בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפרט את כל השלבים הדרושים לאפיון ביציות אנטרליות של עכברים על סמך ארגון הכרומטין שלהן, בהתאם ליכולתן לקיים באופן מלא התפתחות עוברית פוטנציאלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון כיצד להבחין ולבודד שני סוגים שונים של אויקטים אנטרליים, SN, גרעין מוקף, ו-NSN, גרעין לא מוקף, השוכן בתא האנטרלי של שחלת היונקים. כדי לקצור את השחלות, התחל בהזרקת IP של עכברים נקבות בנות שלושה עד שישה שבועות עם 2.5 יחידות בינלאומיות של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון.

יומיים לאחר מכן, כשעה לפני הקציר, ממלאים צלחת פטרי סטרילית אחת במדיום M2 ומוסיפים כמה טיפות של 20 מקריליטר של מדיום M2 לצלחת פטרי שנייה, ומכסים כל טיפה ב-1.5 מיליליטר שמן מינרלי. לאחר מכן העבירו את כל צלחות הפטרי לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר למדיום להתאזן. לאחר מכן, השתמש במספריים סטריליים לדיסקציה כדי לבצע חתך בעור המכסה את דופן הבטן, ואחריו חתך בצפק של העכבר הראשון שהוזרק על ידי הורמון.

השתמש בפינצטה סטרילית כדי להזיז את המעיים הצידה כדי למקם את צינורות הרחם, היוצרים צורת V החל משלפוחית השתן. לאחר איתור השחלות מתחת לכליות, אחוז בצינור רחם אחד ושחרר את השחלה המתאימה עם חתך קטן בתחתית הרקמה. חזור על התהליך כדי לקצור את השחלה השנייה, ולאחר מכן הניח את שתי השחלות בצלחת פטרי מלאה במדיום M2 מאוזן מראש.

לפני בידוד הביצית האנטרלית, הכינו פיפטות פה מזכוכית על ידי אחיזה בשני הקצוות של פיפטת פסטר מזכוכית והחזקת הפיפטה אופקית מעל להבת מבער בונסן . כאשר הכוס מתחילה להימס, הסר את הפיפטה מהלהבה ומשוך במהירות את המכשיר. בעזרת ציפורן חותכים היטב את עודפי הזכוכית קרוב לנקודה הצרה של הפיפטה כדי לקצר את הקצה, ולהשיג קוטר נימי פנימי של כ -100 מיקרון.

חשוב שיהיה קוטר פיפטה נכון. אם הוא צר מדי, האויקטים יתקעו, יתפצלו וימותו. לאחר מכן חבר את הקצה הלא שונה של הפיפטה לצינור שואב.

לאחר מכן, העבירו את השחלות לצלחת פטרי המכילה מיליליטר אחד של מדיום M2 מאוזן מראש, והשתמשו במחט מזרק אינסולין סטרילית כדי לנקב בעדינות את הזקיקים האנטרליים של השחלות. כאשר הביציות משתחררות, יש לאסוף אותן בעדינות באמצעות פיפטה בפה, תוך הקפדה לא לשאוב תאי זקיק או פסולת רקמה אחרת. לאחר מכן פיפטה במהירות כל ביצית דרך מספר טיפות בינוניות M2 מאוזנות מראש כדי להסיר את כל תאי הקומולוס המחוברים לזונה פלוסידה של הביציות.

לאחר הסרת הביציות יש ליישב בזהירות את הביציות בתחתית טיפות בודדות של מדיום M2 טרי ומאוזן. כדי לצבוע את הביציות, השתמש בפיפטה בפה כדי להעביר את התאים לטיפות של 20 מיקרוליטר של Hoechst 33342, מדוללות במדיום M2. לאחר מכן מעבירים את הביציות לצלחת פטרי חדשה המכילה חמש טיפות מיקרוליטר של מדיום M2 מכוסה בשמן מינרלי, תוך הקפדה על יישוב הביציות בנפרד בתחתית כל טיפה.

לאחר שכל הביציות הועברו, הניחו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי ועוררו את התאים מספיק זמן כדי לדמיין נוכחות או היעדר טבעת סביב הגרעין. הקפד לא לחשוף יתר על המידה את הביציות, מכיוון שהכרומטין עלול להינזק והביציות עלולות למות אם הן נחשפות זמן רב מדי. לאחר זיהוי ביציות ה-SN וה-NSN, מיין את התאים לצלחת הפטרי המתאימה במגיב הרלוונטי לניתוח הרצוי במורד הזרם, בהתאם לארגון הכרומטין שלהם.

צביעת Hoechst 33342 לארגון כרומטין היא כנראה השלב הקריטי ביותר בהליך. חמש עד 10 שניות של עירור צריכות להיות ארוכות מספיק כדי למיין את הביציות על סמך נוכחות או היעדר כרומטין המקיף את הגרעין של כל ביצית. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך פחות משלוש שעות אם מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעבוד בטמפרטורת החדר ולזכור לטפל גם בשחלות וגם בביציות בעדינות. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בביציות להבשלה חוץ גופית ולהפריה חוץ גופית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לענות על שאלה שעדיין פתוחה, כיצד לזהות ולהבחין בין שני סוגים של ביציות אנטרליות השוכנות בשחלות היונקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד להכין ולהשתמש בפיפטה בפה שלך, כיצד לבודד ולמיין ביציות אנטרליות באמצעות צביעת Hoechst 33342. אל תשכח שעבודה עם בעלי חיים ותאים דורשת אמצעי זהירות מיוחדים, כמו לבישת ציוד מגן אישי ושימוש במכשירים מעוקרים.