בתפריט ובחרו ב-Tool Palette במידה והוא אינו מוצג כבר.

בשלב הבא, לחצו על לשונית כלי אזור העניין (region of interest tool), בחרו בכפתור המתאר (contour) ובחרו ב-"Free Draw". באמצעות כלי ה-Free Draw, עקבו אחר הקצוות של העכבר כולו או של אזור ספציפי בתמונת המבט הקדמי כדי לסמן את אזור העניין, ולחצו על המקש הימני לסגירת המתאר. בחרו ב-Radiance בתפריט הגלילה של היחידות (Units) בפינה השמאלית העליונה של התמונה, אם אפשרות זו אינה נבחרה כבר.

לאחר מכן, קראו את הערך בתיבת Total Flux photons per second כדי למדוד את שטף הפוטונים. לאחר מכן, לחצו על תפריט View ולאחר מכן על region of interest measurements. לאחר חזרה על הניתוח עבור תמונת המבט האחורי, חברו את ערכי שטף הפוטונים שהתקבלו עבור שני המבטים כדי לקבל את ה-luminoscore.

בניסוי זה, ניתן היה לזהות את הגידול כבר 10 דקות לאחר ההזרקה. התמונות לבדן מאששות כי תאי הגידול נמצאים במיקום הנכון. עם זאת, כימות הביולומינצנציה הדגים הבדל ברור בין בעלי החיים שקיבלו הזרקות לאלו שלא קיבלו.

מעניין לציין כי האות שהתקבל במודל תת-עורי היה גבוה פי 100 מאשר במודל הלימפומה התוך-עינית הראשוני, בדומה למספר התאים שהוזרקו. כאן, תמונות מייצגות של צמיחת הגידול בעכברים עם לימפומה תוך-עינית ראשונית מקבוצת הביקורת ומקבוצה שטופלה ב-CpG מדגימות כי לאחר פרק זמן מספיק, גרורות מתחילות להופיע בקבוצת הביקורת. למרות שהגידול הראשוני לא נראה רגיש לטיפול, נצפו פחות גרורות בקבוצה שטופלה ב-CpG.

ואכן, ניתוח כמותי של עומס הגידול בכל קבוצה מדגים כי CpG מעכב את התפתחות הגידול, ומייצר הבדל מובהק סטטיסטית בלומינסנציית הגידול בין הקבוצות המטופלות לקבוצות הביקורת לאחר 28 ימים. במודל תת-עורי זה, שני גידולים השרבו לכל צד של העכבר, כאשר הטיפול ניתן in situ לצד אחד ביום אפס, והגידול בצד השני שימש כביקורת. לאחר מכן, סומנו שני אזורי עניין (regions of interest) לכל עכבר, ונמדד היחס בין מדד הלומינסנציה (luminoscore) בצד המטופל לצד הביקורת.

13 ימים לאחר מתן הטיפול, נצפתה ירידה משמעותית ביחס ה-luminoscore, המעידה על כך שהגידול המטופל נספג, כפי שמעידות גם תמונות הביולומינסנציה התואמות. לאחר היישום, ניתן להשלים ניתוח זה תוך שתי דקות לכל בעל חיים, אם הוא מבוצע כהוראות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקום איכותני של אתר הגידול, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע למנגנוני שיכון (homing) או גרורות של תאי גידול.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים ותחום דימוי הביולומינצנציה לחקור התקדמות גידולים במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים קטנים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן ביצוע דימוי ביולומינצנציה לצורך כימות עומס הגידול בצורה הניתנת לשחזור. זכרו כי עבודה עם בעלי חיים קטנים ומכשירים כירורגיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון סטריליזציה נאותה של המכשירים, בעת ביצוע הליך זה.