Name: ביעור Cell סלקטיבי מן תרבות 3D מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב Photoimmunotherapy (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: חקור שיטת ביעור תאים סלקטיבית מתרבות תלת-ממדית מעורבת באמצעות פוטואימונותרפיה אינפרא-אדומה קרובה. טכניקה זו ממזערת נזק לתאים שכנים ומסייעת בפיתוח רפואה רגנרטיבית מתקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב, המכון הלאומי לסרטן, המרכז לחקר הסרטן.

ההערה: הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים כדי לחסל תאים ספציפיים באמצעות NIR-PIT. בקרות ופרטים נוספים על כדאיות NIR-PIT ותא ניתן למצוא במקום אחר 18. 1. הצמיד של IR700 לנוגדנים חד-שבטיים (מב) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מב עניין ב 2-5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.6) פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 6.8 nmol של מב עם 30.8 nmol של 10 מ&quot;מ IR700 ב 0.1 M Na 2 HPO 4 פתרון (pH 8.6) בצינור microcentrifuge ו דגירה ב RT עבור שעה 1, מכוסה בנייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה PD-10 (ראו טבלה של ציוד חומרים /) עם 15 מ&quot;ל PBS, פעמיים. טען המדגם משלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התערובת דרך עמודת PD-10 על ידי elution PBS על פי הוראות היצרן. הערה: כאן, elution היה לאורך צבע הלהקה של IR700. עבור מדגם 300 μl, חלק elution PBS הוא בדרך כלל בין 2.5 מ&quot;ל ל -4.4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אתריכוז חלבון עם מכתים Coomassie על ידי מדידת הספיגה ב 595 ננומטר עם ספקטרופוטומטר 9. קבע את הריכוז של IR700 עם הקליטה 689 ננומטר כדי לאשר את המספר של מולקולות fluorophore מצומדות לכל מולקולה מב 9. הערה: חשוב לקבוע מספר נטיה אופטימלי של מולקולות IR700 ב 1 מב עם ספקטרופוטומטר. באופן כללי, כ -3 מולקולות IR700 במולקולת 1 מב הן אופטימליות עבור הן במבחנה בעבודת vivo. HPLC ושיטות SDS-PAGE ניתן להשתמש כדי לאשר את מב ו IR700 מאוגדים ובין אם לאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס לאחר קביעת ריכוז החלבון. </li></ol> 2. הכנת תרבית תאים 3D מעורב (Mixed אליפטית) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מים סטריליים (סביב 1 מיליליטר) לתוך קטע מאגר הצלחת לתלות צלחות טיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יחסים שונים של סוגי תאים של עניין - תאים A431-לוק-GFP ותאי 3T3-RFP -עם כל דגימה המכילה 5,000 תאים בסך הכל, המרחפים 50 μl של התקשורת והתרבות. הערה: כן 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, וכו &#39;יחסים של סוגי תאים של עניין תקשורת והתרבות תלוי תאים מהסוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התמהיל 5-7 ימים בצלחת הירידה 96 גם תלוי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, פחמן דו חמצני 5%. שנה את התקשורת והתרבות כל 2 ימים. הערה: כדי להפוך את 3D אליפטית בדיוק, להתמודד עם הצלחת בעדינות, כמו טיפות המכילות תאים ליפול בקלות לפני להרכיב צורות 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המורפולוגיה והגודל של spheroids באמצעות מיקרוסקופ brightfield הפוכה ב 10X - הגדלה 40X. הערה: למרות שזה תלוי סוגי תאים וגודל-Drop Hanging, להבטיח כי הקוטר של אליפטית הוא סביב 400-600 מיקרומטר לאחר 7 ימי דגירה של 96 גם תלוי צלחת טיפה. </li></ol> 3. במבחנה NIR-בור תרבית תאי 3D מעורבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת של חהnging צלחות ושחרר כדי המצומד 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​נוגדנים photoabsorber (APC) מדיה המכילה, דגירה במשך 6 שעות בתוך חממה humidified ב 37 ° C ופחמן דו חמצני 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 דגירת hr, לשטוף את אליפטית פעמים עם תקשורת והתרבות הטריה (פנול האדום חינם). בעדינות להעביר את אליפטית לצלחת עם רצפת זכוכית 50 מ&quot;מ עם 100 μl פנול טריים התקשורת והתרבות אדום ללא באמצעות קצה פיפטה סטרילית 200 μl עם קצה לחתוך. מניחים אליפטית אחת בכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב אליפטית עם מיקרוסקופ brightfield הפוך להבחין בשינוי של מורפולוגיה. כדי לבחון את הכתבים האופטיים (למשל, ה- GFP ו RFP) להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם גדרות המסנן הבאות: GFP - 469 מסנן עירור ננומטר, ואת מסנן פליטה 525 ננומטר; RFP - 559 מסנן עירור ננומטר, ו 630 מסנן פליטה ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את אור דיודה (LED) מעל צלחת תחתית זכוכית עבור הקרנה. הערה: ניתן להיחשף Spheroids לנירלהדליק או על מיקרוסקופ או בשכונה למינרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את צפיפות ההספק של אור NIR עם מד כוח אופטי 9. על פי מדידה זו, מקרינים אור NIR באמצעות דיודות פולטות אור (LEDs) אשר פולטים אור באורכי גל של 670 עד 710 ננומטר 2 J / cm 2. הערה: הנורית יכול לחדור לעומק מרבי של כ 5 ס&quot;מ. השפעות ציטוטוקסיות של NIR-PIT תלויה רק אנרגיה נתון ללא קשר צפיפות הספק ומשך החשיפה 23. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההקרנה, להעביר את אליפטית לתוך צלחת Drop Hanging חדש עם 50 μl של התקשורת בתרבות טרי דגירה במשך יום 1 ב חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, פחמן דו חמצני 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את אליפטית לצלחת עם תחתית זכוכית עם 100 μl של התקשורת בתרבות טרי (פנול אדום חינם) באמצעות קצה פיפטה סטרילית 200 μl עם קצה לחתוך. שימו לב אליפטית עם יום פלואורסצנטי מיקרוסקופ 1 לאחר Fi באמצעות NIR-PITהגדרות LTER כמתוארות בשלב 3.3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי תאים מתים על ידי הוספת יודיד propidium לתקשורת בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל, או על ידי אובדן של GFP הקרינה cytoplasmic באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 ב) 14,18,22. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.1-3.6 אם תאי יעד הם לא בוטלו לחלוטין. </li></ol>

<ol><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Birchall, M. A., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%27s+green+shoots+of+disruptive+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation.</a> Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).</li>
<li>Ben-David, U., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumorigenicity+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).</li>
<li>Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+and+cellular+reprogramming%3A+facts%2C+hypotheses%2C+unresolved+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues.</a> Cell. 143 (4), 508-525 (2010).</li>
<li>Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotent+stem+cell-derived+teratoma+formation+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).</li>
<li>Miura, K., Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+safety+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).</li>
<li>Tang, C., Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+-+selective+in+vivo+near+infrared+photoimmunotherapy+targeting+specific+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules.</a> Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+in+vivo+target-specific+cancer+cell+death+after+near+infrared+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy.</a> BMC Cancer. 12 (1), 345(2012).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+in+vivo+acute+necrotic+cancer+cell+death+induced+by+near+infrared+photoimmunotherapy+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging.</a> Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).</li>
<li>Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+photoimmunotherapy+assessed+by+18F-FDG+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET.</a> J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).</li>
<li>Sato, K., Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy%3A+Comparative+effectiveness+of+two+monoclonal+antibodies+targeting+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor.</a> Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+for+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases.</a> Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).</li>
<li>Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Disseminated+Peritoneal+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer.</a> Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).</li>
<li>Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+of+Gastric+Cancer+Peritoneal+Carcinomatosis+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model.</a> PloS one. 9 (11), 113276(2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Pleural+Disseminated+NSCLC+Preclinical+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience.</a> Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).</li>
<li>Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+elimination+in+vitro+and+in+vivo+from+tissues+and+tumors+using+antibodies+conjugated+with+a+near+infrared+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine.</a> RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).</li>
<li>Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+Targeting+Prostate-Specific+Membrane+Antigen%3A+Are+Antibody+Fragments+as+Effective+as+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies.</a> J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+efficacy+of+Photoimmunotherapy+%28PIT%29+using+a+cocktail+of+antibody+conjugates+in+a+multiple+antigen+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model.</a> Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).</li>
<li>Shirasu, N., Yamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+antitumor+effect+of+CEA-targeted+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+prevents+lung+cancer+metastases+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model.</a> Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).</li>
<li>Nakajima, T., Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC cancer. 14 (1), 389(2014).</li>
<li>Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derive+and+conquer%3A+sourcing+and+differentiating+stem+cells+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).</li>
<li>Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cell+and+cytokine+targets+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).</li>
<li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

אנו מדגימים שיטת חיסול תאים ספציפיים מתוך תרבית תאים 3D מעורבת ללא נזק לתאים היעד הלא באמצעות NIR-PIT. עד כה, לא קיימת שיטה מעשית של חיסול תאים פעם הרקמה מוקמת או לאחר השתלה. לכן, ניר-PIT הוא שיטה מבטיחה לעשות זאת. טכניקה זו יכולה גם להיות מנוצלת in vivo 18,22, מאז נגמ&quot;שים להראות הפרמקוקינטיקה דומה כמו מב עצם. סוג תא היעד יכול להיות מותאם עם שוני APC. נוגדנים שונים או שברי נוגדנים, כולל אנטי EGFR, אנטי PSMA, אנטי מזותלין, ואנטי-CEA כבר שימשו נגמ&q...

ביטול תאים ספציפיים מבלי לפגוע בתאים אחרים קשה מאוד, במיוחד ברקמה הוקמה, ויש צורך דחוף שיטת חיסול תא בתחום הנדסת רקמות. כיום בתחום של רפואה רגנרטיבית, תרביות רקמה באמצעות תאי גזע עובריים (ES), תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs), או תאי גזע מושרים (iPS) הם חומרים מבטיח 1 - 3. למרות התחדשות רקמות זו נראית מבטיחה, זיהום עם תאים לא רצויים הוא דאגה עיקרית. יתר על כן, קיים חשש לשלומם של tumorigenicity לאחר ההשתלה 4,5. למרות מחקרים רבים התמקדו בנושאים אלה לחסל תאים ספציפיים, במיוחד ברפואה רגנרטיבית 6 - 8, אין שיטה מעשית פותחה. photoimmunotherapy אינפרא אדום קרוב (NIR-PIT) הוא טיפול המבוסס על conjugat נוגדן-photoabsorberדואר (APC). נגמ&quot;ש מורכב של נוגדנים חד שבטיים תא ספציפי (מב) וכן photoabsorber, IR700. IR700 היא נגזרת סיליקה-phthalocyanine הידרופילי לא לגרום phototoxicity בעצמה 9. IR700 הוא מצומדות קוולנטית הנוגדן באמצעות שאריות אמידות על שרשרת הצד של מולקולות ליזין. הנגמ&quot;ש נקשר מולקולות מטרה על קרום התא ולאחר מכן גורם כמעט תא נימק מיידי לאחר חשיפה לאור NIR ב 690 ננומטר. במהלך החשיפה NIR-אור, נקרע קרום הסלולר המובילה לתא פטירה 9 - 14. NIR-PIT הוכיח כיעיל עם נוגדנים מרובים או שברי נוגדנים, כולל אנטי EGFR, אנטי HER2, אנטי PSMA, אנטי CD25, אנטי מזותלין, אנטי GPC3, ואנטי-CEA 15 - 21. לכן, ניר-PIT יכול לשמש נגד מגוון רחב של מולקולות מטרה. יתר על כן, ניר-PIT הוא טיפול מבוקר היטב המאפשר טיפול סלקטיבית של אזורים ספציפיים על ידי הגבלת-תאורת NIRt הקרנה 18,22. כאן, אנו מציגים שיטה של ​​חיסול תאים ספציפיים באמצעות NIR-PIT מתרבויות 3D מעורבת.

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX Ester צבע אינפרא אדום</td><td>LI-COR Bioscience (לינקולן, NE, ארה"ב)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 column (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (פיסקאטאווי, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (ברדפורד) Plus בדיקת חלבון</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96-Well תלויים צלחות טיפה</td><td>3D Biomatrix Inc (אן ארבור, מישיגן, ארה"ב)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>מד כוח אופטי</td><td>Thorlabs (ניוטון, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED: L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>Vectibix (panitumumab)</td><td>Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&nbsp; צלחת תחתית זכוכית מ"מ, גודל צלחת 35&nbsp; מ"מ, גודל באר 10&nbsp; מ"מ</td><td>סלביס (מאונטיין ויו, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

ביעור cell סלקטיבי מן תרבות 3d מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב photoimmunotherapy

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

ההתפתחויות האחרונות בהנדסת רקמות מציעות פתרונות חדשניים למחלות רבות. לדוגמה, הנדסת רקמות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) התגלתה כשיטה חדשה ברפואה רגנרטיבית. למרות שהתחדשות רקמות זו מבטיחה, זיהום בתאים לא רצויים במהלך תרביות רקמה הוא דאגה גדולה. יתר על כן, קיים חשש בטיחותי לגבי גידול לאחר ההשתלה. לכן, יש צורך דחוף בסילוק תאים ספציפיים מבלי לפגוע בתאים אחרים שצריך להגן עליהם, במיוחד ברקמות מבוססות. כאן, אנו מציגים שיטה לחיסול תאים ספציפיים מתרבית תאים תלת מימדית מעורבת במבחנה עם פוטו-אימונותרפיה אינפרא אדום קרוב (NIR-PIT) מבלי לפגוע בתאים לא ממוקדים. טכניקה זו מאפשרת חיסול תאים ספציפיים מתרביות תאים או רקמות מעורבות.

כדי אופטית לפקח על השפעת NIR-PIT, שורת תאים A431, אשר overexpresses EGFR, שונה גנטית גם להביע GFP ו בלוציפראז (A431-לוק-GFP). כתוצאה היעד אי NIR-PIT, הקו הסלולרי Balb / 3T3 שונה אופטית להביע RFP (3T3-RFP). הנגמ&quot;ש, וקטיביקס-IR700 (פאן-IR700), היה מסונתז. Spheroids מעורבת, אשר הורכבו יחסים שונים של תאים (A431-לוק-GFP ו 3T3-RFP) היו מפוברקות על פי פרוטוקול זה (איור 1). חוזרות NIR-PIT בוצעה עם הדגירה של הפאן-IR700 (ראה משטר ב <str...

חיסול תאים ספציפיים מבלי לפגוע בתאים אחרים הוא קשה ביותר, במיוחד ברקמות מבוססות, אך יש צורך דחוף בשיטת אלימינציה של תאים בתחום הנדסת הרקמות. כאן, אנו מציגים שיטה לחיסול תאים ספציפיים מתרבית תאים תלת מימדית מעורבת באמצעות פוטו-אימונותרפיה אינפרא אדום (NIR-PIT).

ביעור Cell סלקטיבי מן תרבות 3D מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא להדגים את סילוקן של תאים ספציפיים רצויים מתרבית תאים תלת-ממדית מעורבת באמצעות פוטואימונותרפיה באינפרא-אדום קרוב. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות בנוגע לרפואה רגנרטיבית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה נגד מגוון של מולקולות מטרה, וכי ניתן להגביל את הטיפול לנגעים ספציפיים רצויים.בדרך זו ניתן למזער את תופעות הלוואי. לצורך צימוד של IR700 לנוגדנים מונוקלונליים, דגרו את הנוגדנים הרצויים עם IR700 ב-Disodium Phosphate בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, כשהמבחנה מכוסה בנייר אלומיניום. בסיום הדגירה, שטפו עמודת PD10 פעמיים עם 15 milliliters של PBS.לאחר מכן, טען את תמיסת הנוגדנים לעמודה וטהר את התערובת באמצעות אלוציה ב-PBS בהתאם להוראות היצרן. כדי לאשר את מספר מולקולות ה-fluoro-4 המצומדות לכל מולקולה של נוגדן מונוקלונלי, השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז החלבון של הנוגדן המונוקלונלי. לאחר מכן, אחסן את התצמידה בטמפרטורה של 4-degree Celsius.כדי להכין את תרבית התאים התלת-ממדית המעורבת, הוסיפו 1 מיליליטר של מים סטריליים למקטע מאגר הלוחיות של פלטת טיפות תלויות בעלת 96 בארות. לאחר מכן, זרעו יחסים שונים של סוגי התאים הרלוונטיים במצע תרבית תאים מתאים בריכוז של לפחות 5,000 תאים ל-50 מיקרוליטר של מצע לכל בארה, למשך חמישה עד שבעה ימים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37-degree Celsius ו-5% carbon dioxide. החליפו את מצע התרבית מדי יומיים ובחנו מדי יום את המורפולוגיה והגודל של הספרואידים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך בהגדלה של 10 עד 40 פעמים.כאשר הספרואידים יגיעו לקוטר של 400 עד 600 מיקרון, החליפו את מצע הטיפה התלויה במצע המכיל קונג'וגט של נוגדן ובולע פוטונים (photoabsorber), והחזירו את הפלטה לאינקובטור למשך שש שעות. בסיום הדגירה, שטפו את הספרואידים פעמיים במצע תרבית רענן ללא פנול אדום (phenol red free). לאחר מכן, השתמשו בקצה של פיפטה של 200 מיקרוליטר עם קצה חתוך כדי להעביר ספרואיד אחד בכל פעם לכלי זכוכית עם תחתית זכוכית בקוטר 50 מילימטר, המכילים 100 מיקרוליטר של מצע תרבית רענן ללא פנול אדום לכל כלי.השתמשו במיקרוסקופ הפוך כדי להבחין בשינויים במורפולוגיה של הספרואידים. כדי להקרין את הספרואידים, מקמו דיודה פולטת אור בגובה של עד 5 אינץ' מעל הכליים בעלי התחתית הזכוכית. והשתמשו במד הספק אופטי כדי לאשר פליטה של אורך גל של 670 עד 710 ננומטר בעוצמה של 2 joules per centimeter squared.לאחר הפוטואימונותרפיה באינפרא-אדום קרוב (NIR), העבירו את הספרואידים לפלטת טיפות תלויות (hanging drop plate) חדשה עם 50 µL של מצע גידול טרי לכל באר למשך יום אחד באינקובטור לתרביות תאים. לאחר מכן, באמצעות טיפ אחר של פפט 200 µL עם קצה חתוך, העבירו בעדינות את הספרואידים למנות עם תחתית זכוכית חדשות המכילות 100 µL של מצע גידול ללא פנול אדום, והעריכו את ביטוי הדיווח האופטי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, זהו את התאים המתים על ידי הוספת propidium iodide למצע.או על ידי אובדן של פלואורסצנציית GFP ציטופלזמית. בניסוי מייצג זה, הוכנו ספרואידים מעורבים המורכבים מיחסים שונים של תאי A431-luc-GFP ותאי 3T3-RFP כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן בוצע טיפול פוטואימונותרפיוטי חוזר ב-NIR עם אינקובציה של panitumumab-IR700 כפי שמוצג.ואת סילוק תאי המטרה ניתרו באמצעות הערכת פעילויות הפלואורסצנציה והלוסיפרז בתוך תרביות טיפה תלויה. לאחר שליטה בשיטה, ניתן להשלימה בשעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי אנרגיית האור פוחתת בהתאם לחוק הריבוע ההפוך.

selective-cell-elimination-from-mixed-3d-culture-using-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה מולטיספקטרלית פלואורסצנטית באתרה לניתוח תת-אוכלוסיות שונות של תאי T חודרים ברקמת הגידול. קריוסקציה של רקמת קרצינומה של תאי הכליה מטופלת בנוגדנים כדי לתייג תאי T CD8+ המבטאים קולטנים מעכבים ספציפיים ומציגים פנוטיפ עמיד לאימונותרפיה. החלק המסומן מוצג באמצעות מיקרוסקופ מולטיספקטרלי כדי לזהות את תת-האוכלוסיות השונות של תאי CD8+ T.

הדמיה אימונופלואורסצנטית מרובת משתתפים לניתוח תת-אוכלוסיות תאי T עמידים לאימונותרפיה

סרטון זה מדגים טכניקת פוטואימונותרפיה כמעט אינפרא אדומה לטיפול בסרטן ריאות במודל עכבר מהונדס המציג תאי גידול המבטאים לוציפראז. עם הזרקת נוגדן-פוטונסיטייזר מצומד (APC) הנקשר לאנטיגנים ספציפיים על תאי הגידול, העכבר נחשף לקרינה תת-אדומה קרובה, הגורמת לשינויים פוטוכימיים ב-APC ומובילה למוות נמק של תאי הגידול הקשורים. יעילות הטיפול מנוטרת על ידי הזרקת לוציפרין, מצע לוציפראז, ומדידת הביולומינסנציה לאורך זמן, בקורלציה עם צמיחת הגידול.

טכניקת פוטואימונותרפיה כמעט אינפרא אדום לטיפול בסרטן ריאות במודל מורין

סרטון זה מדגים טכניקה להסרה סלקטיבית של תאים ספציפיים מתרבית תאים תלת-ממדית מעורבת באמצעות פוטואימונותרפיה תת-אדומה קרובה. בשיטה זו, תאים ממוקדים מזוהים במדויק באמצעות נוגדן מצומד עם קולט אור NIR. הקרנה לאחר מכן עם אור אינפרא אדום גורמת למוות תאים, ולמעשה מבטלת את תאי המטרה מהתרבות התלת-ממדית.

פוטואימונותרפיה כמעט אינפרא אדומה לסילוק תאים ממוקד בתרביות תלת-ממד מעורבות

פרוטוקול זה מתאר פונקציונליזציה של פני השטח הניתנת להתאמה אישית של מערכת הדסטיוביוטין, הסטרפטווידין וה-APTES על מנת לבודד סוגי תאים ספציפיים מעניינים. בנוסף, כתב יד זה מכסה את היישומים, האופטימיזציה והאימות של תהליך זה.

שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

טיפול פוטודינמי (PDT) היא הליך רפואי הכרוך דגירה של אפלייד exogenously פוטוסנסיטייזר (PS) ואחריו photoactivation אור גלוי כדי לגרום אפופטוזיס. אנו מציגים במבחנה PDT פרוטוקול שנועדו לדמות PDT בהם ניתן ללמוד הבדלים PS הדגירה ופרמטרים טיפול קל.

גישה במבחנה טיפול פוטודינמי

פוטוימונותרפיה כמעט אינפרא אדום (NIR-PIT) היא אסטרטגיה טיפולית מתפתחת לסרטן המשתמשת בנוגדן-פוטואבסורבר (IR700Dye) מצומד ואור NIR כדי להרוס תאים סרטניים. כאן, אנו מציגים שיטה להערכת ההשפעה האנטי-אטומית של NIR-PIT במודל עכבר של סרטן ריאות מופץ pleural ומזותליומה פלורלית ממאירה באמצעות הדמיית ביולומינציה.

ליד פוטוימונותרפיה אינפרא אדום עבור מודלים עכבר של הפצת Pleural

הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר העופות היא כלי שימושי מאוד וישים לתחומי מחקר שונים. דגם אקס אובו מיוחד של שליו יפני CAM מתאים לחקירת טיפול פוטודינמי.

ממברנת שליו כוריואלנטואית - כלי לאבחון וטיפול פוטודינמי

כאן אנו מתארים מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מוצלח של מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT) תוך שימוש בתרבית תאי HeLa דו-ממדית וורטפורפין כפוטוסנסיטייזר.

מכשיר טיפול פוטודינמי מבוסס דיודה פולטת אור הבנוי בתוך הבית להגברת ציטוטוקסיות של חוליות במודל תרבית תאים דו-ממדית

פרוטוקול זה מציג סדרה של ניסויים שאומצו להערכת פפטידים אנטי-סרטניים הניתנים להחלפה, שניתן להשתמש בהם בסינון פרה-קליני של תרכובות כאלה. זה כולל הערכת ציטוטוקסיות בתרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות, הערכת יעילות פוטואיזומריזציה של רקמת מודל (ex vivo) ויעילות in vivo .

הערכה חוץ גופית ו-in vivo של תרכובות פעילות ביולוגיות מבוקרות - תרופות מועמדות פוטנציאליות לפוטופרמקולוגיה של סרטן

היישום של טכניקת הקרנה פוטו-ארבלית בעלות נמוכה בשיטת IBEX הידנית מאפשר הדמיה אופטימלית של רקמות אנושיות עם אוטופלואורסצנציה טבעית משמעותית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשיג תמונות מרובות ושקופיות שלמות מדגימות קליניות בארכיון באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ריאגנטים זמינים באופן נרחב ותוכנת קוד פתוח ליישור ועיבוד תמונה.

זרימת עבודה אופטימלית להלבנה איטרטיבית מרחיבה את ההדמיה המרובה של דגימות קליניות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מאוזן במבחנה למדידה עקבית של ציטוטוקסיות טבעית, מתווכת קולטני אנטיגן כימריים ותלויה בנוגדנים של תאי רוצח טבעיים אנושיים, באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה.

כימות ציטוטוקסיות של תאי NK המועצמת על ידי קולטני אנטיגן כימריים ונוגדנים טיפוליים באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה

חקור שיטת ביעור תאים סלקטיבית מתרבות תלת-ממדית מעורבת באמצעות פוטואימונותרפיה אינפרא-אדומה קרובה. טכניקה זו ממזערת נזק לתאים שכנים ומסייעת בפיתוח רפואה רגנרטיבית מתקדמת.

ביעור Cell סלקטיבי מן תרבות 3D מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב Photoimmunotherapy

גלה סרטונים נוספים