ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray
January 6th, 2016
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של בקנה מידה גדול, מערך ה- DNA או נוגדן דו ממדים מרובב, עם יישומים פוטנציאליים במחקרי איתות תא וזיהוי סמנים ביולוגיים.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לייצר מערך נוגדנים עם יישומים בניתוח תא בודד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אנליזה של תא בודד כגון כיצד ניתן לזהות חלבונים סודיים וחלבונים תוך-תאיים בו זמנית מאותו תא בודד. ואיך אנחנו יכולים לייצר פלטפורמת מיקרו-מערך כדי להשיג את המטרה הזו.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה אישית. על ידי שינוי אסטרטגיות דפוס הזרימה, ניתן ליצור מערכים בממדים שונים. צור מראש את המאסטר SU-8 עבור דפוסי זרימת הברקוד.
ההוראות ניתנות בפרוטוקול הטקסט. זה כרוך בעיצוב והכנת מסכת צילום כרום. הנחת המסכה על שכבה עמידה בפני אור ומריחת UV מספקת את התבנית.
כדי להתחיל להכין את תבנית הברקוד PDMS, שלבו 40 גרם בסיס אלסטומר סיליקון עם ארבעה גרם חומר ריפוי, ולאחר מכן ערבבו במרץ במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את הגז מהתמיסה הקדם-פולימרית למשך 20 דקות בוואקום. לאחר מכן, טען את התמיסה לצלחת פטרי המכילה פרוסת סיליקון עם ה-SU-8 המאסטר של תבנית הברקוד.
יוצקים את התמיסה לעומק של 7.45 מילימטרים. לאחר מכן, הסר את הגז מהתערובת בכלי כדי להסיר את כל הבועות שנותרו. עקוב אחר הסרת הגזים על ידי אפיית התערובת במשך שעה בחום של 75 מעלות צלזיוס כדי לרפא את ה-PDMS.
לאחר מכן, חותכים בעזרת אזמל, הסר בזהירות את תבנית הברקוד. לאחר מכן, מקלפים בזהירות את הלוח מהרקיק. לאחר מכן, חתוך את שולי הלוח כדי ליצור את הצורה הרצויה לתבנית.
סיים את התבנית באמצעות אגרוף ביופסיה עם בוכנה כדי לנקב חורים של חצי מילימטר בתכונות העגולות בתבנית המייצגות כניסות ויציאות. לאחר ניפוח אבק ממגלשת זכוכית מצופה פולי-L-ליזין עם אקדח חנקן, חבר את תבנית ה-PDMS לשקופית. מיישרים בזהירות את שולי התבנית לשקופית.
כעת, אופים את המכלול במשך 90 דקות בחום של 75 מעלות צלזיוס כדי לחזק את הקשר בין ה-PDMS למגלשה. בינתיים, הכינו 20 חתיכות של צינורות פוליאתילן גמישים לכניסות והיציאות. על כל פיסת צינור, חבר סיכה חלולה מנירוסטה בקוטר מילימטר אחד.
לאחר מכן, באמצעות הסיכות, מלאו את האורכים בסנטימטר או יותר של פולי-L-ליזין. לאחר ההדבקה לזכוכית, מהדקים בזהירות את הסיכות לכניסות התבנית. זהו השלב הקשה ביותר בהכנה.
אל תמהרו בתהליך. חבר את הקצה השני של הצינורות למערך מיכל חנקן מווסת לחץ המורכב מרשת של 20 שסתומים תלת-כיווניים ויכול להתמודד עם שתי תבניות בבת אחת. באמצעות ההגדרה, נשפו את התמיסה דרך התבנית ב-0.5 ל-PSI אחד למשך שש שעות לפחות.
התחל בשאיבת תמיסות DNA חד-גדיליות טריות שהוכנו ב-BS-3 דרך סיכות הנירוסטה ולתוך צינורות הפוליאתילן. לאחר מכן, חבר את תבנית ה-PDMS למקור החנקן והזרם את התמיסה דרך תבנית הברקוד למשך כ-40 דקות או עד שכל הערוצים מתמלאים. לאחר מכן, עצרו את הזרימה ותנו לתבנית לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
לאחר מספר שעות אופים את תבנית הברקוד בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר האפייה, נתק את התבנית מהמגלשה ושטוף בעדינות את השקופית עם 01% SDS. לאחר מכן, שטפו את השקופית שלוש פעמים במים טהורים במיוחד.
עקוב אחר השטיפות על ידי ייבוש שקופית הברקוד באמצעות ספינר שקופיות. לאחר הייבוש, אחסן את שקופית הברקוד בשפופרת נקייה של 50 מיליליטר. כדי להמשיך, עקוב אחר פרוטוקול הטקסט כדי לאמת את התבנית החד-ממדית.
כדי לבצע את הליך האימות, יש לחסום את השקופית, להכליא אליה ציאנין שלושה DNA משלים ולמדוד את התוצאות. למאסטר SU-8 למערך שלושה על שלושה יש דפוס זרימה בניצב לזה של העיצוב הראשון. השתמש בשיטה שתוארה קודם לכן כדי ליצור תבנית PDMS חדשה של דפוס זה.
כדי להתחיל, הכינו ריכוזי עבודה טריים של תשעת האוליגונוקלאוטידים. כעת, הזרם פתרון חסימת BSA של שלושה אחוזים לכל 20 הערוצים של מגלשת המערך למשך שעה ב-0.5 ל-PSI אחד. לאחר מכן, טען את פתרונות ה-DNA לערוצים המתאימים להם.
לאחר הזרמתם במשך כ-40 דקות, דגרו את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר ל-DNA להכליא. לאחר מכן, הזרימו שלושה אחוזים של פתרון חסימת BSA לכל 20 הערוצים למשך שעה. זה יסיר את ה-DNA הלא היברידי.
כעת, קלף את שקופית המערך מה-PDMS וטבל את השקופית לשלושה אחוזי BSA פעם אחת. לאחר מכן, טבלו את השקופית ל-PBS פעמיים ואחריה טבילה אחת ב-PBS של שני אחוזים. לאחר מכן, כמו קודם, יבש את השקופית באמצעות מסובב שקופיות מיקרוסקופ.
כדי להמשיך, בצע שלב אימות הדומה לאימות שקופיות חד-ממדיות. השתמש באוליגונוקלאוטידים ראשוני אחד עד תשע ראשוניים כולם מצומדים לציאנין שלוש. שמור את שקופית המערך של שלושה על שלושה בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר לשימוש לאחר מכן.
פרוטוקול הטקסט מסביר עוד כיצד להמיר את מערך ה-DNA למערך נוגדנים. לאחר הכנה וטיהור של צימודי הנוגדנים-אוליגו, הכינו תבנית PDMS נוספת עם מיקרו-תאים. ראה את הטקסט לפרטים.
חבר את התבנית הזו עם שקופית המערך. כעת, חסמו את המגלשה עם אחוז BSA אחד ודגרו אותה למשך שעה בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה הכינו 200 מיקרו-ליטר של מצומדים נוגדנים-אוליגונוקלאוטיד.
לאחר החסימה, הוסף את קוקטייל הנוגדנים-אוליגו להגדרה. הניחו לנוגדנים לדגור על המערך במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן נקו וייבשו את המגלשה לפני שתמשיכו בטבילות השקופיות המתוארות בפרוטוקול הטקסט. לאחר ביצוע הפרוטוקול המתואר, תוך שימוש במערך של שלושה על שלושה, נעשה שימוש בפאנל הנוגדנים שהתקבל בזיהוי מולטי-פלקס, בעיקר באמצעות פלטפורמת סנדוויץ' ELISA.
החלבונים הראו שונות של פחות מ-10% מקצה אחד לקצה השני של שקופית הזכוכית. במערך שלוש על שלוש, ניתן לזהות עד שבעה חלבונים יחד עם התייחסות המסומנת על ידי ציאנין שלוש ובקרה שלילית. בניסוי של תא בודד שבוצע עבור מחקר גידול, ששת החלבונים התגלו בו זמנית.
לצורך כיול, חלבונים רקומביננטיים הוחלו על מערך בריכוזים שונים. רגישות הזיהוי הייתה די דומה לסנדוויץ' קונבנציונאלי ELISA. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תבניות ה-PDMS נקיות מחלקיקים.
אבק בתעלות עלול לגרום למערכים עם אחידות ירודה ורגישות נמוכה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן לחקור איתות תאים-תאים באמצעות מודלים של מיקרו-סביבות גידול.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את ייצור של מערך נוגדנים הניתן להתאמה אישית עם יישומים בניתוח תא בודד. הוא נועד לזהות חלבונים סודיים ואינטר-תאיים בו-זמנית מאותו תא בודד.
רכיבים מרכזיים של המחקר
תחום המדע
- ניתוח תא בודד
- ייצור מערכי נוגדנים
- זיהוי סמנים ביולוגיים
רקע
- הבנת מסלולי איתות תאיים היא קריטית למחקר ביולוגי.
- שיטות נוכחיות עשויות שלא לזהות ביעילות מספר חלבונים בתאים בודדים.
- מערכים הניתנים להתאמה אישית יכולים לשפר את יכולות הזיהוי.
- אסטרטגיות תבנית זרימה מאפשרות ממדים שונים של המערך.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לזיהוי בו-זמני של חלבונים בתאים בודדים.
- ליצור פלטפורמת מיקרו-מערך המותאמת לצרכים מחקריים ספציפיים.
- לשפר את ההבנה של תהליכים אינטר-תאיים.
שיטות ששימשו
- ייצור של מערך נוגדנים בקנה מידה גדול.
- שימוש בתבניות SU-8 עבור דפוסי זרימת קוד בר.
- אסטרטגיות תבנית זרימה הניתנות להתאמה אישית.
- יישום המערך בניתוח תא בודד.
תוצאות מרכזיות
- ייצור מוצלח של מערך נוגדנים מרובה.
- הודגמה יכולת לזהות מספר חלבונים מתאים בודדים.
- מערכים הניתנים להתאמה אישית הראו רבגוניות ביישומים.
- פוטנציאל לשיפורים משמעותיים בגילוי סמנים ביולוגיים.
מסקנות
- השיטה שפותחה משפרת את היכולת של ניתוח תא בודד.
- מערכים הניתנים להתאמה אישית יכולים להיות מותאמים לשאלות מחקר ספציפיות.
- גישה זו עשויה להוביל לתובנות חדשות במסלולי איתות תאיים ובמחקר סמנים ביולוגיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-density barcode antibody microarrays fabricated via flow-patterning enable multiplexed protein detection at single-cell resolution, addressing critical needs in early discovery and translational research. This platform supports simultaneous analysis of secreted and intracellular proteins, enhancing mechanistic de-risking and predictive confidence for target validation. The customizable, miniaturized format facilitates integration into diverse R&D workflows, supporting portfolio-wide biomarker and signaling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein expression and signaling pathways at the single-cell level.
- Supports functional target validation by detecting multiple analytes from individual cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through multiplexed protein profiling.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microarray platforms for high-throughput screening of protein biomarkers.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for assay standardization.
- Supports scalable, printer-free fabrication adaptable to various assay formats.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein expression in single cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant single-cell models for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting multiplexed protein analysis.
- Reduces biological risk in advancing candidates by providing high-content, quantitative data.
- Facilitates studies of cell-cell signaling in tumor microenvironments and other complex systems.
Pipeline & Workflow Integration
This barcode microarray technology integrates from early discovery through lead identification and translational research, supporting multiplexed protein analysis in single-cell and tissue models.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification at single-cell resolution.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables sensitive, multiplexed measurement of protein expression and signaling outputs.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease-relevant model studies.
- Enterprise Reuse: Delivers a customizable, scalable platform adaptable across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and miniaturizes microarray fabrication for broad laboratory adoption.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content data early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with robust protein profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, DNA-antibody conjugation, and microarray validation.
- Needs access to PDMS molding, flow-patterning equipment, and fluorescence detection systems.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and sensitivity.
- Adaptable to various model systems, including single-cell and tissue microenvironments.
- Uniformity and sensitivity depend on particulate-free fabrication and precise handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
One-dimensional DNA Barcode Slides: Preparing the PDMS Barcode Mold
2:21
One-dimensional DNA Barcode Slides: Patterning of Poly-L-lysine (PLL)
3:39
One-dimensional DNA Barcode Slides: Patterning of ssDNA
5:00
Two-dimensional 3x3 DNA Arrays: Preparing the PDMS Barcode Mold and Flow Patterning of ssDNA
6:17
Two-dimensional 3x3 DNA Arrays: Validation and Immunoassay
7:32
Results: Multiplex-protein Detection from Single-cell Preparations
8:25
Conclusion
