עור 2D and 3D שיפור במבחנה מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשפר את שקיעת המטריצה החוץ-תאית ולשפר את דגמי העור הדו-ממדיים והתלת-ממדיים הנוכחיים באמצעות צפיפות מקרומולקולרית. צפיפות משפרת את הייצור של מטריצות שמקורן בתאים, ותרביות אורגנוטיפיות בוגרות במסגרת זמן מרוכזת. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת רקמות מכיוון שהיא מציעה דרכים משופרות ליצירת מטריצות חוץ-תאיות שמקורן בתאים להנדסה ביולוגית של עור ורקמות אחרות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליצור מטריצות שמקורן בתאים ומבני עור אורגנוטיפיים במסגרת זמן מרוכזת משמעותית בעת החלת צפיפות מקרומולקולרית על תרבויות אלה. הטכניקה של מיקרוסקופ השתקפות הפרעות מאפשרת לך לדמיין את תצהיר המטריצה החוץ-תאית הכולל ללא צורך בצביעת נוגדנים. היישומים של טכניקות אלה יתרחבו ממחקרים של שקיעת מטריצה חוץ-תאית על ידי תאי עור ועד לטיפולים משופרים בפצעים, במיוחד עם יצירת מקבילות עור טובות יותר ותרבית רקמות להשתלה.

כדי להתחיל, זרעו 50,000 פיברובלסטים ראשוניים, קרטינוציטים ראשוניים, או תרבית משותפת של שניהם, במיליליטר אחד של באר בינונית, לבארות של צלחת של 24 בארות. אפשר לתאים להיצמד לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה. לאחר מכן, השליכו את המדיום הישן והחליפו אותו במיליליטר אחד של מדיום טרי המכיל צפיפות מקרומולקולרית וחומצה אסקורבית של 100 מיקרו-מולאר.

דגרו על התרבויות במשך שישה ימים, והחליפו את המדיום כל יומיים. בצע אימונופלואורסצנציה וכתמים מערביים על פי פרוטוקול הטקסט. כדי ליצור ולהשתמש במטריצה שמקורה בתאים, לאחר תרבית התאים במשך שישה ימים עם צפיפות מולקולרית וחומצה אסקורבית כפי שהודגם זה עתה, בצע דה-סלולריזציה של שכבות התאים כדי לקבל מטריצה שמקורה בתא על ידי שימוש תחילה ב-1X PBS כדי לשטוף את שכבות התא פעמיים.

שאפו את ה-PBS, ולאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטר של 0.5% נתרן דאוקסיכולאט ודגרו על קרח למשך 10 דקות. שאפו את ליזאט התא, ואז הוסיפו עוד 250 מיקרוליטר של 0.5% נתרן דאוקסיכולאט וחזרו על הדגירה והשאיפה של 10 דקות פעמיים נוספות. השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף את המטריצה שמקורה בתא פעמיים.

שואבים את המים ואז מוסיפים 1X PBS. אחסן את המטריצה בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. כדי להכין תרחיף תאים משני, שאפו את ה-PBS מהמטריצה, וזרעו 50,000 קרטינוציטים על גבי מחצלת F למשל.

אפשר לתאים להיצמד למשך הלילה. כדי לבצע מיקרוסקופ השתקפות הפרעות, או RIM, על מטריצה שמקורה בתא, בצע רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונ-פוקלי על פי פרוטוקול הטקסט. כדי להטיל ג'ל קולגן עם פיברובלסטים עטופים בתוספת תרבית תאים, יש להוציא 10 מיליליטר של קולגן זנב חולדה מסוג 1 לכוס קרה.

הוסף מיליליטר אחד של DMEM קר ו-0.5 מיליליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד כדי לנטרל את הקולגן החומצי. לאחר מכן הוסף 0.5 מיליליטר של תרחיף פיברובלסטים. בעזרת פיפטה קרה, חלקו באופן שווה את 12 מיליליטר התמיסה לתוספות תרבית תאים בצלחת תרבית בת שש בארות.

דגרו את הג'ל בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר שהג'ל התמצק, טבלו אותו במדיום פיברובלסטים או FM. ואז לאחר הדגירה במשך 24 שעות, שאפו את ה- FM. השתמש בארבעה מיליליטר של מדיום טרי המכיל צפיפות מקרומולקולרית כדי להחליף את ה-FM הישן על ידי הוספת שני מיליליטר לחלק הפנימי של תוספת תרבית התא ושני מיליליטר לחלק החיצוני של תוספת תרבית התא. לאחר דגירה של 24 שעות, השתמש בחומר רמאות של 0.125% טריפסין כדי לטריסוניזציה של הקרטינוציטים.

הקש בעדינות על דפנות הבקבוק כדי לעקור את התאים והוסף מדיום המכיל סרום כדי לנטרל את הטריפסין. לאחר ספירת התאים, הכינו תרחיף קרטינוציטים. לאחר מכן, שאפו את המדיום מתוספות תרבית התאים, והוסיפו את הקרטינוציטים לחלק העליון של הג'ל.

דוגרים על הג'ל למשך שעה. לאחר שהקרטינוציטים נצמדו למשטח הג'ל, השתמש בשני מיליליטר של KSFM, או מדיום נטול סרום CTN-57 כדי להטביע את התא בתוך תוספת תרבית הג'ל ולהוסיף שני מיליליטר FM לחלק החיצוני של תוספת תרבית התא. לאחר דגירה של 24 שעות, השליכו את המדיום הישן והחליפו אותו במדיום טרי המכיל צפיפות מקרומולקולרית.

לאחר שבעה ימים בתרבית השקועה, כדי להעלות את התרבית לממשק אוויר-נוזל, העבירו את תוספת התרבית לצלחת באר עמוקה. הוסף 10 מיליליטר של מדיום ריבוד לחלק החיצוני של תוספת תרבית התאים, תוך שמירה על פנים התוספת יבשה. לבסוף, דגרו על התרבויות והחליפו את המדיום כל שלושה ימים למשך 14 יום.

קציר ועבד אותם לפי פרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג כאן, צפיפות מקרומולקולרית אפשרה לפיברובלסטים להפקיד יותר מטריצה חוץ-תאית או ECM בהשוואה לתרביות ביקורת. לאחר החילון, היה ברור כי פיברובלסטים הם המאגרים העיקריים של קולגן 1, קולגן 4 ופיברונקטין.

נתון זה מדגים כי פיברובלסטים ולא קרטינוציטים היו המאגרים העיקריים של קולגן 7, וזהו הדיווח הראשון על שקיעה מוצלחת של קולגן 7 במבחנה. באמצעות RIM, נלכד ההיקף המלא של המטריצה שמקורה בתא. שכבת-על של תמונת ה-RIM עם צביעת נוגדנים מציגה את הכמות היחסית של אותו רכיב ECM ביחס לכמות הכוללת של ECM.

במודל עור תלת מימדי במבחנה, צפיפות מקרומולקולרית או MMC, קיצר את זמן התרבית מחמישה שבועות לשלושה, כדי להשיג תרבית עור אורגנוטיפית בוגרת. כפי שניתן לראות כאן, על ידי צביעת H ו-E, לאחר שלושה שבועות, התרבית עם MMC כללה אפידרמיס פלוריסטי ודרמיס רכס סטרומול. בנוסף, קולגן אינטנסיבי ומתמשך 7 immnunostaining זוהה בצומת הדרמלאפידרמיס של תרביות תאים צפופות בהשוואה לקולגן חלש ונקודתי 7 אימונו-צביעה בתרביות ביקורת.

מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה מראה גם נוכחות של סיבי עיגון בתרביות אורגנוטיפיות שנוצרו עם MMC, ומראה קולגן 7 פונקציונלי. מטריצות שמקורן בתאים יכולות לשמש למטרות זריעת תאים משניות כפיגום חלופי מכיוון שהמורכבות של המטריצה החוץ-תאית נשמרת, והיא מיוצרת על ידי התאים עצמם. תרביות עור אורגנוטיפיות, הנוצרות תחת צפיפות מקרומולקולרית, יכולות לשמש כמודל עור תלת מימדי משופר מכיוון שהוא מכיל דרמיס רכס סטרומלי, צומת דרמלאפידרמיס עיקרי ואפידרמיס פלוריסטרטיפי.

תרביות אורגנוטיפיות, או שוות ערך לעור שנוצרו עם צפיפות מקרומולקולרית, יכולות לשמש גם להשתלת עור מכיוון שיש להן צומת דרמלאפידרמיס מפותח יותר, מה שעשוי לשפר את הצלחת ההשתלה. בנוסף לתצהיר מטריצה חוץ-תאית משופר, ניתן ליישם צפיפות מקרומולקולרית על מערכות חוץ גופיות אחרות כדי לשפר את התגובות עם קצב מוגבל, ללא צורך להגדיל את כמות הריאגנטים. לדוגמא, תגובות שרשרת פולימראז.