Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של Spp אנטרוקוקוס. ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

המטרה הכוללת של בדיקת PCR דיגיטלית דופלקס זו היא לכמת בו זמנית זיהום צואה כללי ואנושי הקשור במים. בדיקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדידת איכות המים לפנאי כגון, כמה אינדיקטור צואה כללי, כלומר אנטרוקוקוס וחשוב מכך סמן HF183 הקשור לצואה אנושית נמצא במים.

היתרון העיקרי של בדיקה זו הוא שהיא מכמתת שתי מטרות בתגובה אחת ובהשוואה ל-qPCR, היא מבטלת את הצורך בהפעלת עקומות סטנדרטיות ומכאן את ההטיה והשונות המשויכת. תדגים את ההליך מרדית' ריית', טכנאית המחקר הבכירה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תחילה 100 ריכוזי מלאי מיקרומול לליטר עבור כל הפריימרים במים בדרגה מולקולרית ובדיקות במאגר TEPH 8 כמתואר בטקסט הפרוטוקול.

לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר על ידי ערבוב כמויות מתאימות של תערובת PCR דיגיטלית, פריימרים קדימה ואחורה, הגשושית הפלואורסצנטית ומים ללא נוקלאז. פיפטה למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב תוך הקפדה על זהירות שלא להכניס בועות אוויר לתמיסה. מכיוון ש-dPCR Master Mix צמיג יותר מ-qPCR Master Mix קונבנציונלי, יש צורך להשתמש בטכניקת ערבוב על ידי פיפטינג על מנת ליצור פתרון הומוגני.

זה מאפשר כימות dPCR מדויק במורד הזרם. כדי להכין את תערובת הבדיקה ליצירת טיפות להפעלת דגימות בשכפול, פיפטה 36 מיקרוליטר של תערובת המאסטר לתוך צלחת PCR רגילה. לכל אחת מ-36 תערובות המאסטר של מיקרוליטר, מערבבים פנימה 12 מיקרוליטר של תבנית DNA ומשאירים את בארות השכפול המתאימות ריקות על הצלחת.

כלול בקרות חיוביות כדי להבטיח שהבדיקה פועלת כהלכה. כלול ללא בקרות תבנית או NTCs כדי להבטיח שאין זיהום בתוך הצלחת וכדי להגדיר את קו הבסיס הפלואורסצנטי מאוחר יותר לניתוח נתונים. לפני הגדרת מחולל הטיפות מערבבים את תערובות הבדיקה באמצעות פיפטה רב-ערוצית כדי לזרוק את התערובות למעלה ולמטה כ-15 פעמים.

ודא שקצה הפיפטה נשאר בתוך הנוזל כדי למנוע יצירת בועות גישה בתוך התערובת. לאחר מכן, הכנס את המחסנית המכילה שמונה בארות למחזיק מחסנית לבן ולחץ על מחזיק המחסנית סגור. מחסנית אחת נמצאת כעת במקומה היטב ולא ניתן להוציא אותה מהמחזיק תוך יצירת טיפות.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו בעדינות 20 מיקרוליטר מתערובת הבדיקה למצב האמצעי של הדגימה המסומנת במחסנית מבלי להכניס בועות אוויר. פיפטה ב-70 מיקרוליטר של שמן Droplet Generation בצד שמאל של המחסנית מסומנת שמן. כסה את המחסנית באטם וודא שהאטם שטוח ומוחזק באופן שווה על ידי ארבעת הקרציות לכיוון קצה המחסנית.

לחץ על הכפתור המואר בירוק בגנרטור הטיפות כדי לפתוח את הדלת ולהניח את המחסנית. לחץ שוב על הכפתור כדי לסגור את הגנרטור. לאחר סגירת הדלת, הכפתור הירוק מעומעם ולא ניתן לפתוח את הדלת מחדש.

יצירת טיפות תתחיל מיד ותימשך כדקה. בזמן שיצירת הטיפות מתבצעת, הנח את מחסנית 2 במחזיק מחסנית לבן שני והכן אותה באותו אופן כמו למחסנית 1. לאחר השלמת יצירת הטיפות, הכפתור המואר במעומעם יהפוך לירוק.

פתח את דלת מחולל הטיפות, הסר את מחזיק המחסנית הלבן המכיל מחסנית אחת והנח אותו בצד. הנח את מחסנית שתיים במחולל הטיפות. הסר את האטם מהמחסנית הראשונה והשליך.

אל תבטל את הלחיצה על מחזיק מיכל הדיו הלבן מכיוון שהפעולה עלולה לשבור את הטיפות החדשות שנוצרו. בעזרת פיפטה רב-ערוצית המוגדרת ל -40 מיקרוליטר, הכנס את הקצוות לעמודה השלישית של הטיפות המסומנות במחסנית בזווית של 45 מעלות והעלה לאט לאט את כל הטיפות. העבירו אותם לצלחת ה-PCR הסופית על ידי הנחת קצה הפיפטה על דופן הבאר בערך באמצע הדרך למטה והוצאת הטיפות לאט.

באותו אופן, לאחר השלמת יצירת הטיפות עבור מחסנית שתיים, הסר את האטם ממחסנית שתיים והעביר את הטיפות שנוצרו לצלחת ה-PCR הסופית. הניחו מכסה נייר כסף מנוקב על גבי הצלחת והניחו אותו על אוטם צלחות. הגדר את הסילר ל-180 מעלות צלזיוס, לחץ על פליי על הסילר ואטום למשך 10 שניות.

כדי להתחיל בהליך זה, הנח את לוחית ה-PCR הסופית האטומה ב-thermocycler. השתמש בתרמו-סייקלר התואם לצלחת ה-PCR הסופית ובמהירות הגברת טמפרטורה של שתי מעלות צלזיוס לשנייה. הפעל את התוכנית התרמית הבאה עשר דקות ב-95 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 40 מחזורים של 30 שניות ב-94 מעלות צלזיוס ו-60 שניות ב-60 מעלות צלזיוס ואחריהם החזקה של עשר דקות ב-98 מעלות צלזיוס.

בסיום הרכיבה, העבירו את הצלחת לקורא טיפות למדידה אוטומטית של פלואורסצנטים בכל טיפה בכל באר. ודא שהטיפות נמצאות בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך בקריאת טיפות. התחל בפתיחת התוכנה הנלווית כדי להגדיר את קריאת הטיפות.

בתפריט ההגדרות המוגדר כברירת מחדל המכיל סכימה של צלחת ריקה של 96 בארות, לחץ פעמיים על באר A1 כדי לפתוח את התפריט המכיל שלושה חלקים, דוגמה, בדיקה 1 ובדיקה 2. במקטע דוגמה, הקלד את המזהה לדוגמה בתיבה הנושאת את התווית שם וסמן את התיבה מימין המסומנת החל. לאחר מכן, לחץ על התפריט הנפתח שכותרתו ניסוי, בחר אדום לזיהוי אירועים נדירים ולחץ על Enter.

עבור לסעיף המסומן מבחן 1. במקטע שם, מלא את הבדיקה ולחץ על Enter. בתיבה שמתחת שכותרתה סוג, לחץ על התפריט הנפתח, בחר ערוץ 1 לא ידוע ולחץ על Enter.

עבור לסעיף המסומן מבחן 2. במקטע שם, מלא את הבדיקה ולחץ על Enter. בתיבה שמתחת לכותרת סוג, לחץ על התפריט הנפתח, בחר ערוץ 2 לא ידוע ולחץ על Enter.

כל המידע מהשלבים הקודמים קיים כעת A1.Name כל הבארות הבאות המכילות טיפות. כדי לחסוך זמן התקנה כולל, לחץ על Shift או Control כדי לבחור מספר בארות בו זמנית. כאשר התיאור הדיגיטלי של הצלחת משקף את הצלחת הפיזית, לחץ על אישור בפינה השמאלית התחתונה של התפריט.

בתפריט החדש שמופיע בחלק העליון של סכימת הצלחת, מתחת לתבנית, בחר Save As ושם ושמור את הצלחת. משמאל למסך, לחץ על הפעלה ובחר את ערכת הצבע המתאימה בחלון אפשרויות הפעלה הקופץ. איסוף הנתונים יתחיל ויוצג בזמן אמת בתוכנה.

כשהקורא מסיים ומופיעה תיבה המציינת הפעלה הושלמה, לחץ על אישור. בדוק את ההפרדה בין הטיפות החיוביות והשליליות. ודא שהפלואורסצנטים בכל הטיפות בבארות NTC קרובים לקו הבסיס. לחץ על הכפתור שכותרתו אירועים.

בחלק התחתון, לחץ על התיבה בשם יחיד ומימין להיסטוגרמה המוצגת, לחץ על התיבה בשם סה"כ כדי לחלק את המספר הכולל של טיפות שהתקבלו לבאר. אל תכלול בארות המכילות פחות מ-10,000 טיפות על ידי לחיצה ממושכת על מקש הבקרה ולחיצה על הבארות שיש לא לכלול. לחץ על הכפתור המסומן משרעת 1D כדי להגדיר את סף הפלואורסצנט בערך סטיית תקן אחת של הטיפות השליליות בבארות NTC עבור שתי המטרות.

בשמאל המסך מתחת לניתוח אוטומטי המציג שני כפתורי סף, בחר את הסמל מימין שיש לו קו אופקי ורוד מלא שעובר דרכו. לחץ על התיבה משמאל לסף הגדר מתחת לכל אחד מגרפי המשרעת והזן את ערכי סף הקרינה המתאימים. ריכוזי היעד בהעתק לתגובת מיקרוליטר מחושבים לאחר מכן אוטומטית.

ייצא את התוצאות בקובץ CSV בלחיצה על הלחצן Export בפינה השמאלית העליונה במסך 1D Amplitude. בקובץ ה-CSV, הכפל את ריכוז המטרה המיוצא בארבע כדי להמיר אותו מעותק של יעד לכל תגובה של מיקרוליטר, לעותק של יעד לכל תבנית DNA של מיקרוליטר. איור זה משווה את הפורמטים הדופלקס והסימפלקס של בדיקת ה-PCR הדיגיטלית.

הפאנל השמאלי והימני מציגים את Enterococcus ו-HF183 Quantification בהתאמה עם מקדמי המתאם המתאימים בין תוצאות דופלקס וסימפלקס. הקווים האחידים מציינים את קווי הרגרסיה והצללה האפורה מציינת את שגיאות התקן המתאימות. סוגים שונים של דגימות מסומנים על ידי הסמלים.

התוצאות עקביות מאוד ולעתים קרובות לא ניתן להבחין בין אנטרוקוקוס ו-HF183 בו זמנית בתגובה אחת או בנפרד בשתי תגובות. בדיקת ה-PCR הדיגיטלית יכולה גם לסבול מעכב בריכוזים גבוהים בסדר גודל אחד עד שניים מזה הנסבל על ידי עמיתיו ל-qPCR. איור זה מציג qPCR וכימות PCR דיגיטלי של סמן HF183 ב-DNA של ביוב נקי עם עלייה בריכוז של חומצה הומית המעכבת PCR.

כימות HF183 הצפוי בהיעדר מעכבים מוגדר כקיפול ביטחון של 95% בין שני הקווים המקווקוים האופקיים. PCR דיגיטלי המסומן על ידי משולשים ממשיך לספק כימות מדויק עד לריכוז חומצה הומית של 15 ננוגרם לתגובה של מיקרוליטר בעוד qPCR המסומן על ידי צלבים מתחיל להמעיט בהערכת ננוגרם אחד למיקרוליטר ומעוכב לחלוטין בחמישה ננוגרם למיקרוליטר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את בדיקת ה-PCR הדיגיטלית האנטרלית HF183 Duplex Droplet או בדיקה דומה אחרת באמצעות פריימרים ובדיקות שונות.

מאז הפיתוח של מבחן דופלקס זה שפורסם במחקר מים בשנת 2015, פיתחנו ואימתנו שלל מבחני PCR דיגיטליים אחרים המכוונים לחיידקי אינדיקטור צואתי כלליים, סמני מעקב מיקרוביאליים ופתוגנים הנישאים במים. בדיקות אלו מספקות כימות ישיר ובלתי מוטה של היעד שלהן והן הופכות לחלופות שימושיות למבחני qPCR בתחום בדיקות איכות המים.