Name: Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של Spp אנטרוקוקוס. ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: למדו שיטת PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של Enterococcus spp. ומרקר HF183 במי שחייה. שיטה זו מבטלת צורך בעקומי תקן ומפחיתה הטיות בניטור איכות מים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

לכותבים אין אישורים.

1. תערובת Assay כן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 100 μmol / L ריכוזי מניות לכל פריימרים במי כיתה מולקולריים בדיקות במאגר TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. הערה: בדיקות עבור שתי המטרות מסומנות fluorescently עם 7 fluorophores השונים כמצוין רשימה של חומרים / ציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת אמן על ידי ערבוב, לכל תגובה מתוכננת, 12 μl דיגיטלי תמהיל PCR (2x המניות, ראה רשימה של חומרים / ציוד), 0.216 μl כל קדימה לאחור תחל, 0.06 μl כל בדיקה ניאון, ו 5.016 μl מים nuclease חינם (הריכוז הסופי : פריימר 900 ננומטר כל, 250 ננומטר כל בדיקה). פיפטה מעלה ומטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב תוך זהירות שלא להכניס בועות אוויר בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 18 μl תערובת אמן (משלב 1.2) לתוך צינור או צלחת PCR רגיל, ערבוב תבנית ה- DNA 6 μl (חילוץ כמתואר לשנים קודמותערמומי 13) לעשות תערובת assay עבור דור אגל. אם פועל דגימות בשני עותקים, pipet 36 μl של תמהיל מאסטר ו -12 תבנית ה- DNA μl לבאר כל אחד. השאר את הבארות לשכפל המקביל ריק על הצלחת. כלול בקרות חיוביות (ראה רשימה של חומרים / ציוד) ולא שולט תבנית (NTC) (כלומר עם מי כיתה מולקולריים משמשים תבנית). הערה: בקרה חיובית יש צורך להבטיח את assay פועל כראוי ואת NTC יש צורך להבטיח שאין זיהום בתוך הצלחת ולהגדרת בסיס הניאון בהמשך לניתוח נתונים. משתמשים פעם ראשונה מומלץ להשתמש בשתי דגימות DNA חי ומדולל. </li></ol> 2. דור אגל והגדרת פלייט PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת assay ידי pipetting למעלה למטה כ 15 פעמים באמצעות pipet הרב ערוצית. ודא קצה pipet נשאר בתוך נוזל, כדי למנוע עושה בועות עודפות בתוך התערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> insמחסנית ERT 1 (המכיל 8 בארות) לתוך בעל מחסנית לבן ולחץ על עצומות בעל מחסנית. מחסנית 1 כיום במקומו ולא ניתן וחילצה מבעל תוך יצירת טיפות. שימוש pipet הרב ערוצית, להעביר בעדינות 20 μl של תערובת assay לתוך האמצע של &quot;מדגם&quot; מסומן מחסנית ללא החדרת בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet ב 70 μl של שמן אגל דור אל הצד השמאלי של מחסנית (מסומן &#39;שמן&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסנית כיסוי עם אטם מוודא האטם הוא שטוח וקבע באופן שווה על ידי 4 קרציות לעבר קצה המחסנית. לחצו על הכפתור הירוק מואר על הגנרטור אגל לפתוח ולמקם את המחסנית. לחץ ירוק מואר הלחצן שוב כדי לסגור את הגנרטור. הערה: לאחר שהדלת נסגרת, הלחצן מעומעם, הדלת לא ניתן לפתוח מחדש ודור אגל מתחיל ממשיך מיד כ 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עושים יותר מ -8 תגובות, מחסנית מקום 2 תוך שנייהבעל מחסנית לבן ולהכין באותו אופן כמו מחסנית 1 ואילו דור האגל מתבצע כדי לחסוך זמן התקנה כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את דלת גנרטור אגל כאשר הכפתור מואר העמום הופך ירוק המציין השלים דור אגל. הסר את בעל מחסנית לבן המכיל מחסנית 1, להפריש, ומקום מחסנית 2 על גנרטור רביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האטם ממחסנית 1 וזורקים. בעדינות להעביר את הנפח הכולל (כ 40 μl) של טיפות שנוצרו מן בטור השלישי של המחסנית (מסומן &#39;טיפות&#39;) לצלחת PCR סופית (נשמרה בטמפרטורת חדר) עבור רכיבה תרמית. הערה: אל ובטל את בעל מחסנית הלבן כמו הפעולה עשוי לשבור את הטיפין החדשות שנוצרו באופן מלאכותי; רק לפתוח את בעל המחסנית אחרי הטיפין הועברו הצלחת הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.7 עבור דגימות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשכל הטיפין נמצאות צלחת PCR הסופית, להציב לנקבהכיסוי רדיד על גבי צלחת ומניחים אותו על אוטם צלחת. הגדר את האוטם ל -180 ° C, לחץ על &#39;Play&#39; על האוטם ולתת חותמים במשך 10 שניות. </li></ol> 3. רכיבה על אופניים תרמיים וקריאת האגל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת האטומה על Cycler התרמית, אחד בקנה אחד עם צלחת PCR הסופית המשמשת בשלב 2.7, ומהירות ramping טמפרטורה של 2.0 מעלות צלזיוס / sec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תכנית תרמית כדלקמן: 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ואחריו 40 מחזורים של 30 שניות על 94 מעלות צלזיוס ו -60 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ואחריו להחזיק 10 דקות ב 98 ° C (אופציונאלי: עצירה סופית ב 4 או 15 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת אופניים, להעביר את הצלחת לקורא אגל למדידה אוטומטית של קרינה בכל אגל בכל טוב. לחלופין, אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים לפני קריאת רביב. ודא הטיפות הן בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך עם הקריאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח בתוכנה הנלווית התקנת קריאת רביב. בתפריט ברירת המחדל &#39;הגדרת&#39; המכיל סכמטי של צלחת ריקה 96 באר, לחץ לחיצה כפולה על כן A1 כדי לפתוח את התפריט המכיל שלושה חלקים: &quot;לדוגמא, &#39;&#39; Assay 1 &#39;ו&#39; Assay 2.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקטע &#39;לדוגמא&#39; הקלד את מזהה המדגם לתוך התיבה שכותרתה &#39;שם&#39; ולחצו אנטר או לסמן את התיבה בצד ימין מסומן &#39;החל&#39;. לאחר מכן, לחץ הנפתח &#39;ניסוי&#39; שכותרתו תפריט ולבחור &quot;RED&quot; (זיהוי אירוע נדיר) ולחץ על Enter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לקטע כונה &#39;Assay 1.&#39; בקטע &#39;שם&#39; למלא את assay (למשל אנטרוקוקוס) ולחץ על Enter. בתיבת הדו למטה תחת הכותרת &quot;סוג&quot; לחץ על התפריט הנפתח ובחר &#39;ערוץ 1 לא ידוע&#39; ולחץ על Enter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לקטע כונה &#39;Assay 2. &quot; בקטע &#39;שם&#39; למלא את assay (למשל HF183) ולחץ על Enter. בתיבת הדו למטה תחת הכותרת &quot;סוג&quot; לחץ הנפתחת תפריטd לבחור &quot;ערוץ 2 לא ידוע &#39;ולחץ על Enter. כל המידע מן השלבים 3.3.2 עד 3.3.4 עכשיו להציג היטב A1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם כל הבארות הבאות המכילות טיפות. כדי לחסוך זמן התקנה כולל, לחץ על &#39;Shift&#39; או &#39;Ctrl&#39; לבחור בארות בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התיאור הדיגיטלי של צלחת מראות הצלחת הגופנית, לחץ על &#39;האישור&#39; בפינה הימנית התחתונה של התפריט. בתפריט החדש שמופיע בחלק העליון של סכמטית הצלחת, תחת הסעיף &#39;Template&#39; לבחור &#39;שמירה בשם&#39; ושם ולשמור הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי השמאלי של המסך ולחץ על &#39;הפעל&#39; ובחר מתאים דיי סט ב-אאוט פופ &quot;הפעלת האפשרויות&quot; החלון. איסוף נתונים יוזם מוצג בזמן אמת בתוכנה. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח נתונים ודיווח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הקורא הוא סיים תופיע תיבה והצהירה &quot;מפעיל שלמים &#39;, לחץ על&#39; אישור &#39;. הערה: רכהכלי מציג את קובץ הנתונים הסופיים, בסעיף &#39;לנתח&#39; של התוכנה. לפי השקפה זו, התוכנה יש את כל הבארות בצלחת שנבחרו מחדל לעלילת הנתונים ד&#39;2 Amplitude &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההפרדה בין הטיפות חיוביות ושליליות. ודא כי הקרינה בכל טיפות בבארות NTC נמצאים בקרבת הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקישו על כפתור הנקרא &#39;אירועים&#39;. מהימין של ההיסטוגרמה הציג לחץ על התיבה בשם &#39;סה&quot;כ&#39; והתיבה בשם &quot;יחיד&quot; בתחתית כדי להציג את המספר הכולל של טיפות קבלו בכל טוב. אל תכלול כל בארות המכילות &lt;10,000 טיפות 7-ידי החזקת מקש Ctrl ולחיצה על הבאר (ים) כדי להיות שליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור המסומן כמו &#39;1D Amplitude&#39; כדי לקבוע את סף פלורסנט בכ סטיית תקן אחת (500-700 יחידות קרינה) מעל הטיפין השליליות בבארות NTC עבור מטרות שניהם. במקרה הטוב ביותר השמאלי של האו&quot;ם המסךדער את &#39;אוטומטי לנתח ו&quot;הראתה שני כפתורי סף, לבחור את הסמל בצד ימין כי יש קו אופקי ורוד מוצק רץ דרך אותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בתיבה מהשמאל &#39;קבע סף&#39; תחת כל הגרפים משרעת והזן את ערכי סף הקרינה המתאימים. ריכוזי היעד להעתיק לכל תגובת μl אז מחושבים באופן אוטומטי. הערה: ספי לא צריך להיות זהה עבור מטרות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את התוצאות לקובץ csv על ידי לחיצה על כפתור &quot;ייצוא&quot; בפינה השמאלית העליונה במסך 1D משרעת. בקובץ CSV, להכפיל את הריכוז היעד שמייצאת 4 להמיר אותו מעותק של היעד (23S הגן של spp אנטרוקוקוס. או על סמן HF183) לכל תגובה μl להעתיק של היעד לכל μl תבנית ה- DNA. </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

ישנם כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, ערבוב של תערובות assay יכול להיות קשה, כי את תערובת מאסטר היא צמיגה יותר מאשר תערובות מאסטר qPCR קונבנציונליות. vortexing פשוט עלול להוביל ערבוב מספיק, אשר בתורו מוביל הפצה לא אחידה של תבניות DNA של תערובות assay וכפועל יוצא מזה הטיפות. טכניקת ערבוב האחרת pipetting כמתואר בפרוטוקול חייב להיות אחריו כדי להבטיח כימות dPCR מדויקות. שנית, חשוב להבטיח טיפות נוצרות בכל צורה וגודל אחיד. להיות זהיר של מקרים שבהם הזמן הגנרטור אגל שנדרש כדי להשלים הד...

PCR כמוני (qPCR) שיטות כבר בשימוש נרחב לניטור איכות מי פנאים ויישומי מעקב מקור חיידקים כי הם מהירים יותר, גמישים יותר ספציפיים בהשוואה לשיטות תרבות המבוססת מסורתיות. כתוצאה מכך, qPCR מומלץ להשגת תוצאות ניטור מים מהירות עבור אינדיקטורים צואתי כלליים כגון spp אנטרוקוקוס. בקריטריוני איכות מי פנאי מתוקן USEPA 1. מבחני qPCR רבים גם פותחו ומאומתים לזיהוי מקורות זיהום צואתי במי סביבת 2. בין אלה, מבחני סמן HF183 הם בין הנפוצות ביותר בשימוש לזיהוי זיהום צואתי הקשורים האדם 3. עם זאת, תוצאות qPCR יכול לעיתים קרובות להיות מוטים כי הם מסתמכים על עקומות סטנדרטיות עבור כימות. qPCR מכמת ריכוזים ידועים של יעד בדגימות על ידי ביון מחזור הכימות שלהם (CQ) מתוך סטןעקומת dard המתארת ​​מערכת יחסים ליניארי בין Cq וכמות לוגריתמים של סט של סטנדרטים בדילול סדרתי. חוסר חומר עזר תקן אמין ועקבי ולכן יכול להטות תוצאות qPCR מאוד. מחקרים הראו כי תוצאות qPCR שונות על ידי כחצי סטנדרטי יומן באמצעות מיצרנים שונים 4 ועל ידי 2-לקפל באמצעות קבוצות שונות של סטנדרטים מאותו הספק 5. PCR דיגיטלי (dPCR) טכנולוגיה מכמתת מדגם לא ידוע על ידי ספירת התדירות חיובית במספרים גדולים של PCRs מיניאטורי המופקים על ידי מחיצות qPCR בתפזורת לתוך אלף או מ&#39;nanoliter האחיד או תגובות picoliter 6. זה נקרא כמו אגל PCR דיגיטלי (כלומר, במאמר זה) או תא דיגיטלי PCR, בהתאמה, אם המחיצות הן טיפות מים ב-שמן (כלומר, במאמר זה) או תא קטן על שבב. ריכוז מדגם גבוה יגרום נוכחות של DNA היעד(ומכאן חיובי PCR), בשיעור גבוה יותר של מחיצות, מערכת יחסים המקורבים על ידי התפלגות פואסון. ככזה, התוצאות בינארי (חיובי או שלילי PCR) נרשמות ואת התדירות של טיפות חיוביות משמשת לחישוב ריכוזים מדגמים לא ידועים ישירות דרך קירוב פואסון, ביטול הצורך עקום סטנדרט כמו qPCR. הטבע בינארי זה של כימות דיגיטלי PCR מספק יתרונות נוספים על פני qPCR 7. בגלל הגברה מתעכבת עדיין יכולה להניב PCR חיובי, כימות dPCR הן חזקות יותר נגד עיכוב המפחיתה יעילה הגברה. באופן דומה, כימות dPCR אינו מושפע השתנות בערכים Cq כמו qPCR, שמוביל דיוק גבוה של dPCR לעומת qPCR 8-10. בנוסף, תהליך יצירת המחיצות מבטיח כמות קטנה מאוד של הנוכחי DNA יעד בכל אגל, מזעור תחרות מצע ביעילות (במהלך amplification של מטרות DNA שונות) כי הם מכשולים נפוצים להשגת דופלקס (כלומר assay מודד בעת ובעונה אחת שתי מטרות DNA) qPCR. ככזה, אם בטווח בדופלקס או סימפלקס (כלומר יעד אחד נמדד ב assay אחת) dPCR מייצרת כימות כמעט נבדלות של שני היעדים 7,11. המטרה של assay PCR הדיגיטלי (EntHF183 dPCR) המתוארת במאמר זה היא להשיג כימות ישירה סימולטני של spp אנטרוקוקוס מחוון צואתי הכללי. ואת סמן HF183 הקשורים אדם-צואה עם דיוק, שחזור וחוסנם משופרים מפני עיכוב לעומת qPCR שלה עמיתים. Assay זה נוצל בהצלחה לכימות זיהום צואתי במים מתוקים סביבה, מים ימיים, חומר צואתי שונה 7, אבל יכול גם להיות מיושם על כל סוגים אחרים של מים ואת wastewaters. assay זה טומן בחובו הבטחה גדולה לניתוח משקע או קרקעות בגלל זהזה סובלנות גבוהה עיכוב, אך בדיקות נוספות נדרשות בשל מורכבות של המעכב מתערבב סוגים אלה של דגימות.

<table><tbody><tr><td>Microtubes Low Bind</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>לאחסון ריאגנטים, דוגמאות/ייצור של תערובות מאסטר</td></tr><tr><td>Nuclease Free</td><td>Water FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8 מאגר</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>Hardshell 96 Well Plate</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>לתערובת מאסטר ראשונית וחיסון מדגם</td></tr><tr><td>סרט</td> <td>איטום אלומיניוםBioRad</td><td>359-0133</td><td>לאיטום צלחת דגימה</td></tr><tr><td>מחולל טיפות</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>שמן ליצירת טיפות</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 מחזיק מחסנית</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>אטם</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 & #956; l טיפים פיפט</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>לשילוב דגימה/מאסטר ל-cartidge</td></tr><tr><td>200 ו-#956; l קצות פיפט</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>להעברת טיפות לסופי Twin.Tec Plate</td></tr><tr><td>Twin.Tec 96 Well</td><td>Plate Eppendorf</td><td>951020320</td><td>לטיפות סופיות רכיבה תרמית וקריאה</td></tr> רדיד <tr><td>חותם חום מנוקב</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>לאיטום צלחת Twin.Tec לפני רכיבה תרמית</td></tr><tr><td>PX1 PCR אוטם צלחת</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Thermalcycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96 ו-C1000</td><td>יש צורך רק במחזור התרמי, ללא אופטיקה</td></tr><tr><td>QX100 קורא טיפות</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>שמן קורא טיפות</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>טיפות PCR Supermix&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>כלומר תערובת ה-PCR הדיגיטלית בכתב היד</td></tr><tr><td>תוכנת QuantaSoft (v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>לצפייה, ניתוח וייצוא של נתוני ddPCR</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש ב-Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>ניתן להשתמש בספק חלופי</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATT</td><td>ניתן להשתמש בספק חלופי</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td> <td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td> <td>ניתן להשתמש בספק חלופי, אך הפלרופור חייב להיות</td></tr><tr><td>FAM HF183 Forward Primer ( HF183-1)</td> ניתן <td>להשתמש בספק חלופי</td>של <td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td></tr><tr><td>HF183 Reverse Primer (BthetR1)</td> <td>Operon</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGT</td><td>ניתן להשתמש בספק חלופי</td></tr><tr><td>HF183 Probe (BthetP1)</td> <td>Operon</td> <td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td> <td>ניתן להשתמש בספק חלופי, אך הפלרופור חייב להיות HEX (אם משתמשים ב-VIC, יש לבחור את הפיצוי המטרי המתאים. &nbsp;</td></tr><tr><td>בקרה</td><td></td><td></td><td>חיובית תערובת של E. faecalis DNA גנומי ופלסמיד סטנדרטי HF183 (הוזמן מ-IDT). לשיטות מפורטות בתרבית E. faecalis ורצפים של הפלסמיד HF183 המסודר, ראה Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). תקני DNA זמינים מסחרית Enterococcus (ATCC 29212Q-FZ) יכולים לשמש גם בבקרה חיובית במקום DNA גנומי E. faecalis שהוכן במעבדה.</td></tr></tbody></table>

assay pcr דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר hf183 הקשורים צואת האדם ווטרס

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס (EntHF183 dPCR) כימות סימולטני של spp אנטרוקוקוס. ואת סמן HF183 צואה הקשורים האדם. EntHF183 דופלקס dPCR (המכונה בשם EntHF183 dPCR hereon) assay משתמשת באותו רצפים פריימר בדיקה כמו PCR כמותי הפרט שפורסם שלה (qPCR) עמיתיהם. כמו כן, אותם הליכי סינון מי מיצוי DNA כפי שבוצע לפני qPCR הם אחריו לפני הפעלת dPCR. עם זאת, assay דופלקס dPCR יש מספר יתרונות על פני מבחני qPCR. החשוב ביותר, assay dPCR מבטל את הצורך לרוץ עקומת סטנדרט ומכאן, ההטיה הקשורה ולהבדלים, על ידי כימות ישיר של מטרותיה. בנוסף, בעוד להדפסה דו-צדדי (כלומר כימות סימולטני) אנטרוקוקוס ו HF183 ב qPCR מוביל לעתים קרובות הערכה נמוכה מדי חמורה של היעד השופע פחות במדגם, dPCR מספק כימות עקבית של המטרות הן, לגרותלה לכמת בנפרד או בו-זמנית באותו התגובה. את assay dPCR הוא גם מסוגל לסבול ריכוזי מעכב PCR כי הם אחד שני סדרי גודל גבוה יותר מאלו נסבלים על ידי qPCR. יתרונות אלו הופכים את assay EntHF183 dPCR אטרקטיבי במיוחד משום שהיא בעת ובעונה אחת מספקת מידע מדויק דיר משני הזיהום הכללי ואנושיים הקשורים צואתי במי סביבה, ללא הצורך להפעיל שני מבחני qPCR נפרדים. למרות יתרונותיה מעל qPCR, מגבלת הכימות העליונה של assay dPCR עם מכשור הקיימות כיום כ ארבעה סדרי גודל נמוך מזה השגה על ידי qPCR. כתוצאה מכך, הדילול נדרש למדידת ריכוזים גבוהים של אורגניזמים היעד כגון אלו שנצפו בדרך כלל בעקבות נשפך ביוב.

ריצת דופלקס EntHF183 טובה dPCR צריכה לגרום למספר גבוה היחסי של טיפות קבלו (בערך 10,000-17,000) והבדל גדול יחסית (בערך 5,000) בין ערכי קרינה עבור טיפות שליליות וחיוביות 7. באופן חריג מספר נמוך של טיפות מציין בעיות קרוב בתהליך אגל הדור, וניתוק 10,000 טיפות מוצע מבוסס על נתונים אמפיריים ממערכת אגל dPCR שימוש במאמר זה. הפרדה חלשה יותר (הבדל קרינה קטן כלומר) בין טיפות חיוביות ושליליות עשויה להצביע על עיכוב או בדיקות...

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת spp אנטרוקוקוס זמנית. ואת סמנים גנטיים HF183 כאינדיקטורים לזיהום צואתי כללית אדם הקשורים במים פנאי.

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

המטרה הכללית של בדיקת ה-Duplex Digital PCR זו היא לכמת בו-זמנית זיהום צואבי כללי וזיהום צואבי מקור אנושי במים. בדיקה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בניטור איכות מי רחצה, כגון, כמות האינדיקטור הצואבי הכללי, כלומר Enterococcus, וחשוב מכך, כמות ה-HF183 Marker המקושר לצואה אנושית במים.היתרון המרכזי של בדיקה זו הוא שהיא מכמתת שני יעדים בתגובה אחת, ובהשוואה ל-qPCR, היא מבטלת את הצורך בהרצת עקומות סטנדרט ובכך את ההטיה והשונות הנלוות. את הפרוצדורה תדגים Meredith Raith, טכנאית מחקר בכירה. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכינו תחילה תמיסאות מלאי בריכוז של 100 Micromole per liter לכל הפריימרים ב-Molecular Grade Water ולפרובים ב-TEPH 8 Buffer, כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול.בשלב הבא, הכינו תערובת מאסטר (Master Mix) על ידי ערבוב כמויות מתאימות של תערובת Digital PCR, פריימרים קדמיים ואחוריים, הגשוש (probe) הפלואורסצנטי ומים נקיים מנוקלאז (Nuclease-Free Water). בצעו פיפטאג עד וגב לפחות 10 פעמים כדי לערבב, תוך הקפדה לא להחדיר בועות אוויר לתמיסה. מכיוון שתערובת המאסטר של dPCR היא צמיגית יותר מתערובת מאסטר של qPCR קונבנציונלית, יש להשתמש בטכניקת ערבוב באמצעות פיפטאג כדי ליצור תמיסה הומוגנית.דבר זה מאפשר כימות dPCR מדויק בשלבים הבאים. כדי להכין את תערובת הבדיקה ליצירת טיפות עבור הרצת דגימות בכפילות,

a-duplex-digital-pcr-assay-for-simultaneous-quantification

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

פרוטוקול זה מתאר את השימוש זרימת משיק חלול סיבים מערכת ultrafiltration מדגם ריכוז דיסוציאציה חום כמו צעדים חלופיים עבור זיהוי של...

שינוי שיטת EPA 1623 שמשתמש תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration ומחממים צעדים ניתוק לזהות waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; ו<em&gt; Giardia spp.</em

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ה-PCR הדיגיטלי הדו-צדדי (ddPCR) – שינוי של טכניקת ה-PCR המסורתית השימושית בזיהוי שני סמנים גנטיים שונים בו זמנית. תגובת PCR יחידה מחולקת לטיפות מתחלבות בגודל ננוליטר המועצמות באופן עצמאי, וזיהוי אותות הגברה פלואורסצנטיים בצבעים שונים מחלק הטיפות משמש לחישוב הריכוז ההתחלתי של רצפי המטרה.

PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של סמנים גנטיים כפולים

Assay qPCR פותח לצורך זיהוי של O157 החיידקים Escherichia: H7 מיקוד סמן גנטי ייחודי, Z3276. QPCR היה בשילוב עם טיפול monoazide propidium (PMA) לגילוי תא חי. פרוטוקול זה כבר שונה ומותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של דגימות רבות...

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

פרוטוקול הכולל ריכוז משולב, העשרה וזיהוי קולורימטרי של נקודת קצה של פתוגנים הנישאים במזון בכמויות גדולות של מים חקלאיים מוצג כאן.  המים מסוננים באמצעות Modified Moore Swabs (MMS), מועשרים במדיה סלקטיבית או לא סלקטיבית, והזיהוי מתבצע באמצעות התקנים אנליטיים מבוססי נייר (μPAD) המשובצים במצעים קולורימטריים אינדיקטיביים חיידקיים.

מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt;,<em&gt; סלמונלה</em&gt; Spp., ו<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; מכמויות גדולות של מים לחקלאות

כאן אנו מציגים הליך לכימות אנטרו-וירוס ונורו-וירוס במי סביבה ושתייה באמצעות PCR כמותי של שעתוק הפוך. התאוששות הנגיף הממוצעת ממי תהום עם הליך סטנדרטי זה משיטת EPA 1615 הייתה 20% עבור נגיף הפוליו ו-30% עבור נורו-וירוס עכברים.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

בדיקות DNA סביבתיות דורשות תכנון קפדני, בדיקות, אופטימיזציה ואימות לפני תחילת איסוף נתוני השדה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שייקח את המשתמשים דרך כל שלב של תכנון בדיקת qPCR ספציפית למינים, מבוססת בדיקה לגילוי וכימות של דנ"א של מיני יעד מדגימות סביבתיות.

פיתוח ובדיקה של מבחני PCR כמותיים ספציפיים למינים עבור יישומי DNA סביבתיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מערכת שרשרת זרימה רציפה פולימראז המבוססת על שבב מיקרופלואידי וכיצד לבנות מערכת אלקטרופורזה נימית במעבדה. הוא מציג שיטה פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה.

הגברה של Escherichia coli בשבב מיקרופלואידי PCR בזרימה רציפה וגילויו באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימית

למדו שיטת PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של Enterococcus spp. ומרקר HF183 במי שחייה. שיטה זו מבטלת צורך בעקומי תקן ומפחיתה הטיות בניטור איכות מים.

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של

גלה סרטונים נוספים