Name: ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למד לייצר מערך נוגדנים מותאם אישית לניתוח תאים בודדים באמצעות אסטרטגיות זרימה בצפיפות גבוהה. שיטה זו מאפשרת זיהוי סימולטני של חלבונים תוך-תאיים ומופרשים מאותו תא בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לקרן הסטארט-אפ מ-SUNY Albany ולגישה למתקנים במרכז לחקר הסרטן של אוניברסיטת אולבני.

<ol><li>Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoproteomic+profiling+with+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Oncoproteomic profiling with antibody microarrays.</a> Genome Med. 1 (7), (2009).</li>
<li>Angenendt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+protein+and+antibody+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Progress in protein and antibody microarray technology.</a> Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).</li>
<li>Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microarray+technologies+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microarray technologies for proteomics.</a> Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).</li>
<li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+barcode+chips+for+rapid%2C+multiplexed+analysis+of+proteins+in+microliter+quantities+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+for+monitoring+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies for monitoring immune systems.</a> Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%28%2B%29+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+delivery+of+cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+for+antisense+inhibition+of+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol-Uk%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria.</a> Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+cell-cell+interaction+functions+with+applications+to+glioblastoma+multiforme+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells.</a> Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).</li>
<li>Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cellular+architectures+are+predicted+through+the+characterization+of+two-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+the+simultaneous+quantitation+of+metabolites+and+proteins+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells.</a> J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).</li>
<li>Shi, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Vermesh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density%2C+multiplexed+patterning+of+cells+at+single-cell+resolution+for+tissue+engineering+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications.</a> Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+single-cell+functional+proteomics+for+fundamental+and+applied+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications.</a> Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).</li>
<li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-encoded+antibody+libraries%3A+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+protein-protein+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">General protein-protein cross-linking.</a> Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).</li>
<li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density%2C+microfluidics-based+DNA+microarrays%2C+with+applications+to+single+cell%2C+multiplex+assays+of+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

עיצוב תבנית זרימה הוא השלב הקריטי הראשון בבודת microarray 2-D. כדי ליצור שני דפוסי DNA חופפים על מצע זכוכית, תכונות הערוץ של העיצוב הראשון צריכה להיות בניצב לאלה של (1A-B איור) השני. העיצובים בחשבון גם את היישומים במורד הזרם של microarray. במקרה של ניתוח תא בודד, microarray משמש כדי לזהות חלבונים מהתאים בודדים המוקפים בmicrochambers, לכן ממדי הערוץ נעשים בקנה אחד עם microchambers שליישר עם מערכי 2-D. כל עיצוב שניתנו על photomask וטכניקות photolit...

microarrays הנוגדן היה בשימוש נרחב במחקרי proteomic במשך עשרות שנים כדי לבחון את נוכחותם של חלבונים ממוקדים, כוללים סמנים ביולוגיים חלבון 1-3. למרות שתחום זה ניצבת כיום בפני אתגרים גדולים מטכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרות כגון ספקטרוסקופיית מסות (MS), יש עדיין הרבה מקום לשירות של microarrays נוגדנים, בעיקר משום שמכשירים אלה להרשות לעצמם נתונים לפרשנות פשוטה וממשק קל עם מבחני אחרים. בשנים האחרונות, שילוב של microarrays לפיגומי שבב סיפק microarray נוגדן הזדמנות חדשה לשגשג 4-7. לדוגמא, microarray ברקוד המשולב בשבב תא בודד בו נעשה שימוש במחקרי תקשורת סלולארי 8,9. טכנולוגיה זו יש יתרונות ייחודיים על פני טכנולוגיות microarray זמינות אחרות. הוא כולל אלמנטים במערך ב10-100 מיקרומטר, קטן בהרבה מהגודל הטיפוסי 150 מיקרומטר משמש בelemen microarray הקונבנציונליTS. הבנייה של אלמנטים במערך קטנים יותר מושגת באמצעות גישות זרימת דפוסים שיטתיות, וזה מעורר microarrays הקומפקטי שיכול לזהות חלבוני תא בודד מופרשים וחלבונים תאיים. יתרון נוסף הוא השימוש בהתקנה פשוטה, ללא מכשיר. הדבר חשוב במיוחד, משום שרוב המעבדות וחברות קטנות לא יכולים להיות מסוגלות לגשת למתקני גרעין microarray. microarrays הנוגדן ברקוד כגון תכונה משופרת תפוקת assay וניתן להשתמש בו כדי לבצע מבחני מרובבים מאוד על תאים בודדים תוך השגת רגישות גבוהה וספציפיות דומה לזו של assay immunosorbent כריך אנזים צמוד הקונבנציונלי (ELISA 8). טכנולוגיה זו מצאה יישומים רבים באיתור חלבונים מגליובלסטומה 9-11, תאי T 12, ומחזור התאים סרטניים 13. לחלופין, מערכי DNA ברקוד לבד כבר נוצלו במיקום המדויק של תאי עצב והאסטרוציטים ללחקותing ההרכבה vivo של רקמת מוח 14. פרוטוקול זה מתמקד רק בשלבי הניסוי ולוקי הצטברות של microarray הנוגדן ברקוד דו-ממדי (2-D) שבה יש יישומים פוטנציאליים בזיהוי של סמנים ביולוגיים בדגימות fluidic ובתאים בודדים. הטכנולוגיה מבוססת על microarray דנ&quot;א חד-גדילים, חד-ממדי (1-D) מיעון נבנה באמצעות oligonucleotides מאונך שהם בדוגמת מרחבית על מצעי זכוכית. דפוס 1-D נוצר כאשר זרימת ערוצים מקבילים המשמשים בשלב זרימת הדפוסים, ודפוס כזה מופיע כלהקות דיסקרטיות חזותי דומות ל1-D Universal Product Code (UPC) ברקודים. בניית מערך נוגדן 2-D (מ &#39;x n) - מזכירה קוד מטריקס 2-D מהיר התגובה (QR) - צריכה אסטרטגיות דפוסים מורכבות יותר, אך מאפשרת לקיבוע של נוגדנים בצפיפות גבוהה 8,15. הייצורדורש שני שלבי דפוסי DNA, עם הדפוס הראשון בניצב לשני. נקודות חיתוך של שני דפוסים אלה מהווים את המרכיבים מ &#39;x n של המערך. על ידי בחירה אסטרטגית הרצפים של DNA חד-גדילים (ssDNA) מנוצל בזרימת דפוסים, כל אלמנט במערך נתון מוקצה כתובת ספציפית. התייחסות מרחבית זה הכרחי בהבחנה בין אותות הקרינה בשקופית microarray. מערך ssDNA מומר מערך נוגדן דרך ההתאגדות של conjugates DNA-נוגדן המשלים, ויצר פלטפורמה שנקראת ספריית נוגדן בקידוד ה- DNA (DEAL 16). פרוטוקול וידאו זה מתאר את השלבים העיקריים ביצירת מערכי nxm נוגדן הכוללים הכנת polydimethylsiloxane (PDMS) תבניות ברקוד, זרימת דפוסים ssDNA בשני כיוונים, הכנת conjugates DEAL הנוגדן-oligonucleotide, והמרת מערך 3 x 3 DNA ל3x 3 מערך נוגדנים.

<table><tbody><tr><td>בסיס אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 חומר ריפוי אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 Photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>פרוסות סיליקון&nbsp;</td><td>פרוסות אוניברסיטאיות</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית מצופות פולי-L-ליזין</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים</td> טכנולוגיות <td></td><td>DNA משולבות</td><td>*הוזמן בהתאמה אישית מטכנולוגיות DNA משולבות, ראה <חזק>טבלה 2</חזק>.</td></tr><tr><td>תמיסת מלאי דבק פולי-ליזין</td><td>Newcomer Supply</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sulfosuccinimidyl) suberate&nbsp; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x מי מלח חוצץ פוספט, pH 7.4</td><td>איכות ביולוגית</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta Explorer 100 מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה (FPLC)</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&nbsp;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL עמודה</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>לכידת נוגדנים</td><td>שונים</td><td></td> <td>שונים*בחירת הנוגדנים תלויה ביישום</td></tr><tr><td>Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)</td> <td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)</td> <td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>N,N-דימתילפורממיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון,</td><td>אקרוס</td><td>נטול מים 42356</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon מסנן ספין אולטרה 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>ציפוי</td> ספין UFC201024 <td></td></tr><tr><td></td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>אגרוף ביופסיה עם בוכנה (קוטר 1.0 מ"מ)</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>סופר יהלומים (סגנון 60)</td><td>SPI מספק</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>טרימתילכלורוסילן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן microarray

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

מיקרו-מערך נוגדנים כטכנולוגיה מפותחת מאותגר כיום על ידי כמה טכנולוגיות מבוססות או מתפתחות אחרות בעלות תפוקה גבוהה. בדוח זה, אנו מחדשים את טכנולוגיית מיקרו-מערך הנוגדנים על ידי שימוש בגישה חדשה לייצור ועל ידי הצגת תכונות חדשות. הייצור של מיקרו-מערך הנוגדנים בצפיפות גבוהה שלנו מושג באמצעות דפוס זרימה מכוון בניצב של DNA חד-גדילי והמרה לאחר מכן בתיווך מצומדים של נוגדנים ל-DNA. פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים בדפוס זרימה של DNA, ייצור וטיהור מצומדים של נוגדנים ל-DNA, והערכת איכות המיקרו-מערך המפוברק. האחידות והרגישות ניתנות להשוואה למיקרו-מערכים קונבנציונליים, בעוד שייצור המיקרו-מערך שלנו אינו דורש סיוע של מדפסת מערך וניתן לבצע אותו ברוב מעבדות המחקר. היתרון העיקרי הנוסף הוא שגודל יחידות המיקרו-מערך שלנו קטן פי 10 מזה של מערכים מודפסים, מה שמציע את היכולת הייחודית לנתח חלבונים פונקציונליים מתאים בודדים בעת התממשקות עם עיצובי שבבים גנריים. ניתן להשתמש בטכנולוגיית ברקוד זו באופן נרחב בזיהוי סמנים ביולוגיים, מחקרי איתות תאים, הנדסת רקמות ומגוון יישומים קליניים.

העיצובים לתבניות PDMS (איור 1 א-1B) נערך באמצעות תכנית CAD (AutoCAD). שני עיצובים לראות ערוצי תכונה לזרימת דפוסים, אחד אופקי ואחד אנכי. חלקי ימין ועל השמאל של כל עיצוב הם סימטריים; כל אחד מהם יכול להיות פתחי הכניסה או שקעים. כל אחד מערוצים 20 הוא מתפתל מקצה אחד כל הדרך לקצה השני. כל עיצוב מודפס על photomask כרום (איור 1 ג). המאסטר SU-8 המפוברק על רקיק מוצג באיור 1D. כדי להקל על זרימת הדפוסים של PLL...

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של בקנה מידה גדול, מערך ה- DNA או נוגדן דו ממדים מרובב, עם יישומים פוטנציאליים במחקרי איתות תא וזיהוי סמנים ביולוגיים.

ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לייצר מערך נוגדנים עם יישומים בניתוח תא בודד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אנליזה של תא בודד כגון כיצד ניתן לזהות חלבונים סודיים וחלבונים תוך-תאיים בו זמנית מאותו תא בודד. ואיך אנחנו יכולים לייצר פלטפורמת מיקרו-מערך כדי להשיג את המטרה הזו.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה אישית. על ידי שינוי אסטרטגיות דפוס הזרימה, ניתן ליצור מערכים בממדים שונים. צור מראש את המאסטר SU-8 עבור דפוסי זרימת הברקוד.ההוראות ניתנות בפרוטוקול הטקסט. זה כרוך בעיצוב והכנת מסכת צילום כרום. הנחת המסכה על שכבה עמידה בפני אור ומריחת UV מספקת את התבנית.כדי להתחיל להכין את תבנית הברקוד PDMS, שלבו 40 גרם בסיס אלסטומר סיליקון עם ארבעה גרם חומר ריפוי, ולאחר מכן ערבבו במרץ במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את הגז מהתמיסה הקדם-פולימרית למשך 20 דקות בוואקום. לאחר מכן, טען את התמיסה לצלחת פטרי המכילה פרוסת סיליקון עם ה-SU-8 המאסטר של תבנית הברקוד.יוצקים את התמיסה לעומק של 7.45 מילימטרים. לאחר מכן, הסר את הגז מהתערובת בכלי כדי להסיר את כל הבועות שנותרו. עקוב אחר הסרת הגזים על ידי אפיית התערובת במשך שעה בחום של 75 מעלות צלזיוס כדי לרפא את ה-PDMS.לאחר מכן, חותכים בעזרת אזמל, הסר בזהירות את תבנית הברקוד. לאחר מכן, מקלפים בזהירות את הלוח מהרקיק. לאחר מכן, חתוך את שולי הלוח כדי ליצור את הצורה הרצויה לתבנית.סיים את התבנית באמצעות אגרוף ביופסיה עם בוכנה כדי לנקב חורים של חצי מילימטר בתכונות העגולות בתבנית המייצגות כניסות ויציאות. לאחר ניפוח אבק ממגלשת זכוכית מצופה פולי-L-ליזין עם אקדח חנקן, חבר את תבנית ה-PDMS לשקופית. מיישרים בזהירות את שולי התבנית לשקופית.כעת, אופים את המכלול במשך 90 דקות בחום של 75 מעלות צלזיוס כדי לחזק את הקשר בין ה-PDMS למגלשה. בינתיים, הכינו 20 חתיכות של צינורות פוליאתילן גמישים לכניסות והיציאות. על כל פיסת צינור, חבר סיכה חלולה מנירוסטה בקוטר מילימטר אחד.לאחר מכן, באמצעות הסיכות, מלאו את האורכים בסנטימטר או יותר של פולי-L-ליזין. לאחר ההדבקה לזכוכית, מהדקים בזהירות את הסיכות לכניסות התבנית. זהו השלב הקשה ביותר בהכנה.אל תמהרו בתהליך. חבר את הקצה השני של הצינורות למערך מיכל חנקן מווסת לחץ המורכב מרשת של 20 שסתומים תלת-כיווניים ויכול להתמודד עם שתי תבניות בבת אחת. באמצעות ההגדרה, נשפו את התמיסה דרך התבנית ב-0.5 ל-PSI אחד למשך שש שעות לפחות.התחל בשאיבת תמיסות DNA חד-גדיליות טריות שהוכנו ב-BS-3 דרך סיכות הנירוסטה ולתוך צינורות הפוליאתילן. לאחר מכן, חבר את תבנית ה-PDMS למקור החנקן והזרם את התמיסה דרך תבנית הברקוד למשך כ-40 דקות או עד שכל הערוצים מתמלאים. לאחר מכן, עצרו את הזרימה ותנו לתבנית לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.לאחר מספר שעות אופים את תבנית הברקוד בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר האפייה, נתק את התבנית מהמגלשה ושטוף בעדינות את השקופית עם 01% SDS. לאחר מכן, שטפו את השקופית שלוש פעמים במים טהורים במיוחד.עקוב אחר השטיפות על ידי ייבוש שקופית הברקוד באמצעות ספינר שקופיות. לאחר הייבוש, אחסן את שקופית הברקוד בשפופרת נקייה של 50 מיליליטר. כדי להמשיך, עקוב אחר פרוטוקול הטקסט כדי לאמת את התבנית החד-ממדית.כדי לבצע את הליך האימות, יש לחסום את השקופית, להכליא אליה ציאנין שלושה DNA משלים ולמדוד את התוצאות. למאסטר SU-8 למערך שלושה על שלושה יש דפוס זרימה בניצב לזה של העיצוב הראשון. השתמש בשיטה שתוארה קודם לכן כדי ליצור תבנית PDMS חדשה של דפוס זה.כדי להתחיל, הכינו ריכוזי עבודה טריים של תשעת האוליגונוקלאוטידים. כעת, הזרם פתרון חסימת BSA של שלושה אחוזים לכל 20 הערוצים של מגלשת המערך למשך שעה ב-0.5 ל-PSI אחד. לאחר מכן, טען את פתרונות ה-DNA לערוצים המתאימים להם.לאחר הזרמתם במשך כ-40 דקות, דגרו את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר ל-DNA להכליא. לאחר מכן, הזרימו שלושה אחוזים של פתרון חסימת BSA לכל 20 הערוצים למשך שעה. זה יסיר את ה-DNA הלא היברידי.כעת, קלף את שקופית המערך מה-PDMS וטבל את השקופית לשלושה אחוזי BSA פעם אחת. לאחר מכן, טבלו את השקופית ל-PBS פעמיים ואחריה טבילה אחת ב-PBS של שני אחוזים. לאחר מכן, כמו קודם, יבש את השקופית באמצעות מסובב שקופיות מיקרוסקופ.כדי להמשיך, בצע שלב אימות הדומה לאימות שקופיות חד-ממדיות. השתמש באוליגונוקלאוטידים ראשוני אחד עד תשע ראשוניים כולם מצומדים לציאנין שלוש. שמור את שקופית המערך של שלושה על שלושה בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר לשימוש לאחר מכן.פרוטוקול הטקסט מסביר עוד כיצד להמיר את מערך ה-DNA למערך נוגדנים. לאחר הכנה וטיהור של צימודי הנוגדנים-אוליגו, הכינו תבנית PDMS נוספת עם מיקרו-תאים. ראה את הטקסט לפרטים.חבר את התבנית הזו עם שקופית המערך. כעת, חסמו את המגלשה עם אחוז BSA אחד ודגרו אותה למשך שעה בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה הכינו 200 מיקרו-ליטר של מצומדים נוגדנים-אוליגונוקלאוטיד.לאחר החסימה, הוסף את קוקטייל הנוגדנים-אוליגו להגדרה. הניחו לנוגדנים לדגור על המערך במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן נקו וייבשו את המגלשה לפני שתמשיכו בטבילות השקופיות המתוארות בפרוטוקול הטקסט. לאחר ביצוע הפרוטוקול המתואר, תוך שימוש במערך של שלושה על שלושה, נעשה שימוש בפאנל הנוגדנים שהתקבל בזיהוי מולטי-פלקס, בעיקר באמצעות פלטפורמת סנדוויץ' ELISA.החלבונים הראו שונות של פחות מ-10% מקצה אחד לקצה השני של שקופית הזכוכית. במערך שלוש על שלוש, ניתן לזהות עד שבעה חלבונים יחד עם התייחסות המסומנת על ידי ציאנין שלוש ובקרה שלילית. בניסוי של תא בודד שבוצע עבור מחקר גידול, ששת החלבונים התגלו בו זמנית.לצורך כיול, חלבונים רקומביננטיים הוחלו על מערך בריכוזים שונים. רגישות הזיהוי הייתה די דומה לסנדוויץ' קונבנציונאלי ELISA. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תבניות ה-PDMS נקיות מחלקיקים.אבק בתעלות עלול לגרום למערכים עם אחידות ירודה ורגישות נמוכה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן לחקור איתות תאים-תאים באמצעות מודלים של מיקרו-סביבות גידול.

flow-pattern-guided-fabrication-high-density-barcode-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו תיאר הליך disaggregation של סרטן המעי (CRC) לייצר תאים בודדים קיימא, אשר נלכדים אז על microarrays נוגדן אישית הכרה אנטיגנים השטח (DotScan microarray CRC). תת אוכלוסיות של תאים חייב microarray ניתן צדודית על ידי ריבוב הקרינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים מתוייגים עם צבעי ניאון.

סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

שיטת הקרנה פונקציונלית קומבינטורית לתובנה להשפעות של ההרכב המולקולרי של microenvironments על תפקודים תאיים מתוארת. השיטה מנצלת את הטכנולוגיות קיימות microarray מבוססים לייצר מערכים של microenvironments קומבינטורית מוגדר התומכים הידבקות תא וניתוח פונקציונלי.

ייצור ושימוש של microarrays Microenvironment (MEArrays)

סרטון זה מדגים טכנולוגיית מערך גליקן מודפס לניתוח נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור בסרום עכברים. הנוגדנים בסרום אינטראקציה עם גליקנים ספציפיים על השבב, אשר אושר על ידי immunostaining ואחריו סריקה פלואורסצנטית.

איתור נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור הדם עם מערך גליקן מודפס

סרטון זה מדגים טכניקה המיישמת טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי כדי לאפיין את הספציפיות של נוגדנים המזהים שינויים לאחר תרגום (PTM) על פפטידי היסטון. שקופית מיקרו-מערך המכילה פפטידים מצומדים פלואורופורים משותקים עם שילובי PTM ידועים מטופלת בנוגדנים ספציפיים ל-PTM מטרה. תהליך זה מסייע לזהות את הספציפיות של הנוגדן למטרה ואת התגובתיות הצולבת הפוטנציאלית שלו עם PTM שאינם מטרה.

טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי לפרופיל ספציפיות של נוגדנים

סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי זני ציאנובקטריה בדגימה סביבתית באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים. דגימות הנושאות חיידקים שונים מקיימות אינטראקציה עם נוגדנים מודפסים, והצבעה חיסונית עם נוגדנים אנטי-ציאנובקטריאליים המסומנים כפלואורופורים חושפת את נוכחותם של זנים ציאנובקטריאליים ספציפיים באמצעות פלואורסצנטיות בנקודות שונות.

טכניקה לזיהוי זנים ציאנובקטריאליים באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים

נוכחותם של רעלנים ציאנובקטריאליים במאגרי מים מתוקים למאכל אדם היא דאגה גדולה עבור רשויות ניהול המים. כדי להעריך את הסיכון לזיהום מים, מאמר זה מתאר פרוטוקול לגילוי בשטח של זנים ציאנובקטריאליים בדגימות נוזליות ומוצקות באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים.

פרוטוקול הניסוי לזיהוי כחוליות בדגימות נוזלים ומוצקים עם צ'יפ Microarray נוגדן

כאן אנו מציגים מיקרו droplet למיעון-מערכים (עיוותים), שיטה מערך מבוסס droplet מסוגל לקבוע חלבון מוחלטת שפע תאים בודדים. נדגים את היכולת של ארכיון דיגיטלי כדי לאפיין את הטרוגניות בביטוי של p53 חלבון משתיק קול גידול בקו תאים סרטניים אנושיים.

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מיקרוarray חלבון שנבנה על ידי הדפסת אנטיגנים שפעת על ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות בו סרום בדיקה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מעל 250 אנטיגנים מפני זנים וירוסים שונים, ובכך המאפשר מדידה של רוחב של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס.

שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

ניתוח תמונת ברקוד מרובה שיפר לאחרונה את אפיון המיקרו-סביבה של הגידול, ומאפשר מחקרים מקיפים של הרכב התא, המצב התפקודי והאינטראקציות בין התא לתא. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול צביעה והדמיה באמצעות ברקוד של נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים והדמיית מחזור, המאפשרת שימוש בטכניקת ניתוח תמונה בממד גבוה.

ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

למד לייצר מערך נוגדנים מותאם אישית לניתוח תאים בודדים באמצעות אסטרטגיות זרימה בצפיפות גבוהה. שיטה זו מאפשרת זיהוי סימולטני של חלבונים תוך-תאיים ומופרשים מאותו תא בודד.

ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray

גלה סרטונים נוספים