Name: הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: למד תרבית תאים אפיתליים אנדודרמיים מקרום הצק של שליו יפני לחקר מנגנוני ניצול ליפידים והעברת חומרי מזון לעובר. שיטה זו מספקת מודל אמין לחקר התפתחות עוברים עופיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי נתמך בעיקר על ידי &quot;לשאוף תוכנית Top אוניברסיטת&quot; של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן, טייוואן (מענק ID-104R350144), כמו גם את משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (ID מענק: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). תודה מיוחדת במרכז לביוטכנולוגיה של הלאומית טייוואן אוניברסיטת למתן חדר חיה ומרחב מעבדה לחקר הנוכחי.

הערה: הליך זה הוא שינוי של פרוטוקול תרבות מודל עוף שפותחה על ידי באואר ואח &#39;2013 Nakazawa ואח&#39;, 2011. 2,9.. 1. הכין בריא עוברי יום 5 עובר מן השליו יפני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 זכר ונקבה 3 שליו יפני בוגרים מינית יחד באותו כלוב. Feed היצע כרצונך מים. התאם את האור בחדר חיה ל -14 שעות של אור ו -10 שעות חושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ביצים מופרות בשקיות פלסטיק בכל יום בשעות אחר הצהריים ולשמור אותם במקרר 16 ° C לעכב את קצב הצמיחה של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף מספר מספיק של ביצים בתוך תקופה של שבועיים, לדגור על הביצים המופרות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אוורור טוב במשך חמישה ימים. </li></ol> 2. כן בסל בינוני לשטוף פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש DMEM / F-12 בינוני (מותאם pH 7.2) כמדיום הצמיחה, ומשלימים זהעם 10 סרום חדש נולד% עגל (NBCS) ו -1% פן-סטרפטוקוקוס Ampho. פתרון (PSA; פניצילין, 10 5 יחידות / L; סטרפטומיצין, 100 מ&quot;ג / L; Amphotericin B, 0.25 מ&quot;ג / ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בופר פוספט פתרון (PBS) בריכוז 10x לאחסון; לשימוש פתרון PBS 1x (המכיל NaCl, 137.93 מ&quot;מ; KCl, 2.667 מ&quot;מ; KH 2 4 PO, 1.471 מ&quot;מ; Na 2 HPO 4 -7 ש 2 O, 8.06 מ&quot;מ; להסתגל 7.2 pH) כדי לשטוף להרטיב אותו זמן קרום שק החלמון הפרדת endoderm מן החלמון אלבומין ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בינוני DMEM (מותאם pH 7.2) מחדש להשעות כדורי האנדודרם. </li></ol> אוסף 3. EECS ראשית ממנהל YSMs יפני שליו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים שנאספו במשך 5 ימים (שלב 1.3). בדוק את הביצים על ידי בודק ביצים כדי לאשר התפתחות עוברית נורמלית. הערה: ביום עוברי יום 5, הגבול של mesoderm YSM הוא מאוד ברורה ואת 3 השכבות העובריות הן פחות בחוזקה צמודות זו לזו, כך קל OBendoderm טיין. השתמש רק את הביצים מראות פיתוח זרימת נימים נורמלי אוספים YSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את קליפת הביצה באמצעות מים מתוקים בזהירות אתנול 75%. פתח את קליפת הביצה מעמדת תא אוויר על ידי זוג מספריים, לקלף בעדינות החוצה לאסוף את כל YSM ידי מלקחיים ומניחים בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ מלא 37 ° C 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מספריים להסיר את העובר, חלמון ביצה-לבן, לשטוף בעדינות את YSM עם 1x PBS שלוש פעמים ומניחים YSM בתמיסה PBS בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים וזוג מספריים כדי להסיר את האאקטודרם מ YSM. שימוש 2 מלקחיים, אחד להחזיק את שכבת תאי endodermal בתקיפות, ושני להחזיק את המזודרם נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לפרק ולהפריד את endoderm מהקצה של mesoderm בכיוון כלפי העובר. אסוף את endoderm אור צהוב 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגות באמצעות טפטפת ומניחים 15 מ&quot;ל של מדיום הגידול בתוך וואט 37 ° Cאה באמבטיה עד כל אוספי הרקמות הושלמו. </li></ol> 4. עיכול של פרוסות endoderm ידי Collagenase עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי לפזר 6.5 יחידות של collagenase מסוג IV ב 10 מ&quot;ל של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 50 מ&quot;ל צינורות (3.4) ב 130 XG 3 דקות ב RT. לשאוב את המדיום ולמקם כל endoderm בצלחת תרבות 6 ס&quot;מ בעזרת פיפטה. הוסף פתרון collagenase 1 מ&quot;ל ל צלחת תרבות זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את endoderm שנאספו 2 עוברים שליו עם זוג מספריים מעוקל עד לגודל של כל פרוסה הוא כ 2 עד 3 מ&quot;מ. השתמש טפטף, לאסוף את כל הפרוסות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר יחד עם 9 מיליליטר של תמיסת collagenase הטריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את הרקמה עם collagenase למשך 30 דקות באמבט מים רועד 37 מעלות צלזיוס ב 175 סל&quot;ד. עיכול חלקי זה עם collagenase משמש כדי לשפר את התפשטות תאי explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 130 XG 3 דקות ב RT בעדינות להסיר את החלק היחסי supernatant בעזרת פיפטה. שטפו את הכדור על ידי השעיית ב 20 מ&quot;ל DMEM ולהסיר את החלק היחסי supernatant לאחר צנטריפוגה 130 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את גלולה עם 12 מ&quot;ל של מדיום הגידול (DMEM / F12 עם 10% ו -1% NBCS PSA) וזרעי בעדינות שווה לתוך צלחת 24 גם (כל טוב עם 500 פתרון התא μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explants רקמות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר במשך 2 ימים כדי לאפשר לתאים להתרבות מתוך הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 2 ימים נוספים ולאפיין עבור כדאיות התא על ידי פרוטוקול assay כדאיות התא. 15 הערה: תאי חיים לשמור על סביבת הפחתה בתוך cytosol. Resazurin, המרכיב הפעיל, הוא תרכובת חדירה רעילה, תא זה כחול בצבע הלא ניאון כמעט. כאשר נוספו בתרביות תאים, resazurin מצטמצם resorufin ב cytosol על ידי אנזימים המיטוכונדריה. Resorufin הוא בצבע אדום ניאון מאוד. תאים חיים להמיר ברציפות resazurin כדי resorufin, increasing הקרינה והצבע הכולל של מדיום תרבות תאים הסובבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בידוד RNA הכולל תא אפיתל endoderm, הפוכה שעתוק בזמן אמת PCR כמותי של ביטוי mRNA הגן סמן כמתואר. 16,17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש PCR transcriptase הפוך לזהות SOAT1 mRNA (במובן: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; antisense: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; PCR מוצר = 168 נ&quot;ב) כסמן ספציפי עבור תאי EEC. השתמש β-תקטין mRNA (במובן: 5&#39;- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;; antisense: 5&#39;- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;; מוצר PCR = 151 נ&quot;ב) כמו גן משק ובקרה פנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ג&#39;ל אלקטרופורזה כדי לזהות את גודל המוצר של RT-qPCR. כן 1% ג&#39;ל agarose, ומערבב 10 μl מוצר qPCR עם צבע טעינה 2 μl. תערובת טען 10 μl היטב לתוך כל אחד בתוך הג&#39;ל agarose 1%, ולהפעיל את הג&#39;ל על ידי 100V במשך 30 דקות. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
<li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li>
<li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A%3A+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane%2C+liver%2C+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+%28Meleagridis+gallopavo%29+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li>
<li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li>
<li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li>
<li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li>
<li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li>
<li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li>
<li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li>
<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22alamarBlue+Cell+Viability+Assay+Protocol%22">alamarBlue Cell Viability Assay Protocol</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4">https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4</a> (2008).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3%CE%B2%2F%CE%B2-Catenin+signaling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li>
</ol>

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים. לא קיבלנו שום מימון מאף חברה פרטית.

כיוון שמערכת התרבות הקודמת יש הצלחה מוגבלת בלבד, מערכת התרבות טוב יותר הוא זקוק. Endoderm YSM שליו יפני נזקק לטיפול אנזימים מפרקי חלבונים כגון collagenase כדי לשחרר את הצמתים תאים תאים כדי להשיג ביצועים לצמיחה טובה יותר של explants-vivo לשעבר. הנתונים שלנו מראים כי מספרים סלולריים מטיפול עיכול חלקית היו גדולים יותר מן תרבות רקמות המעוכלת לאחר זריעת 2 ימים (איור 1). לכן, עיכול פרוטאוליטים חלקית הוא שלב קריטי כדי לשפר את תשואת תא מן YSM. <p class="jove_content" ...

המשאב התזונתי העיקרי של עובר העופות הוא חלמון, מורכב 33 שומני%, 17% חלבון, ו -1% אפר. 1 במהלך התפתחות עוברית, קרום צק חלמון (YSM) גדל מתוך חלל הבטן העוברי ובהדרגה מכסה את החלמון משטח. החל ביום עוברי 2, ביטוי גנים הקשורים לחילוף חומרי אנגיוגנזה שומנים הוא גדל בהדרגת YSM, ואת YSM מתפתחת לאט תחזיות סיסיות דמויות. 8,9 תחזיות אלו להגדיל ספיגת מזון בגוף חלמון לתמוך התפתחות עוברית. YSM הוא רקמת extraembryonic המכיל שלוש שכבות הנבט, האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם. 14 האאקטודרם שק חלמון פונה חלבון וקישורים עם קרום vitelline כדי לכסות את שק החלמון בעדינות. לתאי האפיתל endodermal מתמודדים ישירות לעבר חלמון ביצה ולשמש פורטלים ניצול מזין. 6 ככל YSM מתרחב, תא אפיתל endodermal (EECS) ניתן לחלק ידי shapדואר ופונקציונלי לשתי קבוצות, vitelline האזור והאזור vasculosa. 7 vitelline פינת מורכב של תאים endodermal והוא רחוק מן העובר; vasculosa באזור מורכב של תאי mesodermal ומכסה EECS בדיל עם כלי דם ורקמות חיבור. על ידי עוברי יום 5, החלמון מכוסה לחלוטין על ידי האאקטודרם ו endoderm של YSM ואזור וסקולרית גדל בקצב מהיר. YSM סופג, גורם לבנייה מחדש ומשחרר שומנים (כמו החלמון נגזר ליפופרוטאין בצפיפות נמוך מאוד) וחלבונים לתוך מערכת הדם העוברית. 9, 2 לכן, הקימו מערכת תרבית תאי אפיתל endodermal עוברית שליו יפנית עיקרית, כדי לחקור את המנגנונים של שומנים הנצילות YSM במהלך ההתפתחות העוברית העופות. ליפידים כגון triacylglycerol, לציטין, פוספוליפידים ואסתר כולסטרול (CE) הם מקורות האנרגיה העיקריים עוברות עופות. בשלבים המוקדמים של פיתוח, שומני חלמון הם גomposed של CE 1.3% בלבד והוא עולה ל 10-15% ב אמצע הקדנציה של פיתוח 3 עובריים העופות, 11. אסתר כולסטרול הוא מסונתז מכולסטרול על ידי 1-acyltransferase O sterol (SOAT1) ב YSM העובר העופות. 4 צורת האחסון של כולסטרול היא CE, CE מתבצעת ליפופרוטאינים, ו ליפופרוטאינים מועברים על ידי מחזור דם לרקמות. 13 שבוע לפני הצוהר יש צמיחה מהירה של עוברי עופות. כ -68% מתוכן השומנים שנותר חלמון נספגים בשלב זה. 10 המנגנון שבאמצעותו חלמון שומנים מנוצלים ניתן לברר באמצעות מודל מחקר EEC. פרוטוקול תרבות עוף EEC הוקם כדי להשיג את מטרה במחקר זה. 2, 9 עם זאת, עקב שיעור ההצלחה הנמוך של explants רקמות, הליך תרבית תאים משופר EEC נדרש כדי ללמוד את הפונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי עופות במהלך פיתוח.

<table><tbody><tr><td>Modified Eagle Medium Gibco של Dulbecco</td><td>by Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>לשטיפת כדורי ה-EECs</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>כמדיום הבסיסי בתרבות EECs</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>16010-159</td><td>כסרום האספקה בתרבית EECs</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. פתרון</td><td>BI (תעשיות ביולוגיות)</td><td>03-033-1B 100 מ"ל</td><td>להחלשת זיהום אפשרי&nbsp;</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג IV</td><td>ג'יבקו מבית Life technologies</td><td>17104-019 1 גרם</td><td>&nbsp; קולגנאז הוא פרוטאז בעל ספציפיות לקשר בין חומצת אמינו ניטרלית (X) לגליצין ברצף Pro-XGly-Pro. כפרוטאז לדיסוציאציה של תאים מרקמה ראשונית.</td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>FALCON&reg; </td><td>REF-353047</td><td>עבור EECs לחיבור והארכה</td></tr> של <tr><td>צינורות צנטריפוגה PP 50 מ"ל</td><td>Corning&reg; CentriStarTM</td><td>430829</td><td>להובלת ממברנות ועיכול אנזימים</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור תחתית חרוטי עם מכסה</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>להובלת ממברנות ועיכול אנזימים</td></tr><tr><td>אמבט טלטול הדדי</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>לעיכול אנזימטי טוב יותר על ממברנות</td></tr></tbody></table>

הראשי endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

הקמנו מודל תרבית תאים endodermal אפיתל (EEC) ללימוד פונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי העופות במהלך הפיתוח. ביצי שליו יפניות מופרות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים ולאחר מכן חלמון ממברנות צק (YSM) נאספו להקים מערכת התרבות EEC. בודדנו את שכבת endoderm העוברית YSM, וחתכתי את הממברנה לתוך 2 - 3 חתיכות מ&quot;מ ו מעוכל חלקית עם collagenase לפני זריעת צלחות תרבות 24 גם. EECS להתרבות מתוך הרקמה והם מוכנים ללימודי תרבית תאים. מצאנו כי EECS היו מאפיינים טיפוסיים של YSM in vivo, למשל, הצטברות של טיפות השומנים, ביטוי sterol O-acyltransferase וטריפז השומנים בדם. טיפול עיכול חלקי גדיל משמעותי את השיעור המוצלח של תרבות EEC. ניצול EECS, הראינו כי הביטוי של SOAT1 הוסדר על ידי ד cAMPחלבון ependent kinase מסלול רציף קשור. מערכת תרבות EEC שליו היפנית העיקרית זהו כלים שימושיים ללמוד תחבורת שומנים עוברית להבהיר את התפקיד של גני המעורבים בתיווך ניצול מזין YSM במהלך התפתחות עוברית עופות.

על מנת להשיג את המטרה של הקמת מודל תא עקבי ושימושי, אנחנו צריכים להרחיב ולייצב את קצב ההתפשטות וביצועים של EECS עופות. השווינו דגירה ישירה של endoderm ללא עיכול אנזים עם endoderm מעוכל חלקית עם אנזימים פרוטאוליטים, כגון collagenase או collagenase בתוספת 0.6 U של dispase. Dispase הוא-endopeptidase אמינו hydrolyzes אג&quot;ח פפטיד N- מסוף של שאריות חומצת אמינו לא-קוטביות. בעוד טיפולי עיכול פרוטאז גדלו התפשטות תאים בהשוואה להעדר עיכול (איור 1)...

כדי לחקור את מנגנון ניצול השומנים בקרומי שק החלמון בשלבים המאוחרים של התפתחות עוברי העופות, הקמנו מערכת תרבית תאי אפיתל אנדודרמלי עובריים ראשונית של שליו יפני.

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

המטרה הכללית של הליך הש transplantation של רקמה זו ex vivo היא לשפר את האיסוף ולהרחיב את היישום של תאי אפיתל אנדודרמליים של עוף, במטרה לחקור את תפקודם של אנזימים וחלבונים בתהליך התווך של ניצול רכיבי תזונה על ידי עוברים של עוף. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לניצול ליפידים במהלך העוברות של עוף, כגון האופן שבו ליפידים מהחלמון נארזים ומועברים מהחלמון לעובר בשלבים המאוחרים של ההתפתחות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להפיק בהצלחה תאי אפיתל אנדודרמליים תפקודיים מממברנת שק החלמון של ברקת יפנית, אשר יכולים לשמש כמודל למחקר של התפתחות עוברים של עוף.התחילו בהכנת תמיסת PBS 10x כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. דללו תמיסת מלאי זו ביחס של אחת לעשר כדי להכין PBS 1x, אשר תשמש לשטיפת ממברת שקי החלמון במהלך דיסקציה של האנדודרמה. להכנת מצע גידול עבור תאי אפיתל אנדודרמליים, או EECs, הוסיפו תחילה ל-DMEM/F-12 תוספת של 10% newborn calf serum ו-1% penicillin streptomycin amphotericin solution.לאחר מכן, הכניסו את הפרובה של מד pH לתוך DMEM שהוכן מראש. הוסיפו טיפות של HCl נורמלי שלושה למצע עד שה-pH יותאם ל-7.2. לאחר איסוף של כ-24 ביצי שלוהים הפוריות, הניחו אותן בצורה אנכית במיכלים לביצים, כך שחלקן הרחב שאינו מחודד, שבו נמצאים תאי האוויר, פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, העבירו את הביצים לדגרה מאווררת המכוונת ל-37 degrees Celsius. לאחר חמישה ימי דגירה, בחנו את הביצים באמצעות פנס לבדיקת ביצים (egg candler). אם העוברים התפתחו באופן תקין, ניתן יהיה לראות מבנה מעגלי של כלי דם נימיים מתחת לתא האוויר.בחרו ביצה המראה התפתחות קפילרית תקינה, ונקו את הקליפה בעזרת מים טריים ו-75% ethanol. לאחר מכן, פתחו את קליפת הביצה במיקום תא האוויר בעזרת מספריים. השתמשו בפינצטה כדי לסייע בעדינות לשפוך את תכולת הביצה אל תוך צלח תרבית ריק בקוטר 10 cm.לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי להפריד את העובר, החלמון וכל שארית אלבומין מממברנת שק החלמון, המכונה בקיצור YSM. לאחר הבידוד, שטפו את ה-YSM שלוש פעמים ב-1x PBS, ולאחר מכן העבירו אותה לצלחית חדשה של 10 cm המכילה PBS. לאחר מכן, הניחו את הצלחית תחת מיקרוסקופ דיסקציה.לאחר מכן, הסר בעזרת מספריים את שאריות החלבון של הביצה הגובלות בשכבת האקטודרמה החיצונית של ה-YSM. המשך בשימוש בפינצטה כדי להרים את האקטודרמה השקופה ואת המזודרם של מבנה הנימיים האדומים מקצה המזודרם על קרום שק החלמון. לאחר מכן, קלף בעדינות את האקטודרמה והמזודרם יחד כדי לבודד את שכבת תאי האנדודרמה שמתחתיהם.לאחר מכן, החזק בחוזקה בעזרת זוג פינצטות את שכבת התאי אנדודרמה הצהובה של הממברנה. בעזרת זוג פינצטות נוסף, אחז את המזודרמה של הנימיים, והמשך למשוך את המזודרמה הרחק מקו החיבור שבין המזודרמה לאנדודרמה. בעזרת מספריים, גזור את שכבת האנדודרמה הצהובה שנותרה, והעבר אותה לצלחית תרבית של שישה סנטימטרים המלאה במצע גידול.בעזרת טפטפת, העבירו את האנדודרמה הצהובה-בהירה מהצלחת התרבית בעלת קוטר שישה סנטימטרים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL לאחר איסוף ה-YSM, והוסיפו אליה 15 mL של מצע גידול שהוכן מראש. הניחו את המבחנה הקונית בבמבחלה של מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד להשלמת כל איסופי הרקמות. התחילו בהמסת 6.5 units של Type IV collagenase ב-10 mL של DMEM.בשלב הבא, סובבו במערך צנטריפוגה את המבחנות המכילות את האנדודרם במהירות של 130 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, שאבו את המצע, והשתמשו בפיפטה להעברת כל דגימות האנדודרם לכלי תרבית בקוטר ששה סנטימטרים. לאחר מכן, הוסיפו לכלי התרבית 1 mL של תמיסת קולגן.בעזרת מספריים קמורים, חתוך את האנדודרם שנאסף מארבעה עוברי שליו (quail) לפרוסות בגודל של כמעט שני עד שלושה מילימטרים. לאחר מכן, אסוף את הפרוסות לשפפור צנטריפוגה של 50 mL, המכיל תשעה מיליליטרים של תמיסת collagenase טרייה. כדי לשפר את השגשוג התאי בשלב האקספלאנט, הנח את השפפור במקבץ מים רוטט המוגדר ל-37 °C.לאחר מכן, דגרו את השפופרת הקונית למשך 30 דקות כדי לעקש חלקית את הרקמה באמצעות collagenase. העיכול הפרוטאוליטי החלקי הוא השלב החשוב ביותר לשיפור איכות התאים הנאספים מהאנדודרמה של קרום שק החלמון. הנתונים שלנו מראים שיפור משמעותי בשיעור ההצלחה של תרביות התאים והשכפול התאי הודות להליך העיכול באמצעות collagenase.לאחר העיכול באמצעות קולגנאז, סובבו את הרקמה בצנטריפוגה ב-130 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את תסמין הנוזל (supernatant) באמצעות פפיטה. המשיכו לשטוף את המשקע על ידי השעיה מחדש שלו ב-20 mL של DMEM. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה כפי שמתואר קודם לכן, ולאחר מכן הסירו את התסמין והשעו מחדש את המשקע ב-12 mL של מצע גידול.לאחר מכן, העבירו בעדינות 500 µL מהסוספנזיה לכל באער של פלטה בעלת 24 באערים. המשיכו לדגירה של נתחי האנדודרמה למשך יומיים ב-37 °C ב-5% CO2. במהלך זמן זה, צפויות התאים להתרבות מחוץ לרקמות.לאחר מכן, דגרו את התאים למשך יומיים נוספים. לאחר מכן, העבירו אותם בדיקת חיוניות תאים, והציגו את התוצאות באמצעות קורא לוחות (plate reader). לאחר מכן, בצעו RT-qPCR כדי להעריך את רמות הביטוי של סמנים רלוונטיים ב-EECs ובדקו את גודל המוצר מה-RT-qPCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.בהשוואה לרקמות מושתלות (explants) שלא טופלו, אלו שעברו עיכול חלקי באמצעות קולגנאז הפגינו עלייה משמעותית בשגשוג התאים, כפי שמוצג בגרפים אלו וכפי שנקבע באמצעות מבחן t מזווג, מה שמעיד על הצלחתו של מערכת התרבית. כדי להעריך את ההשפעות של אנזימים אחרים, בוצעו בדיקות חיוניות תאים לרקמות שטופלו בקולגנאז ודיספאז או בקולגנאז בלבד. במהלך חמשת ימי הדגירה הראשונים, צמיחת התאים הייתה דומה בשני התנאים.עם זאת, מהימים השישי ועד התשיעי, רק תאי EEC שעובדו עם קולגנאז proliferated באופן עקבי, מה שמעיד על כך שעיכול חלקי באמצעות אנזים זה משפר את הצמיחה ויש להעדיף את השימוש בו. כאשר נבחנו תאי EEC בתרבית, הם הראו מאפיינים דמויי אדיפוציטים של טיפות שומן עגולות וגדולות, כפי שמוצג כאן. תאים אלה היו חיוביים גם לצביעת Oil Red O, המשמשת בדרך כלל לזיהוי אדיפוציטים.בתימוך לנתונים מורפולוגיים אלו, בדיקת real-time quantitative PCR גילתה כי תאי EEC מתורגות מראים רמות גבוהות של SOAT1, חלבון המסנתז cholesterol ester מקולסטרול. דבר זה מחזק את הסברה כי תאי EEC מתורגות מציגים את המאפיינים הפיזיולוגיים הנכונים של אדיפוציטים. באופן משמעותי, כאשר תאי EEC נחשפו ל-IBMX ול-Forskolin, גורמים המעלים את רמות ה-cyclic adenosine monophosphate, או cAMP, ותורגדו למשך 24 שעות, שני הטיפולים ע กระตุ้น את ביטוי ה-SOAT1, מה שמרמז על מנגנונים אפשריים של ויסות SOAT1 וניצול ליפידים ב-YSM.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בכ-ארבע שעות, שבמהלליהן ניתן לאסוף לפחות שלוש דגימות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון SOAT1 או בדיקות אחרות של פעילות אנזימטית, כמו גם אישוש חזותי דומה. בדיקות אלו עשויות לסייע במתן תשובות לשאלות נוספות, כגון האופן שבו חלבונים ומאקרו-נוטריאנטים מסוימים מעורבים בשלבים המאוחרים של ההתפתחות העוברית.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ניצול רכיבי תזונה עובריים לבחון את המנגנון האפשרי שבאמצעותו רכיבי תזונה מנוצלים ומועברים במודל עוברי של עוף. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו ללמוד כיצד לאסוף רקמות אנדודרם מעוברי עוף, וכן תדעו כיצד לגדל EECs לצורך חקר הובלה וניצול של רכיבי תזונה עובריים באמצעות מודל העוף.

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

מאמר זה יספק שיטה בידוד שליו culturing או עוף...

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום השפיר האנושי כדי לקבוע את התכונות הטרוגניות והפונקציונליות שלהם עבור יישום אפשרי במודלים קליניים וphysiopathological.

בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפתח אורגנואידים אפיתל mucociliary מתאי ectoderm עמוקים מבודדים מעוברי Xenopus laevis. האבות הרב-פוטנטיים מחדשים את מבשרי תא גביע האפיתל ומאפשרים מעקב חי אחר החניכה וההתקדמות של מעברי התא על פני השטח של אורגנואידים.

אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה

הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר העופות היא כלי שימושי מאוד וישים לתחומי מחקר שונים. דגם אקס אובו מיוחד של שליו יפני CAM מתאים לחקירת טיפול פוטודינמי.

ממברנת שליו כוריואלנטואית - כלי לאבחון וטיפול פוטודינמי

פרוטוקול רב-תכליתי זה מתאר את הבידוד של תאי פסגה עצבית קדם-מיגרטיבית (NCCs) באמצעות כריתה של קפלים עצביים גולגולתיים מעוברי אפרוחים. עם הציפוי והדגירה, NCCs נודדים מגיחים מתוך קצוות עצביים, מה שמאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים ונדידה בסביבה דו-ממדית פשוטה.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

למד תרבית תאים אפיתליים אנדודרמיים מקרום הצק של שליו יפני לחקר מנגנוני ניצול ליפידים והעברת חומרי מזון לעובר. שיטה זו מספקת מודל אמין לחקר התפתחות עוברים עופיים.

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

גלה סרטונים נוספים