Name: בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: חקור אפיון ביציות עכבריות אנטרליות לפי ארגון כרומטין גרעיני באמצעות צביעת Hoechst 33342. שיטה זו מאפשרת הבחנה בין ביציות SN ל-NSN ותורמת להבנת ביולוגיה רבייתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.M. ו-C.A.R. מכירים בתמיכה הכספית של Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 של Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M ו-C.A.R. מבקשים להודות למריאנה לונגו על עזרתה בהכנת התמונות.

פרוטוקול זה נערך בהתאם לעקרונות המנחים של אירופה (האיחוד האירופי 63/2010) ו- (26/2014) חוקי הגנה האיטלקים בעלי חיים המשמשים למחקר מדעי. המתת חסד נקע בצוואר הרחם משמשת לבידוד השחלות וזה מתבצע על ידי מומחה ומיומן אנשים רשומים בפרוטוקול שאושר על כיסוי מחקר זה. 1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על מבוגרים 3 לנקבות עכברים 6 שבועות בן בחדר עם טמפרטורה מבוקרת ולחות (עם שלבים של 12L: 12D וכרצונך הפד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עכברי intraperitoneally עם 2.5 IU של גונדוטרופין סרום סוסה בהריון (PMSG) כדי להמריץ את צמיחת זקיקים על ידי המחקה את ההשפעה של הורמון מגרה זקיק (FSH). לבודד את השחלות ל48hrs אוסף ביציות Antral מאוחר יותר. להרדים את נקבת העכבר הזריק בעבר עם PMSG, על פי ההנחיות מוסדיות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את השחלות מחלל הגוף ולהכניס אותם לתוך המשך צלחת פטריaining בינוני M2 לבידוד ביציות שלאחר מכן (ראה סעיף 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בעור המכסה את דופן הבטן ואחריו חתך בהצפק באמצעות מספריים לנתיחה סטרילית. פתח את החתך על מנת לחשוף את הבטן, להזיז את האומץ בצד אחד באמצעות פינצטה סטרילי ולמקם את צינורות הרחם, ויוצר צורת V-החל משלפוחית ​​השתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לשחלות ממוקמות מתחת לכליות. החזק כל צינור עם פינצטה סטרילי ולעשות חתך קטן בחלק התחתון של השחלות לשחרר אותם. העבר את שני השחלות בתחתית צלחת פטרי המכילה בינוני מראש equilibrated. </li></ol></li></ol> 2. הורמון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל PMSG (זמין בריכוזים שונים המניה) עם תמיסת מלח איזוטוני סטרילי כדי לקבל ריכוז עבודה של 2.5 הורמון IU ל0.1 מ&quot;ל למתאימה עוצמת זריקה. הערה: פתרונות הורמון חייבים להיות aliquoted ב 0.5 מיליליטר צינורות ומאוחסנים ב -20 ° C עד ליום שימוש. אין להשאיר aliquots המדולל יותר משלושה חודשים ב -20 ° C. ברגע שהפשיר, אם זריקות סידוריים מבוצעות, לאחסן aliquots של פתרונות הורמון ב+4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בם בתוך 4 ימים. </li></ol> בידוד 3. Antral ביציות לבידוד ביציות תקין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן M2 בינוני 13 (M2) בשעת 5% CO 2 ו- C ° 37 במשך שעה לפחות 1 לפני שתתחיל בהליך בידוד ביציות. הכן שתי צלחות פטרי (35 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ), אחד עם 1 מיליליטר של M2 לניקוב השחלה והשני עם טיפות קטנות (20 μl) של M2 מכוסה בשמן מינרלים (~ 1.5 מיליליטר) להעברת ביציות לאחר בידוד מ השחלה (ראה 3.4-3.6). לשמור על שני צלחות פטרי בחממה ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסטראו בנהלי בידוד ביציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טפטפות זכוכית פה דקה כדי לאסוף את הביציות בסרטטפטפות פסטר זכוכית הינג המשיכה אופקית (מחזיקה את הקצוות של פיפטה בשתי הידיים), על אש אנכית המגיעה מהמבער בונזן (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהכוס מתחילה להפשיר, לקחת את pipet מתוך הלהבה ולבצע תנועה מושכת מהירה כדי להשיג את פיפטה הרצויה. בתוקף לחתוך את הזכוכית העודפת קרובה לנקודה של פיפטה עם ציפורניים כדי להתאים את האורך והקוטר של הנימים הפנימיות הצרה. ודא שיש לו את הנימים דקות בקוטר פנימי של ~ 100 מיקרומטר, מעט גדול יותר מהקוטר של הביצית (~ 80 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפה פיפטה, חבר קצה אחד של צינור aspirator לפיפטה משכה באמצעות קצה מתאים ולמקם את הקצה השני בפה, המאבטח אותו עם השיניים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השחלות באמצעות פינצטה סטרילית ולהפקיד אותם בתחתית צלחת פטרי תרבית תאים (35 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ). לכסות אותם עם 1 מיליליטר של M2 equilibrated בעבר על 37 מעלות צלזיוסו 5% CO 2 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לנקב את זקיקי Antral של השחלות עם מחט מזרק אינסולין סטרילי לשחרר ביציות Antral בM2 (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות את הפה pipet הביציות באמצעות פיפטה פסטר צרה כדי להסיר תאי זקיק וכל פסולת אחרת אפשרית רקמה (איור 4 א) ולאחר מכן ליישב אותם בתחתית הטיפות קטנות (20 μl) של M2 מכוסים בשמן מינרלים מתאים לתרבות עובר (בעבר הכין; איור 4). הערה: חשוב להסיר את כל תאי קומולוס המצורפים למעטפת השקופה של הביציות על ידי pipetting הרציף באמצעות מספר ושונה טיפות של M2. לבצע שלב זה מהר ככל האפשר, כדי למנוע שינויים ב- pH של המדיום. </li></ol> 4. Antral ביציות צביעה עם Hoechst33342 הערה: ביציות Antral ניתן להבחין בSN (גרעין מוקף), NSN (לא מוקף גרעין) אובכל צורת ביניים אחרת, המבוסס על ארגון הכרומטין לאחר צביעה עם ריכוז supravital של Hoechst33342 (או כל סמנים אחרים ספציפיים לבסיסים AT) 14. למעשה, ביציות SN להראות טבעת Hoechst חיובית סביב הגרעין תוך NSN לא, ומכאן שמה. עבור מכתים ביציות תקין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הביציות באמצעות פיפטה פה לטיפין של Hoechst33342 (20 μl) בדילול מלא בM2 בריכוז supravital של 50 ng / μl עבור 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה עם Hoechst33342, להעביר את כל ביצית אחת עם טפטפת פה בחלק התחתון של טיפות קטנות (5 μl) של M2 מכוסים בשמן מינרלים, למיון המבוסס על ארגון הכרומטין (SN או NSN). השתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן Hoechst33342 (אורך גל פליטה 486 ננומטר) כדי להמחיש את תצורת הכרומטין של הביציות. הערה: בהתאם לסוג של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש, אנילא יכול להיות הכרחי כדי להשתמש בצלחת פטרי זכוכית תחתונה לרכישת תמונה. מיקרוסקופיה confocal אולימפוס Fluoview Fv10i כשהוא מצויד בבעל דגימה במשך 35 צלחת מ&quot;מ דורשת תחתונה מנות רק זכוכית לרכישת תמונה, עם עובי סטנדרטי 0.17 מ&quot;מ וטווח 0.13-0.21 מ&quot;מ מקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Excite הביציות לא יותר מ 5-10 שניות, סביר להניח מספיק זמן כדי להמחיש את הנוכחות או היעדר טבעת סביב הגרעין (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המיון, התרבות SN Antral וביציות NSN בM2 ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס כדי לגרום להבשלה חוץ גופייה או לשמור אותם במאגרים מתאימים לניתוחים מולקולריים או סלולריים. </li></ol>

<ol><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antral+follicles%3A+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+%28electron+microscopic+and+autoradiographic+data%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li>
<li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human%2C+bovine+and+murine+oocyte+meiosis%2C+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li>
<li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis%3A+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li>
<li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li>
<li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining%3A+a+study+using+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li>
<li>Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+%28BCB%29+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+%28IVP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biol%22%5BJournal%5D)">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li>
<li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li>
<li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li>
<li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li>
<li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes%3A+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li>
<li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li>
<li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+%28Hoechst+33342+and+3%2C3%E2%80%B2-dihexyloxacarbocyanine+iodide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li>
<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biopolitics+of+frozen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

פרוטוקול זה מתאר את השיטה המשמשת כדי לבודד ולסווג ביציות GV Antral העכבר. אין שלבים קריטיים במיוחד כדי להדגיש, עם כמה יוצאים מן הכלל. ראשון: הליך זה צריך להתבצע במהירות אפשרית ל: א) לשמור על החיוניות של הביציות וב) להימנע משינויי pH בטווח הבינוני בשימוש. שני: ביציות צריכה להיות נרגשות בקצרה (5-10 שניות) לHoechst33342 כדי למנוע נזק הכרומטין והמוות הבא של הביציות, במיוחד אם IVM והפריה חוץ גופית הם הצעדים הבאים. עד כה, זו הדרך המהירה ביותר כדי למיין ביציות Antral SN וNSN עכבר. <p...

ביציות Antral גדלו באופן מלא (GV, שלפוחית ​​נבטי) מבודדות מתא Antral של השחלה משמשות באופן שיגרתי למטרות שונות כגון, למשל, המחקר של המנגנונים המולקולריים ותאיים מאחורי התבגרות במבחנה עד שלב Metaphase השני. למרות ביציות המראה היפות שלהם Antral ביותר, אך לא כולם, הם מסוגלים להשלים מיוזה ולהגיע לשלב הבלסטוציסט; למעשה, במינים רבים של יונקים, כולל בני האדם 1,2, כ -30% מהם לעצור את התפתחותם בשלב 2-התא, אם מתרחשת הפריה 3-5. עד כה, כמה פרמטרים המשמשים להבחין בין ביציות יוכלו לקיים התפתחות העוברית מאלה שאינם מסוגלים לעשות זאת. לדוגמא, מכתים Cresyl הכחול (BCB) הוא שיטה תקפה כדי למיין את הביציות המבוססים על הפעילות של גלוקוז-6-פוספט-דהידרוגנז למרות התועלת של שיטת מיון זו קשורה לBCB + או הכתמת BCB- היאעדיין מעבדה תלויה 6-8. שיטה נוספת מבוססת היטב מתגוררת בארגון הכרומטין: אם מוכתם בכל צבעי intercalating DNA (כמו Hoechst33342), 70% מביציות Antral להראות צבע חיובי טבעת סביב הגרעין, והם נקראים מוקף הגרעין (SN), בעוד שנותר 30% להראות אותות חיוביים מנוקדים יותר ונקראים גרעין אינו מוקף (NSN) 3-5. לאחרונה הראו כי היעדר רשתות cytoplasmic 9 (הרב&quot;טים, אתרי אחסון חשובים לmRNA נגזר אימהי והריבוזומים בשני ביציות ועוברי יונקים) 10 ומטה-הרגולציה של מאטר (חיונית להיווצרות רב&quot;טים 11), יחד עם הנוכחות של טיפות שומנים בcytoplasms 9,12, יכולות להיות גורמים נוספים הקשורים לחוסר יכולת ביציות NSN כדי להמשיך מעבר לשלב 2-התא. למרבה הצער, ניתן ליישם כמה טכניקות כדי למיין SN Antral וביציות NSN ו,מסיבה זו, הפיתוח של שיטה פחות פולשנית (ללא הכתמה גרעינית, נהלי קיבעון או מניפולציה עם טפטפות פה) יכול להיות מאוד חשוב כדי להגדיל את השיעורים של שני פיתוח עובר האדם ובעלי חיים. במאמר זה, אנו פירוט הפרוטוקול הפשוט ומהיר המשמשים לSN סוג המודעה וביציות Antral NSN מנקבות עכברים לבודד והוא התייחס לכל המדענים מתעניינים במחקר של gametogenesis נקבה, הבשלת ביצית והתפתחות עובר.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 35 מ"מ x 10 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&-צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית גבוהה</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטר בורוסיליקט</td><td>קורנינג</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>מכלולי צינורות שואב לפיפטות מיקרופילריות מכוילות</td><td>סיגמא</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של עכבר antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ומהירה לבודד ולאפיין ביציות GV אנטרליות (שלפוחית נבט) של עכבר כמסוגלות (SN, גרעין מוקף) או לא מסוגלות (NSN, גרעין לא מוקף) להתפתח לשלב הבלסטוציסט לאחר התבגרות חוץ גופית (IVM) והפריה חוץ גופית (IVF). הוא עושה שימוש ב-Hoeschst33342 (או כל צבע אחר המסוגל להיקשר להטרוכרומטין של הגרעין המראה טבעת בביציות ה-SN או לא, כמו בביציות ה-NSN. זה מייצג את הדרך הקלה והמהירה ביותר למיין את שתי הביציות האנטרליות שניתן להשתמש בהן בסופו של דבר להליכי IVM או IVF. 
בקצרה, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: הזרקת הורמונים לגירוי צמיחת זקיקים; בידוד הביציות בשלב ה-GV מהתא האנטרלי על ידי ניקוב השחלה במחט סטרילית; הכנת פיפטות זכוכית דקות לפיפטינג בפה של הביציות; מיון הביציות עם Hoechst33342 שהוכנו בריכוז על-חיוני; IVM, IVF או כל ניתוח מולקולרי/תאי אחר.
למרבה הצער יש עדיין מעט ראיות למיון ביציות SN ו-NSN בטכניקות פחות פולשניות. אם וכאשר הם יזוהו, ניתן יהיה ליישם אותם בטכנולוגיות רבייה בסיוע אנושי, אם כי עם מספר היבטים שיש לשנות. נכון להיום, לטכניקה זו יש השלכות פוטנציאליות להגדלה דרמטית של הליכי IVM והפריה חוץ גופית מוצלחים הן במינים בסכנת הכחדה והן במינים בעלי עניין כלכלי.

התמונות הבאות מציגות את השיטה המשמשת כדי לבודד ביציות Antral משחלות עכבר, החל מהכנת טפטפות למיון &#39;הביציות באמצעות Hoechst33342. שיטה זו היא די פשוטה וניתן לבצעו בכל מעבדה מצוידת בחממה CO 2, סטראו ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן המתאים להתבוננות בHoechst33342 איור 1 מציג את השלב הראשוני של הכנת פיפטה:. כזכוכית מתחיל להפשיר ולהיות רכים, בשני הקצוות של פיפטה יש נקרעו לגזרים ו, ​​באותו הזמן, פיפטה יש לנקוט מהלהבה. לחל...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון של ביציות Antral עכבר מבוססות על ארגון nucleolar.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לפרט את כל השלבים הדרושים לאפיון של ציטות עובריות (oocytes) אנטרליות של עכבר על בסיס ארגון הכרומטין שלהן, בהתאם ליכולתן לתמוך באופן מלא בהתפתחות עוברית פוטנציאלית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון כיצד להבחין ולבודד שני סוגים שונים של ציטות עובריות אנטרליות: SN (גרעין מוקף) ו-NSN (גרעין שאינו מוקף), השוכנות במדור האנטרלי של השחלה ביונקים. כדי לקצור את השחלות, התחילו בהזרקה תוך-פריטונית (IP) לעכברים נקבות בנות שלושה עד שישה שבועות של 2.5 יחידות בינלאומיות של גונדוטורופין מסרום של סוסה בהריון.יומיים לאחר מכן, כשעה לפני הקצירה, מלאו צלחת פטרי סטרילית אחת במצע M2 והוסיפו מספר טיפות של 20 µL ממצע M2 לצלחת פטרי שנייה, תוך כיסוי כל טיפה ב-1.5 mL של שמן מינרלי. לאחר מכן, העבירו את כל צלחות הפטרי לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide כדי לאפשר למצע להגיע לשיווי משקל. בשלב הבא, השתמשו במספרי ניתוח סטריליים כדי לבצע חתך בעור המכסה את דופן הבטן, ולאחריו חתך בפריטונאום של העכבר הראשון שהוזרק לו הורמון.השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להזיז את המעיים הצידה לצורך איתור התובעות הרחמיות, היוצרות צורת V החל משלפוחית השתן. לאחר איתור השחלות מתחת לכליות, אחזו בתובעת רחמית אחת ושחררו את השחלה התואמת באמצעות חתך קטן בתחתית הרקמה. חזרו על התהליך כדי לאסוף את השחלה השנייה, ולאחר מכן הניחו את שתי השחלות בצלחת פטרי המלאה במצע M2 שעבר שיווי משקל מוקדם.לפני בידוד תאי הביצית מה antrum, הכינו פיפטות פה מזכוכית על ידי תפיסת שני קצותיה של פיפטת פסטור מזכוכית והחזקת הפיפטה באופן אופקי מעל להבת מבער בונסן. כאשר הזכוכית מתחילה להנמס, הוציאו את הפיפטה מהלהבה ומשכו את הכלי במהירות לצדדים. בעזרת ציפורן, גזרו בחוזקה את שארית הזכוכית סמוך לנקודה הצרה של הפיפטה כדי לקצר את הקצה, ולהגיע לקוטר קפילרי פנימי של כ-100 מיקרון.חשוב להשתמש בקוטר פיפט מתאים. אם הפיפט יהיה צר מדי, האוציטים ייתקעו, יעברו פרגמנטציה וימותו. לאחר מכן, חברו את הקצה שאינו מעובד של הפיפט לצינור שאיבה.בשלב הבא, העבירו את השחלות אל צלחת פטרי המכילה מיליליטר אחד של מצע M2 שעבר שיווי משקל מראש, והשתמשו במחט של מזרק אינסולין סטרילי כדי לדקור בעדינות את הזקיקים האנטרליים של השחלות. עם שחרור התאי ביצית, אספו אותם בעדינות באמצעות פיפטה פה, תוך הקפדה לא לשאוב תאי זקיק או שאריות רקמה אחרות. לאחר מכן, העבירו במהירות כל תא ביצית באמצעות פיפטה דרך מספר טיפות של מצע M2 שעבר שיווי משקל מראש, כדי להסיר את כל תאי הקומולוס הדבקים ל-zona pellucida של תאי הביצית.לאחר שהוציאו את תאי הגרנולוזה מהסביב של הביציות (denuding), יש להשקיט בזהירות את הביציות בתחתית של טיפות בודדות של מצע M2 טרי ומאוזן. לצביעת הביציות, השתמשו בפיפטה פה כדי להעביר את התאים לטיפות של 20 microliter של Hoechst 33342, המדולל במצע M2. לאחר מכן, העבירו את הביציות לצחנת פטרי חדשה המכילה טיפות של 5 microliter של מצע M2 המכוסות בשמן מינרלי, תוך הקפדה להשקיט כל ביצית בנפרד בתחתית כל טיפה.לאחר שכל הביציות הועברו, הניחו את הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועברו עליהן עירור למשך זמן קצר בלבד, המספיק כדי להבחין בנוכחות או היעדרה של טבעת סביב הגרעינית. יש להיזהר מחשיפת יתר של הביציות, שכן חשיפה ממושכת מדי עלולה לגרום לנזק לכרומטין ולמוות של הביציות. לאחר זיהוי ביציות ה-SN וה-NSN, מינו את התאים לצלוחית פטרי המתאימה, עם הריאגנט הרלוונטי לאנליזה הבאה המבוקשת, וזאת בהתאם לארגון הכרומטין שלהם.צביעה ב-Hoechst 33342 לבחינת ארגון הכרומטין היא כנראה השלב הקריטי ביותר בפרוצדורה. עירור למשך 5 עד 10 שניות אמור להספיק כדי למיין את התאי ביצית בהתבסס על נוכחות או היעדר כרומטין המקיף את הגרעין של כל תא ביצית. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בפחות משלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לעבוד בטמפרטורת החדר ולזכור להתייחס בעדינות הן לשחלות והן לאוציטים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש באוציטים להבשלה חוץ-גופית (in vitro maturation) ולהפרייה חוץ-גופית (in vitro fertilization). לאחר פיתחוה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לענות על שאלה שנותרה פתוחה: כיצד לזהות ולהבחין בין שני סוגים של אוציטים אנטרליים השוכנים בשחלות של יונקים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להכין ולהשתמש בפיפט פה עצמי, וכיצד לבודד ולמיין אוקיציטים אנטרליים באמצעות צביעה ב-Hoechst 33342. זכרו כי עבודה עם בעלי חיים ותאים מחייבת נקיטת אמצעי זהירות מיוחדים, כגון לבישת ציוד מגן אישי ושימוש במכשירים סטריליים.

isolation-characterization-mouse-antral-oocytes-based-on-nucleolar

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

סרטון זה מתאר את הבידוד של ביציות אנטראליות משחלות עכבר שזה עתה נקטפו. ביציות אנטראליות אלה יכולות לשמש לאפיון נוסף ולמחקרים התפתחותיים.

בידוד ביציות אנטראליות של עכבר: שיטה לבידוד ביציות אנטראליות משחלות עכבר שזה עתה נקטפו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

חקור אפיון ביציות עכבריות אנטרליות לפי ארגון כרומטין גרעיני באמצעות צביעת Hoechst 33342. שיטה זו מאפשרת הבחנה בין ביציות SN ל-NSN ותורמת להבנת ביולוגיה רבייתית.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

גלה סרטונים נוספים