Name: סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: למד את סינתזת הליפוזומים הרגישים לאור המשולבים בננו-חלקיקי זהב לשחרור תרופות מבוקר. שיטה זו מדגימה מנגנון שחרור מופעל לייזר וקוויטציית מיקרו-בועות לטיפול ברקמות שטחיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרנות מחקר אקדמי Tier-1 על ידי סינגפור משרד החינוך (RG 64/12 ל CX) ו NTU-נורת &#39;ווסטרן המכון הננורפואה.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ל נקי עגול צלוחיות התחתונה באמצעות Regia אקווה (1 חלק חומצה חנקתית מרוכזת (HNO 3) ו -3 חלקים של חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCl)) ולשטוף את צלוחיות עם מים די. חיטוי הצלוחיות ולייבש אותם בתנור אוויר חם ב 100 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לעטוף ולאחסן את צלוחיות סטרילי עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את סט מיני מכבש יד שנערך באמצעות אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מאייד רוטרי להגדיר את הטמפרטורה של המים באמבטיה החמים מגדל קירור על 37 מעלות צלזיוס ו 4 ° C בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 60 מ&quot;מ calcein פתרון המניות על ידי המסת 374 מ&quot;ג של calcein ב 10 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;מ בופר פוספט (PBS) (pH 7.4). התאם את ה- pH ל -7.4 באמצעות 1 M נתרן הידרוקסידי פתרון (NaOH). </li></ol> 2. סינתזה של ליפוזומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הליפידים (1,2-Dipalmitoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-Palmitoyl-2-הידרוקסי SN -glycero-3-phosphochoקו (MPPC) ו 1, 2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanol-amine- N - [carboxy (פוליאתילן גליקול) -2000] (אמוניום מלח) (DSPE-PEG2000)) מהמקפיא (-20 ° C) להפשיר אותם RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 15.9 מ&quot;ג DPPC, 1.3 מ&quot;ג MPPC, ו -2.8 מ&quot;ג DSPE-PEG2000. ממיסים יחד אותם 2 מ&quot;ל כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון כלורופורם אל הבקבוק תחתית עגולה סטרילית להתאדות ממס באמצעות המאייד רוטרי תחת לחץ מופחת, כדי ליצור שכבת השומנים דק ויבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה שכבת השומנים על 45 מעלות צלזיוס עם בתמיסה מימית 2 מ&quot;ל במשך 30 דקות המכיל 1.95 מ&quot;ל 60 מ&quot;מ calcein מוכן בשלב 1.4 ו 50 μl Au צירופים (3.36 × 10 16 חלקיקים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחמם את בלוק חימום עד 45 מעלות צלזיוס. מקום מסנן הממברנה פוליקרבונט 200 ננומטר בין מוטות תמיכה המסננת ולהרכיב הסט המיני-המכבש. בדקו את הזליגה הפוטנציאלית עם מים די. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את אחד של מזרקים עם 1 מ&quot;ל של תמיסת ליפוזום משלב 2.4 ו extruדה המדגם על ידי העברת הפתרון המזרק בקצה השני של מיני-מכבש להרכיב. חזור 11 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ליפוזומים המסונתז דרך טור desalting PD-10 כדי להסיר את צירופי Au חינם, שומני calcein באמצעות PBS כמו eluent על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את דגימות צינורות סטרילית ב 4 ° C ולהשתמש ב 2 ימים. </li></ol> 3. שחרור Calcein מ ליפוזומים עם חימום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את השומנים molarity של פתרון המניות על ידי הוספת את molarities של DPPC, MPPC, ו DSPE-PEG2000 בשלב 2.2. לדלל את הפתרון המניות ליפוזום ריכוז השומנים 5 מ&quot;מ באמצעות חיץ 0.1 מ&quot;מ PBS (pH 7.4). העברת דגימות צינור צנטריפוגות (2 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור בתוך אמבט מים חמים, ומעלים את הטמפרטורה באופן הדרגתי מ -25 עד 70 מעלות צלזיוס. העלו את הטמפרטורה בשיעור של 1 ° C / min כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף aliquots (10 μl) בנקודות טמפרטורה שונות (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 ו -70 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 2% טריטון X-100 2 מ&quot;ל aliquot של פתרון liposomal לעכל את ליפוזומים במשך 10 דקות ב RT, וכדי להשיג את השחרור המלא של calcein. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 200 μl של פתרון liposomal לכל היטב microplate 96-היטב למדוד את עוצמת הקרינה של דגימות שנאספו באמצעות קורא microplate פלואורסצנטי. אורכי גל העירור והפליטה של ​​calcein הם 480 ו 515 ננומטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניקח את עוצמת הקרינה של דגימות מטופלים X-100 Triton 100 שחרור%, בחישוב אחוז של calcein שוחרר בכל נקודת זמן, באמצעות הנוסחה: <img alt="פורמולה 1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> Ft הוא עוצמת הקרינה של הפתרון בנקודת זמן נתונה. אני F ו- x F היא עוצמות קרינה התחלתי וסופי המנורמלת של הפתרון בהתאמה. </li></ol> 4. Calcein Reלחכור מן ליפוזומים עם ליזר פעם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר פתרון liposome 100 μl קובט קוורץ ולמקם אותו בפמוט קובט. השתמש פעם Nd: YAG ליזר עם משך פעימה של 6 NSEC באורך גל 532 ננומטר כמקור אור. השתמש בפרמטרי הליזר הבא - שיעור ההחזרה: 1 רץ; צפיפות האנרגיה לייזר: 1 mJ / 2 ס&quot;מ; Beam קוטר: 0.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדריך את קרן הלייזר collimated דרך קובט כך האור עובר דרך הפתרון liposome ולאסוף aliquots לאחר פולסים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 2% טריטון X-100 2 מ&quot;ל aliquot של פתרון liposomal לעכל את ליפוזומים במשך 10 דקות ב RT, וכדי להשיג את השחרור המלא של calcein. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתחשב calcein הוא רגיש לאור ויכול להיות מולבן במהלך ניסוי הליזר, מראש למדוד את האפקט הלבן של ליזר פעם על פתרון calcein לנרמל את הנתונים מהשקת liposome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ספציפי, לחשוף פתרון calcein (60 מ&quot;מ) כדי wi לייזר פעמותדירות ה 1 הרץ עבור מספרים שונים דופקים (0, 25, 50 ו -100). למדוד את עוצמת הקרינה של calcein עם אורכי גל עירור ופליטה של ​​ננומטר 480 ו 515 בהתאמה, לפני ואחרי החשיפה לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום של הלבנה (עוצמת הקרינה של calcein לפני עוצמת ליזר חשיפה / קרינה של calcein לאחר מספר הדופק הספציפי). השתמש גורם זה לנרמל את הערכים שהתקבלו דגימות liposome על ידי הכפלת עוצמת הקרינה של ליפוזומים עם הגורם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את עוצמת הקרינה של המדגם נאספו באמצעות קורא microplate הקרינה באורכי גל עירור ופליטה ב ננומטר 480 ו 515 בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניקח את עוצמת הקרינה של דגימות מטופלים X-100 Triton 100 שחרור%, בחישוב אחוז של calcein שוחרר בכל מספר הדופק, באמצעות הנוסחה: <img alt="פורמולה 1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> אני F ו- x F היא עוצמות קרינה התחלתי וסופי המנורמלת של הפתרון בהתאמה. </li></ol> מדידת 5. דחפים לחצו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100 μl של מדגם בשקופית מיקרוסקופית להגדיר את מיקוד של ליזר על מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים hydrophone מחט (בקוטר 1 מ&quot;מ ו -450 רגישות NV / Pa) לתוך התמיסה. זהירות: hydrophone אסור להיות מואר על ידי אור לייזר כדי למנוע את הנזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרין את המדגם עם הליזר פעם עם מספרי דופק משתנה (0-100) ואנרגיה דופקת (20-160 μJ / דופק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את אותות הלחץ באמצעות אוסצילוסקופ דיגיטלי. </li></ol>

<ol><li>McCoy, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+drug+delivery+from+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Triggered drug delivery from biomaterials.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).</li>
<li>Yavuz, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanocages+covered+by+smart+polymers+for+controlled+release+with+near-infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light.</a> Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).</li>
<li>Gohy, J. F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-responsive+block+copolymer+micelles%3A+design+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior.</a> Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).</li>
<li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).</li>
<li>Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+testing+of+a+new+temperature-sensitive+drug+delivery+system+for+the+treatment+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).</li>
<li>Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+drug+delivery+and+hyperthermia%3A+the+materials+design+and+preclinical+and+clinical+testing+of+low+temperature-sensitive+liposomes+used+in+combination+with+mild+hyperthermia+in+the+treatment+of+local+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Nanomed.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer.</a> Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).</li>
<li>Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+exposure+in+animals+can+be+visualized+in+the+skin+and+analysed+via+skin+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy.</a> Nat. Commun. 5, 3796(2014).</li>
<li>Paasonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+enable+selective+light-induced+contents+release+from+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes.</a> J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remotely+Triggered+Liposome+Release+by+Near-Infrared+Light+Absorption+via+Hollow+Gold+Nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).</li>
<li>Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+Light-Induced+Release+from+Plasmon+Resonant+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes.</a> Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).</li>
<li>Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-IR+Remote+Release+from+Assemblies+of+Liposomes+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).</li>
<li>Mills, J. K., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolipid+incorporation+in+dipalmitoylphosphatidylcholine+bilayer+membranes+enhances+the+ion+permeability+and+drug+release+rates+at+the+membrane+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).</li>
<li>Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+Photothermal+Conversion+Efficiencies+of+Plasmonically+Heated+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles.</a> J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).</li>
<li>Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChongsiriwatana%2C+N+%22Antimicrobial+Peptides%22">Antimicrobial Peptides</a>. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).</li>
<li>Egerev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+signals+generated+by+laser-irradiated+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles.</a> Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).</li>
<li>González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+size-dependent+photoacoustic+effect+on+gold+nanoparticles+by+laser-induced+nanobubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles.</a> Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים מוכרזים.

הידרציה סרט דקה היא השיטה מקובלת להכנה ליפוזומים. ממסים אורגניים (כלורופורם במקרה זה) שמשו ראשון לפרק את השומנים ולאחר מכן מוסר מאייד רוטרי ב 37 ° C כדי ליצור סרט דק שומנים על הבקבוק. הסרט השומנים זו hydrated עם בתמיסה מימית המכילה 60 מ&quot;מ calcein ו -5 ננומטר Au צירופים. במהלך תהליך הידרציה, הטמפרטורה נשמרה סביב 50 מעלות צלזיוס, הבקבוק היה נסער כל הזמן על ידי החלפה של הבקבוק. המפתח בשלב זה הוא הבחירה של הטמפרטורה שבה אידוי הידרציה בוצעו בהתאמה. הטמפרטורה המעבר לשלב (מ</su...

האפשרות להפעיל שחרור התרופה באמצעות גירויים חיצוניים היא דרך אטרקטיבית אפשר לשלוח את התרופות באופנת spatial-, temporal- והמינון שבשליטת עם ייחוד מוגדל ותופעות לוואי מינימליות. בין מגוון רחב של מערכות גירויים תגובה אקסוגניים (אור, השדה המגנטי, אולטרסאונד, קרינת מיקרוגל), פלטפורמות אור מופעלות הם אטרקטיביים, בשל אי-הפולשנות, פשטות והתאמה שלהם במרפאות. 1 מחקר מקיף בעשור האחרון ספק מגוון של טכנולוגיות פלטפורמה, כגון זהב אחראי קרוב אינפרא אדום-אור (Au) nanocages מצופה פולימרים חכמים, 2 חלקיקי צילום יציב, פולימריים (NPS) מצומדות עם סמים, 3 ו nanovesicles porphysome העצמית התאסף. 4 עם זאת , טכנולוגיות אלה הן עדיין בשלבים פרה-הקליני של פיתוח, ודורשות הבנה ואופטימיזציה ברורה של הפרמטרים המעורבים בתהליך של ייזום המשךלגלגל את שחרור התרופה. אחת השיטות הפשוטות ביותר ונגיש להכנת מערכת כזו היא לשלב Au צירופים עם ליפוזומים תרמית רגיש 5,6, אשר שניהם זמינים באופן נרחב בשוק נחקרו בהרחבה בניסויים בבעלי חיים ואפילו קליניים. למרות המגבלה של הפעלת רקמות עמוק של Au צירופים באורך גל plasmonic שלהם, בהשוואה ננו האינפרה-אדום הקרוב המופעל Au (למשל, nanocages), מערכת זו עדיין טומן בחובו הבטחה גדולה כאשר נעשה שימוש בבעלי חיים קטנים או למסירה אקטואלי בבני אדם. 7 יש כמה מאמצים מוקדם שילוב Au צירופים עם ליפוזומים לשחרור אור מופעל. 8-11 בעוד רובם מתמקדים החידוש של חומרים, בעיות נגישות ויכולת רחבת צורך לטפל. יתר על כן, דיווחים על מנגנוני שחרור באמצעות nanocarriers אלה עדיין מוגבלים. בזאת, ייצור של צילום-תגובהליפוזומים, נטען בו זמנית עם תרופות הידרופיליות Au צירופים תוארה. Calcein משמש כמתחם מודל כדי להעריך את יעילות אנקפסולציה ופרופיל שחרורו של המערכת. בנוסף, במערכת זו, האור נספג על ידי Au צירופים מתפוגג אל microenvironment שמסביב בצורה חומה, וכתוצאה מכך לעלייה בטמפרטורה המקומית. Microbubbles האוויר נוצר במהלך חימום הליזר ולגרום הפרעה מכאנית של ליפוזומים (איור 1). המנגנון של cavitation microbubble אושר על ידי מדידות hydrophone.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (אלבמה, ארה"ב)</td><td>850355P</td><td>אבקה, יש לאחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (אלבמה, ארה"ב)</td><td>855675P</td><td>אבקה, יש לאחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום) (DSPE-PEG2000)</td><td>אבקת Avanti Polar Lipids (אלבמה, ארה"ב)</td><td>880120P</td><td>, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>ננו-חלקיקי זהב</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>752568-100 מ"ל</td><td>5&nbsp; חלקיקי ננומטר, מיוצבים ב-0.1&nbsp; מ"מ PBS</td></tr><tr><td>סיגמא</td><td>אולדריץ'</td><td>C0875-10 גרם</td><td>60&nbsp; mM, pH 7.4 (מותאם באמצעות NaOH)</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>0.1 מ"מ, pH 7.4</td></tr><tr><td>מים מזוקקים כפולים</td><td>Millipore Milli-DI מערכת</td><td></td><td></td>טיהור מים</tr><tr><td>Triton X100&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא, מדעי החיים</td><td>X-100</td><td>כדי לשבש את הליפוזומים לחישוב האנקפסולציה הכוללת</td></tr><tr><td>Rotavapor&nbsp; &nbsp;</td><td>בוצ'י (שוויץ)</td><td>R 210</td><td>משמש להכנת ליפוזוזמה</td></tr><tr><td>אמבט חימום</td><td>בוצ'י (שוויץ)</td><td>B 491</td><td>משמש להכנת ליפוזוזמה</td></tr><tr><td>בקר ואקום&nbsp; &nbsp;</td><td>בוצ'י (שוויץ)</td> <td>V-850</td><td>משמש להכנת ליפוסוזמה</td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>בוצ'י (שוויץ)</td> <td>V-700</td><td>משמש להכנת ליפוזוזמה</td></tr><tr><td>אמבט מחזור עם בקר טמפרטורה</td><td>Polyscience</td><td></td><td>משמש להכנת ליפוזוזמה</td></tr><tr><td>מכלול מיני מכבש עם בלוק חימום&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids (אלבמה, ארה"ב)</td><td>610000</td><td>משמש לשחול של מזרקי ליפוזומים</td></tr><tr><td>, 1,000 & #956; l</td><td>ליפידים קוטביים אוונטי (אלבמה, ארה"ב)610017</td><td></td> <td>משמש לשחול של ליפוזומים</td></tr><tr><td>קרום מסנן פוליקרבונט, 200&nbsp; nm</td><td>Whatmann</td><td>800281</td><td>משמש לשחול של ליפוזומים</td></tr><tr><td>תמיכה במסנן</td><td>שומנים קוטביים אוונטי (אלבמה, ארה"ב)</td><td>610014</td><td>משמש לשחול של ליפוזומים</td></tr><tr><td>PD 10 קולומנים מתפלים, Sephadex G-25 בינוני</td><td>GE Healthcare, מדעי החיים</td><td>17-0851-01</td><td>משמש לטיהור הליפוזומים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה&nbsp; &nbsp;</td><td>צנטריפוגות מעבדה סיגמא</td><td>3K30</td><td>משמשות לריכוז התמיסה הליפוזומלית&nbsp;</td></tr><tr><td>רוטור</td><td>סיגמא</td><td>19777-H</td><td>משמש לריכוז התמיסה הליפוזומלית&nbsp;</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp; &nbsp;</td><td>Nano ZS Malvern</td><td></td><td>משמש לקביעת גודל הליפוזום</td></tr><tr><td>וספקטרופוטומטר גלוי UV</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2450</td><td>משמש למדידת ספיגת הדגימות</td></tr><tr><td>ספקטרופלואורומטר פלואורסצנטי&nbsp; &nbsp;</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>SpectraMax M5</td><td>משמש למדידת פליטת הקרינה של הדגימות</td></tr><tr><td>Nd:YAG לייזר</td><td>NewWave Research</td><td></td><td>532 ננומטר; הספק מרבי: 17&nbsp; מ.ג'י; רוחב: 406&nbsp; nsec; משמש להקרנה מדגמית</td></tr><tr><td>HNR הידרופון ONDA</td><td></td><td>HNR-1000</td><td>קוטר 1 מ"מ ורגישות 450 nV/Pa, טווח תדרי עבודה תקין: 0.25-10&nbsp; מגה-הרץ; כיול: 50&nbsp; mV/בר; משמש למדידת האותות האקוסטיים</td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ דיגיטלי</td><td>LECORY - Wave Runner 64Xi-A</td><td></td><td>תדר: 600 מגה-הרץ; קצב דגימה מקסימלי: 10&nbsp; Gs/sec (בשני ערוצים); משמש להקלטת האותות האקוסטיים הנמדדים</td></tr></tbody></table>

סינתזה של משולב זהב nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

ננו-חלקיקים מגיבים לאור (NPs) זכו לתשומת לב ניכרת בגלל הפוטנציאל שלהם לספק שליטה מרחבית, זמנית ומינון על שחרור התרופה. עם זאת, רוב הטכנולוגיות הרלוונטיות עדיין בתהליך פיתוח ואינן ניתנות לרכישה על ידי מרפאות. כאן, אנו מתארים ייצור קל של NPs מגיבים לאור אלה עם NPs זהב זמינים מסחרית וליפוזומים מגיבים לחום. קלצין משמש כתרופת מודל להערכת יעילות האנקפסולציה והפרופיל הקינטי של השחרור בעת גירוי חום/אור. לבסוף, אנו מראים כי שחרור זה המופעל על ידי פוטו נובע מהפרעה בממברנה הנגרמת על ידי קוויטציה של מיקרו-בועות, שניתן למדוד באמצעות הידרופון.

ליפוזומים אלה נערכו על בסיס טכניקה הידרציה סרט דק קונבנציונלי עם DPPC, MPPC ו DSPE-PEG2000 ב טוחנת יחס של 86: 10: 4 או 7.95: 0.65:. 1.39 מ&quot;ג / מ&quot;ל 12 הגודל של Au צירופים היא קריטית כדי לקבוע את האור מרה יעילה לחום במהלך ניסוי עירור הליזר הבא. הקטן בגודל של Au NPS, הגבוהה הוא יעילות transducing. 13 לפיכך 5 ננומטר Au צירופים, דגימות הקטנות מהספק, נבחרו אנקפסולציה. במהלך הסינתזה, בינוני לחות המכיל Au NPS ו calcein התווס...

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנה פשוטה עבור ננו-חלקיקים מזהב משולב ליפוזומים צילום מגיבים עם חומרים זמינים מסחרית. הוא גם מראה כיצד למדוד את תהליך cavitation microbubble של ליפוזומים מסונתז על טיפול של לייזר פעמו.

סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים סינתזה של ליפוזומים המגיבים לאור ולחשוף את המנגנון לשחרור תרופות מליפוזומים אלו בשליטה באמצעות אור. שיטה זו מסייעת במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לתגובה של ליפוזומים לאור לצורך הולכת תרופות, כאשר האתגרים המרכזיים הם סינתזת הליפוזומים ושיפור רמת השחרור המבוקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא סינתזת תאי ליפוזומים המגיבים לאור באמצעות חומרים זמינים מסחרית.ההשלכות של טכנולוגיה זו משתרעות על טיפול ברקמות שטחיות. השימוש בפרוצדורות פולשניות מינימליות, כמו גם חלק ממכשיר הלייזר, יהפכו את פלטפורמת הטכנולוגיה לנגישה יותר עבור המטופלים. בנוסף למתן תובנות לגבי טיפול מיטבי והולכה מדויקת של תרופות, ניתן ליישם את המערכת שלנו גם על מערכות אחרות, כגון בעלי חיים קטנים וכן על מערכת הריריות באמצעות לייזרים מודרכים.ראשית, נקו בקבוק תחתית עגולה בנפח 100 מיליליטר באמצעות Aqua regia. לאחר שטיפה במים דה-יוניים ואוטוקלביזציה, ייבשו את הבקבוק בתנור אוויר חם בטמפרטורה של 100 degrees Celsius למשך 15 דקות. לאחר מכן, עטפו ואחסנו את הבקבוק הסטרילי עד לשימוש.סטריליזציה של סט מיני-אקסטרודר ידני באמצעות 70% Ethanol. לאחר מכן, הפעל את המאדה הסיבובי (rotary evaporator) והגדר את הטמפרטורה של אמבט המים החמים ואת מגדל הקירור ל-37 ו-4 degree Celsius, בהתאמה. הכן תמיסת סטוק של Calcium בריכוז 60 millimolar על ידי המסה של 374 milligrams של Calcein ב-10 milliliters של Phosphate buffered saline או PBS בריכוז 0.1 millimolar.כוון את ה-pH ל-7.4 באמצעות תמיסת Sodium Hydroxide בריכוז one mollar. הוצא את הליפידים מהמקפיא והפשר אותם לטמפרטורת החדר. לאחר הפשרת הליפידים, המס 15.9 milligrams של DPPC, ‏1.3 milligrams של MPPC ו-2.8 milligrams של DSPE-PEG2000 בשני milliliters של Chloroform.לאחר העברת תמיסת הכלורופורם לבקבוק תחתית עגולה סטרילי, אידו את הממס באמצעות מאדה סיבובי תחת לחץ מופחת כדי ליצור שכבת ליפידים דקה ויבשה. לאחר מכן, הידרט את שכבת הליפידים בטמפרטורה של 45 degree Celsius עם שני מיליליטרים של תמיסה מימית המכילה 1.95 מיליליטרים של תמיסות Calcium 60 millimolar שהוכנו מראש ו-50 microliters של ננו-חלקיקי זהב למשך 30 דקות. חמם מראש בלוק חימום לטמפרטורה של 45 degree Celsius.הניחו מסנן ממברנת פוליקרבונט של 200 nanometer בין תומכי המסננים והרכיבו את סט המיני-אקסטרודר. לאחר מכן, בדקו דליפות פוטנציאליות באמצעות מים דאיוניים. מלאו את אחת המזרקים ב-1 milliliter של תמיסת הליפוזומים שהוכנה קודם לכן, ובצעו אקסטרוזיה לדגימה על ידי העברת התמיסה דרך המזרק בקצה השני של המיני-אקסטרודר המורכב.לאחר חזרה על השלב הקודם 11 פעמים, העבירו את הליפוזומים המסונתזים דרך עמודת הסרת מלחים PD-10 כדי להסיר את ננו-חלקיקי הזהב החופשיים, הליפידים וה-Calcein, תוך שימוש ב-PBS כאלואנט בהתאם לפרוטוקול היצרן. עם הסיום, אחסנו את הדגימות במבחנות סטריליות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. בנקודה זו, חשבו את המולריות הליפידית של תמיסת המלאי על ידי סיכום המולריות של DPPC, MPPC ו-DSPE-PEG2000.דללו את תמיסת המקור של הליפוזום לריכוז שומן של 5 millimolar באמצעות 0.1 millimolar PBS, ולאחר מכן העבירו את הדגימות למבחנות צנטריפוגה של 2 milliliters. לאחר מכן, הניחו את המבחנות במסבך מים חמים והעלו את הטמפרטורה בהדרגה מ-25 ל-70 degrees Celsius. אספו מנות של 10 microliter בנקודות טמפרטורה שונות.הוסיפו 10 µL של Triton X-100 בריכוז של 2% למכסה של 2 mL של תמיסת ליפוזומים, כדי לעכל את הליפוזומים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשיג שחרור מלא של Calcein. לאחר מכן, העבירו 200 µL של תמיסת הליפוזומים לכל באער במיקרו-פלטה בעלת 96 באערים. מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה של הדגימות שנאספו באמצעות קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי.כאשר עוצמת הפלואורסצנציה של הדגימות שטופלו ב-triton x-100 נחשבת ל-100 אחוזי שחרור, חשבו את אחוז ה-Calcein ששוחרר בכל נקודת זמן באמצעות הנוסחה הבאה: העבירו 100 µL של תמיסת הליפוזומים לקובטת קוורץ והניחו את הקובטת במחזיק קובטות. העבירו את קרן הלייזר המקבילה דרך הקובטת כך שהאור יעבור דרך תמיסת הליפוזומים. לאחר מכן, אספו אליקוטות לאחר פולסים שונים.לאחר מכן, הוסף 10 µL של 2% triton x-100 למדגם של 2 mL של תמיסה ליפוזומלית כדי לעכל את הליפוזומים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשיג שחרור מלא של Calcein. כדי למדוד מראש את אפקט ההבהרה (bleaching) של הלייזר על תמיסתו של ה-Calcein, חשוף את התמיסה ללייזר בתדר של 1 Hz למספר פולסים משתנה. מדוד את עוצמת הפלואורסצנציה של Calcein עם אורכי גל של עירור ופליטה של 480 ו-515 nm בהתאמה, לפני ואחרי החשיפה ללייזר.לאחר חישוב כמויות ההלבנה, השתמש בגורם זה כדי לנרמל את הערכים שהתקבלו מדגימות הליפוזומים על ידי הכפלת עוצמת הפלואורסצנציה של הליפוזומים בגורם. לאחר מכן, מדוד את עוצמת הפלואורסצנציה של הדגימה שנאספה באמצעות קורא מיקרו-פלייטים פלואורסצנטי באורכי גל עירור ופליטה של 480 ו-515 ננומטרים, בהתאמה. כאשר עוצמת הפלואורסצנציה של הדגימות שעובדו ב-triton x-100 נחשבת כ-100% שחרור, חשב את אחוז ה-Calcein ששוחרר בכל מספר פולס.הניחו 100 µL מהדגימה על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ, ולאחר מכן כוונות את מוקד הלייזר אל הדגימה. הלייזר מונחה דרך הדגימה באופן ידני, לכן חשוב לוודא שנקודת המיקוד של הקרן נמצאת היטב בתוך הדגימה ולא על זכוכית המיקרוסקופ כדי למנוע תקלות בהמשך. לאחר מכן, טבלו הידרופון מחטי בתוך התמיסה.קצה ההידרופון מושקע במדגם במרחק מספיק מנקודת המוקד של הלייזר. פעולה זו נועדה למנוע נזקים להידרופון שעלולים להיגרם מהלייזר. הקרינו את המדגם באמצעות לייזר פולסי עם מספר פולסים ואנרגיית פולס משתנים.לבסוף, רשמו את אותות הלחץ באמצעות אוסצילוסקופ דיגיטלי. לא נצפתה הבדל משמעותי באחוז השחרור עבור הליפוזומים עם ובלי ננו-חלקיקי זהב. הליפוזומים נותרו כמעט שלמים בטמפרטורה פיזיולוגית, עם אחוז דליפה של פחות מ-10 אחוזים, עם או בלי ננו-חלקיקי זהב.כאשר הטמפרטורה הועלתה ל-42 °C, שוחררו 60 עד 80 אחוזים מה-Calcein העטוף מהליפוזומים בתוך שתי דקות. ליפוזומים עם ננו-חלקיקי זהב שחררו את ה-Calcein העטוף בעקבות עירור, כאשר כמות ה-Calcein ששוחררה עלתה ככל שמספר הפולסים עלה. האותות האקוסטיים שנרשמו עבור ננו-חלקיקי הזהב, הליפוזומים עם ננו-חלקיקי הזהב והליפוזומים ללא ננו-חלקיקי זהב מוצגים כאן: דחף הלחץ, הכולל פאזות חיוביות ושליליות, מרמז על כך שמיקרו-בועות נוצרות ומתפוצצות בתמיסה.כצפוי, אמפליטודת האות האקוסטי עלתה בהדרגה עם העלייה באנרגיית הלייזר, ודבר זה אמור לנבוע מעוצמת התנודה המוגברת של החלקיקים, התורמת להתרחבות ולהתכווצות תרמו-אלסטית עוקבת. לאחר השליטה בתהליך, ניתן לבצע את ייצור הליפוזומים בתוך 3 שעות, בתנאי שכל כלי הזכוכית והציוד הוכשרו מראש. בעת ניסוי השחרור המבוקר בלייזר, חשוב לזכור כי קרן הלייזר חייבת להיות ממוקדת לחלוטין על הדגימה כדי למנוע איבוד אנרגיה של הלייזר.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניסויים נוספים, כגון שחרור מבוקר בלייזר in vitro ו-in vivo, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כיצד ישפיעו תנאים פיזיולוגיים על השחרור המבוקר בלייזר. לאחר פיתוח זה, טכניקה זו תהיה כלי בעל ערך בתחום התגובתיות, לצורך חקר, מיקום ובקרה של שחרור לעור, לעיניים ולריריות.

synthesis-gold-nanoparticle-integrated-photo-responsive-liposomes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מראים את ההכנה ומתייחסים להיתכנות של כלי רכב סלולריים המכילים ננו-מוטות זהב להדמיה פוטו-אקוסטית של סרטן.

ניתוח הכנת photoacoustic של כלי רכב ניידים המכילים Nanorods הזהב

פיזור רווי ורווי הפוך התגלו בחלקיקים פלזמוניים מבודדים ואומצו כשיטת ניגודיות חדשה ללא הלבנה במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. כאן מוסברים בפירוט ההליכים הניסיוניים של איתור וחילוץ פיזור לא ליניארי, כמו גם כיצד לשפר את הרזולוציה בעזרת מיקרוסקופ עירור רווי.

מדידת פיזור אי-לינאריות מNanoparticle Plasmonic יחיד

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לניטור שילוב של ננו-חלקיקים במטריצת מארח פולימרית באמצעות אנקפסולציה של נפיחות. אנו מראים כי ניתן לדמיין במדויק את ריכוז פני השטח של נקודות קוונטיות של קדמיום סלניד באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות חתך.

ניתוח ההלחנה מתקדם של מרוכבים Nanoparticle-פולימר באמצעות דימות פלואורסצנטי ישיר

אנו מתארים שיטה של סינתזה ביולוגית חלקיקי זהב 10 ננומטר, functionalized על ידי ציפוי פולי-אתילן גליקול על גבי המשטח. חלקיקים אלה יכולים להיות בשימוש במבחנה , ויוו להעברת הרפוי לחללים הסלולר, חוץ-תאית ננו אשר קשות לגישה עם גדלים nanoparticle קונבנציונלי.

סינתזה של Functionalized 10-nm פולימר מצופה זהב חלקיקים אנדותל הכוונת משלוח סמים

פרוטוקול זה מדגים את התגרענות לשליטה של קוויטציה ב פנטומים ג'ל, באמצעות חשיפה סימולטני-סגול אור פעמו לייזר והן בעוצמה גבוהה, ממוקדת אולטרסאונד (HIFU). הפעילות קוויטציה יכול לשמש לאחר מכן לשיפור השימושים HIFU הדמיה ו/או טיפולית.

התגרענות לשליטה של קוויטציה מן Plasmonic חלקיקי זהב לשיפור בעוצמה גבוהה ממוקד יישומים אולטרסאונד

שיטה אמינה ומתוכעת בקלות להכנת הפונקציונל, הקרוב-אינפרא-אדום פולט ננו אשכולות זהב והגילוי הישיר שלהם בתוך תאי הלה על ידי הזרמת cy, ומיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד מתוארת.

סינתזה של כמעט אינפרא-אדום פליטת מזהב ננו אשכולות עבור יישומים ביולוגיים

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים המשמשים להפקת פלטפורמת אספקת חיסונים חדשנית, "polybubbles", כדי לאפשר שחרור פרץ מושהה. פוליאסטר כולל פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית) ו polycaprolactone שימשו כדי ליצור את polybubbles מולקולות קטנות ואנטיגן שימשו מטען.

ייצור של פלטפורמת אספקת חיסונים רגישה כמעט לאפרה-אדום, Core-Shell

עבודה זו מתארת פרוטוקול להשגת ניטור דינמי ולא פולשני של העברת חום מננו-חלקיקי זהב מוקרנים בלייזר ל- tBLMs. המערכת משלבת ספקטרוסקופיית עבלה למדידה בזמן אמת של שינויי מוליכות על פני tBLMs, עם קרן לייזר ממוקדת אופקית המניעה תאורת ננו-חלקיקים מזהב, לייצור חום.

ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים

פרוטוקול לסנתז ~ 12 ננומטר זהב קוטר חלקיקים (Au חלקיקים) בממס אורגני מוצג. חלקיקי הזהב מכוסים ליגנדים אוליאמין כדי למנוע agglomeration. חלקיקי הזהב מסיסים בממסים אורגניים כגון טולואן.

סינתזת חלקיקי זהב

הפרוטוקולים המוצגים יכולים לשמש כדי לאפיין את התגובה של microbubbles תווית פלואורסצנטית המיועדים ליישומי משלוח תרופות המופעלות על ידי אולטרסאונד, כולל מנגנוני ההפעלה שלהם, כמו גם bioeffects שלהם. נייר זה מכסה מגוון של טכניקות מיקרוסקופיה במבחנה ו - in vivo המבוצעות כדי ללכוד את האורך ואת לוחות הזמנים הרלוונטיים.

שיטות מיקרוסקופיה מרובות זמן לאפיון של Microbubbles פלואורסצנטרית שכותרתו לשחרור תרופות מופעלות אולטרסאונד

אבלציה מהירה במיוחד בלייזר בנוזל היא טכניקה מדויקת ורב-תכליתית לסינתזה של ננו-חומרים (ננו-חלקיקים [NPs] וננו-מבנים [NSs]) בסביבות נוזל/אוויר. ננו-חומרים בלייזר יכולים להיות פונקציונליים עם מולקולות פעילות ראמאן כדי לשפר את אות הרמאן של אנליטים הממוקמים על או ליד NSs/NPs.

ננו-חלקיקים וננו-מבנים מהירים במיוחד בלייזר עבור יישומי חישה מבוססי פיזור ראמאן משופרים בפני השטח

למד את סינתזת הליפוזומים הרגישים לאור המשולבים בננו-חלקיקי זהב לשחרור תרופות מבוקר. שיטה זו מדגימה מנגנון שחרור מופעל לייזר וקוויטציית מיקרו-בועות לטיפול ברקמות שטחיות.

סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

גלה סרטונים נוספים