בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד לויקוציטים חודרים לעור באמצעות עיכול אנזימטי והפרדת שיפוע צפיפות. ניתן ליישם שיטה זו לחקירת מנגנונים תאיים ומולקולריים במודלים עכבריים רבים של פתולוגיות עור, כולל אטופיק דרמטיטיס. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ביולוגיה של לויקוציטים חודרים לעור, ניתן ליישם אותה גם לחקר אוכלוסיות תאים מקומיות אחרות.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם קצירת העור, הכוללת הסרה מוחלטת של עודפי השומן ורקמות החיבור. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקצירת עור וטיפול בשיפוע צפיפות קשים ללמידה, ודורשים דיוק ותרגול. בנקודת הזמן המתאימה לאחר הטיפול, השתמש במספריים כירורגיים של 10 ס"מ כדי לכרות בזהירות שטח של 25 על 25 מילימטר של עור צד מגולח מעכבר ND4 Swiss-Webster בוגר בן שמונה עד שנים עשר שבועות.

השתמש בלהב כירורגי נקי וחד כדי לגרד את עודפי השומן ורקמת החיבור מהעור, ולאחר מכן העביר את העור לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של HBSS בטמפרטורת החדר בתוספת EDTA, HEPES ו-FBS, ולעכל מראש את הרקמה על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות ביבש ללא גזים, אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, מערבל את הצינור במרץ במשך עשר שניות וסנן את תמיסת הרקמה דרך מסננת של 70 מיקרון. לאחר מכן, השתמש בזוג מלקחיים כדי להעביר את חלקי עור האגף מהמסננת לצינור חדש של 50 מיליליטר המכיל עשרה מיליליטר של מדיה HBSS טרייה בטמפרטורת החדר, בתוספת EDTA, HEPES ו-FBS, ולאחר מכן השתמש בזוג מספריים לניתוח כירורגי של 12.5 סנטימטר כדי לטחון כל פיסת עור באגף כך שפיסת הרקמה הממוצעת תהיה בגודל של כ-2.2 על 2.2 מילימטרים.

לאחר שכל החלקים נטחנו, החזירו את הצינור לצלחת המסתובבת למשך 30 דקות דגירה נוספת. מערבל את הצינור במרץ במשך 10 שניות בתום הדגירה ומסנן את התוכן דרך מסננת 70 מיקרון. אסוף את חתיכות העור הנותרות בצינור חדש של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר HBSS בתוספת 0.7 מיליגרם למיליליטר קולגנאז D, והחזיר את הצינור לצלחת המסתובבת למשך 30 דקות נוספות.

לאחר 10 שניות נוספות של מערבולת, סנן שוב את תוכן הצינור, הפעם השליך את הפסולת על המסננת, ואז מלא את הצינור בעד 50 מיליליטר של HBSS, EDTA, HEPES, FBS, סובב את התאים ושפך את הסופרנטנט. הוסף שלושה מיליליטר של טמפרטורת החדר, מדיום צנטריפוגה שיפוע בצפיפות של 67 אחוז ב-PBS לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר, והשהה מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של מדיום צנטריפוגה שיפוע צפיפות של 44 אחוז בטמפרטורת החדר ב-HBSS עם פנול אדום. כוונו את הפיפטור למהירות הנמוכה ביותר, הניחו את הפיפטה בצד הצינור והניחו בעדינות את התאים על גבי מדיום הצנטריפוגה השיפוע בצפיפות של 67 אחוזים.

בעת עבודה עם שיפועי צפיפות, הקפד להימנע מיצירת בועות ולמזער הפרעות בממשק השיפוע. לאחר מכן הפרד את התאים, באמצעות פיפטת העברה של חמישה מיליליטר כדי לאסוף את התאים בממשק בסוף הצנטריפוגה. מכיוון ששכבות עדינות של השיפוע וחילוץ בזהירות של ממשק השיפועים הם שלבים קריטיים, כדאי לתרגל את שכבות המדיום של צנטריפוגת שיפוע הצפיפות והסרת הממשק עם ההשעיה של טחול עכברים לפני שתנסה את ההליך עם תאי הניסוי המעניינים.

לבסוף, שטפו את התאים שנאספו ב-PBS קר כקרח בתוספת FBS בצינור חרוטי של 15 מיליליטר וספרו את מספר התאים הקיימים על ידי אי הכללת טריפאן כחול. ביטוי פני השטח CD4 ו-CD8-alpha אינו מושפע מעיכול קולגנאז D, מכיוון שאותו מספר של תאים חיוביים CD4 ו-CD8-אלפא מזוהה עם או בלי עיכול אנזימטי. יתר על כן, לעיכול קולגנאז D אין השפעה על צפיפות פני השטח של סמני הפעלת תאי T CD44 ו-CD62L על תאי T חיוביים CD4.

לאחר הפרדת שיפוע, כ-250 תאים חיסוניים ברי קיימא לכל מילימטר רבוע של רקמת צד מבודדים מאוקסזולון, או עכברים מאותגרים ב-Ox, לעומת רק ארבעה תאים חיסוניים ברי קיימא למילימטר רבוע של רקמה בעכברים מאותגרים ברכב, שהיו רגישים בעבר עם Ox.95 אחוז מהתאים הבודדים המפוזרים קדימה והצד בעכברים מאותגרים Ox, ו-71 אחוז מהתאים הללו בבקרות מאותגרות רכב הם תאים חיוביים ל-CD45 חיים. שווה ערך לעלייה של פי 67 בערך באוכלוסיית תאי החיסון החיוביים CD45 החודרים בעור האגף לאחר שלושה אתגרי Ox יומיים. ואכן, אתגר Ox מביא לחדירה בולטת של תאי T ונויטרופילים לתוך עור האגף, כאשר 42 אחוז מהתאים החיוביים ל-CD45 החיים הבודדים בבעלי חיים שטופלו ב-Ox, נויטרופילים חיוביים לכאורה ל-Gr-1, וכ-84 אחוז תאי T חיוביים ל-CD3 המבטאים CD8-alpha, או CD4, בהשוואה לבעלי חיים שטופלו באתנול. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בזהירות בשיפוע הצפיפות. אל תשכח להשתמש תמיד במדיום צנטריפוגה שיפוע צפיפות בטמפרטורת החדר בעת ביצוע הליך זה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח זרימה ציטומטרי, מיון תאים, העברת תאים או תרבית תאים במבחנה כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של הלויקוציטים החודרים לעור.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד לויקוציטים חודרים לעור באמצעות עיכול אנזימטי וצנטריפוגה של שיפוע צפיפות.