הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

המטרה הכללית של הליך הש transplantation של רקמה זו ex vivo היא לשפר את האיסוף ולהרחיב את היישום של תאי אפיתל אנדודרמליים של עוף, במטרה לחקור את תפקודם של אנזימים וחלבונים בתהליך התווך של ניצול רכיבי תזונה על ידי עוברים של עוף. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לניצול ליפידים במהלך העוברות של עוף, כגון האופן שבו ליפידים מהחלמון נארזים ומועברים מהחלמון לעובר בשלבים המאוחרים של ההתפתחות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להפיק בהצלחה תאי אפיתל אנדודרמליים תפקודיים מממברנת שק החלמון של ברקת יפנית, אשר יכולים לשמש כמודל למחקר של התפתחות עוברים של עוף.

התחילו בהכנת תמיסת PBS 10x כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. דללו תמיסת מלאי זו ביחס של אחת לעשר כדי להכין PBS 1x, אשר תשמש לשטיפת ממברת שקי החלמון במהלך דיסקציה של האנדודרמה. להכנת מצע גידול עבור תאי אפיתל אנדודרמליים, או EECs, הוסיפו תחילה ל-DMEM/F-12 תוספת של 10% newborn calf serum ו-1% penicillin streptomycin amphotericin solution.

לאחר מכן, הכניסו את הפרובה של מד pH לתוך DMEM שהוכן מראש. הוסיפו טיפות של HCl נורמלי שלושה למצע עד שה-pH יותאם ל-7.2. לאחר איסוף של כ-24 ביצי שלוהים הפוריות, הניחו אותן בצורה אנכית במיכלים לביצים, כך שחלקן הרחב שאינו מחודד, שבו נמצאים תאי האוויר, פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, העבירו את הביצים לדגרה מאווררת המכוונת ל-37 degrees Celsius. לאחר חמישה ימי דגירה, בחנו את הביצים באמצעות פנס לבדיקת ביצים (egg candler). אם העוברים התפתחו באופן תקין, ניתן יהיה לראות מבנה מעגלי של כלי דם נימיים מתחת לתא האוויר.

בחרו ביצה המראה התפתחות קפילרית תקינה, ונקו את הקליפה בעזרת מים טריים ו-75% ethanol. לאחר מכן, פתחו את קליפת הביצה במיקום תא האוויר בעזרת מספריים. השתמשו בפינצטה כדי לסייע בעדינות לשפוך את תכולת הביצה אל תוך צלח תרבית ריק בקוטר 10 cm.

לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי להפריד את העובר, החלמון וכל שארית אלבומין מממברנת שק החלמון, המכונה בקיצור YSM. לאחר הבידוד, שטפו את ה-YSM שלוש פעמים ב-1x PBS, ולאחר מכן העבירו אותה לצלחית חדשה של 10 cm המכילה PBS. לאחר מכן, הניחו את הצלחית תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

לאחר מכן, הסר בעזרת מספריים את שאריות החלבון של הביצה הגובלות בשכבת האקטודרמה החיצונית של ה-YSM. המשך בשימוש בפינצטה כדי להרים את האקטודרמה השקופה ואת המזודרם של מבנה הנימיים האדומים מקצה המזודרם על קרום שק החלמון. לאחר מכן, קלף בעדינות את האקטודרמה והמזודרם יחד כדי לבודד את שכבת תאי האנדודרמה שמתחתיהם.

לאחר מכן, החזק בחוזקה בעזרת זוג פינצטות את שכבת התאי אנדודרמה הצהובה של הממברנה. בעזרת זוג פינצטות נוסף, אחז את המזודרמה של הנימיים, והמשך למשוך את המזודרמה הרחק מקו החיבור שבין המזודרמה לאנדודרמה. בעזרת מספריים, גזור את שכבת האנדודרמה הצהובה שנותרה, והעבר אותה לצלחית תרבית של שישה סנטימטרים המלאה במצע גידול.

בעזרת טפטפת, העבירו את האנדודרמה הצהובה-בהירה מהצלחת התרבית בעלת קוטר שישה סנטימטרים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL לאחר איסוף ה-YSM, והוסיפו אליה 15 mL של מצע גידול שהוכן מראש. הניחו את המבחנה הקונית בבמבחלה של מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד להשלמת כל איסופי הרקמות. התחילו בהמסת 6.5 units של Type IV collagenase ב-10 mL של DMEM.

בשלב הבא, סובבו במערך צנטריפוגה את המבחנות המכילות את האנדודרם במהירות של 130 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, שאבו את המצע, והשתמשו בפיפטה להעברת כל דגימות האנדודרם לכלי תרבית בקוטר ששה סנטימטרים. לאחר מכן, הוסיפו לכלי התרבית 1 mL של תמיסת קולגן.

בעזרת מספריים קמורים, חתוך את האנדודרם שנאסף מארבעה עוברי שליו (quail) לפרוסות בגודל של כמעט שני עד שלושה מילימטרים. לאחר מכן, אסוף את הפרוסות לשפפור צנטריפוגה של 50 mL, המכיל תשעה מיליליטרים של תמיסת collagenase טרייה. כדי לשפר את השגשוג התאי בשלב האקספלאנט, הנח את השפפור במקבץ מים רוטט המוגדר ל-37 °C.

לאחר מכן, דגרו את השפופרת הקונית למשך 30 דקות כדי לעקש חלקית את הרקמה באמצעות collagenase. העיכול הפרוטאוליטי החלקי הוא השלב החשוב ביותר לשיפור איכות התאים הנאספים מהאנדודרמה של קרום שק החלמון. הנתונים שלנו מראים שיפור משמעותי בשיעור ההצלחה של תרביות התאים והשכפול התאי הודות להליך העיכול באמצעות collagenase.

לאחר העיכול באמצעות קולגנאז, סובבו את הרקמה בצנטריפוגה ב-130 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את תסמין הנוזל (supernatant) באמצעות פפיטה. המשיכו לשטוף את המשקע על ידי השעיה מחדש שלו ב-20 mL של DMEM. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה כפי שמתואר קודם לכן, ולאחר מכן הסירו את התסמין והשעו מחדש את המשקע ב-12 mL של מצע גידול.

לאחר מכן, העבירו בעדינות 500 µL מהסוספנזיה לכל באער של פלטה בעלת 24 באערים. המשיכו לדגירה של נתחי האנדודרמה למשך יומיים ב-37 °C ב-5% CO2. במהלך זמן זה, צפויות התאים להתרבות מחוץ לרקמות.

לאחר מכן, דגרו את התאים למשך יומיים נוספים. לאחר מכן, העבירו אותם בדיקת חיוניות תאים, והציגו את התוצאות באמצעות קורא לוחות (plate reader). לאחר מכן, בצעו RT-qPCR כדי להעריך את רמות הביטוי של סמנים רלוונטיים ב-EECs ובדקו את גודל המוצר מה-RT-qPCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

בהשוואה לרקמות מושתלות (explants) שלא טופלו, אלו שעברו עיכול חלקי באמצעות קולגנאז הפגינו עלייה משמעותית בשגשוג התאים, כפי שמוצג בגרפים אלו וכפי שנקבע באמצעות מבחן t מזווג, מה שמעיד על הצלחתו של מערכת התרבית. כדי להעריך את ההשפעות של אנזימים אחרים, בוצעו בדיקות חיוניות תאים לרקמות שטופלו בקולגנאז ודיספאז או בקולגנאז בלבד. במהלך חמשת ימי הדגירה הראשונים, צמיחת התאים הייתה דומה בשני התנאים.

עם זאת, מהימים השישי ועד התשיעי, רק תאי EEC שעובדו עם קולגנאז proliferated באופן עקבי, מה שמעיד על כך שעיכול חלקי באמצעות אנזים זה משפר את הצמיחה ויש להעדיף את השימוש בו. כאשר נבחנו תאי EEC בתרבית, הם הראו מאפיינים דמויי אדיפוציטים של טיפות שומן עגולות וגדולות, כפי שמוצג כאן. תאים אלה היו חיוביים גם לצביעת Oil Red O, המשמשת בדרך כלל לזיהוי אדיפוציטים.

בתימוך לנתונים מורפולוגיים אלו, בדיקת real-time quantitative PCR גילתה כי תאי EEC מתורגות מראים רמות גבוהות של SOAT1, חלבון המסנתז cholesterol ester מקולסטרול. דבר זה מחזק את הסברה כי תאי EEC מתורגות מציגים את המאפיינים הפיזיולוגיים הנכונים של אדיפוציטים. באופן משמעותי, כאשר תאי EEC נחשפו ל-IBMX ול-Forskolin, גורמים המעלים את רמות ה-cyclic adenosine monophosphate, או cAMP, ותורגדו למשך 24 שעות, שני הטיפולים ע กระตุ้น את ביטוי ה-SOAT1, מה שמרמז על מנגנונים אפשריים של ויסות SOAT1 וניצול ליפידים ב-YSM.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בכ-ארבע שעות, שבמהלליהן ניתן לאסוף לפחות שלוש דגימות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון SOAT1 או בדיקות אחרות של פעילות אנזימטית, כמו גם אישוש חזותי דומה. בדיקות אלו עשויות לסייע במתן תשובות לשאלות נוספות, כגון האופן שבו חלבונים ומאקרו-נוטריאנטים מסוימים מעורבים בשלבים המאוחרים של ההתפתחות העוברית.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ניצול רכיבי תזונה עובריים לבחון את המנגנון האפשרי שבאמצעותו רכיבי תזונה מנוצלים ומועברים במודל עוברי של עוף. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו ללמוד כיצד לאסוף רקמות אנדודרם מעוברי עוף, וכן תדעו כיצד לגדל EECs לצורך חקר הובלה וניצול של רכיבי תזונה עובריים באמצעות מודל העוף.