לוקמיה עמידה דוגמנות כימותרפיה במבחנה

המטרה הכוללת של הליך זה, היא לדגמן טוב יותר לוקמיה לימפובלסטית חריפה עמידה, או ALL, במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בטיפול ב-ALL עקשן לגבי האופן שבו המיקרו-סביבה של מח העצם משפיעה על כל העמידות הכימותרפית של התאים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא זולה משמעותית וגוזלת פחות זמן מאשר שימוש במודלים מסורתיים של בעלי חיים כדי לבחון תמיכה בתרופות על תאי ALL עמידים.

התחל בזריעה של חמש עד 20 פעמים 10 עד שישי של תאים לוקמיים ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית ספציפי לגידול על צלחת של 100 מילימטר של 80 עד 90% תאי סטרומה של מח עצם או אוסטאובלסטים. כל יום רביעי, הטה את הצלחת הצידה ושאף את כל המדיום מלבד מיליליטר אחד, תוך הקפדה לא להפריע לשכבת התאים הדביקה. לאחר מכן, הוסף בזהירות תשעה מיליליטר של מדיום תרבית תאים לוקמיים טריים טיפה לפינת הצלחת לאורך הצד כדי להבטיח הפרעה מינימלית של התאים הדבקים.

לאחר היום ה-12 של תרבית משותפת, פיפטה בעדינות את מדיום התרבית למעלה ולמטה מעל הצלחת כחמש עד 10 פעמים כדי לאסוף את התאים הלוקמיים הצפים. ומעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, זרעו מחדש את התאים על צלחת חדשה של 80 עד 90% תאי סטרומה של מח עצם, או אוסטאובלסטים, כפי שהודגם זה עתה.

עד היום הרביעי ייווצרו שלוש תת-אוכלוסיות של תאים לוקמיים, כאשר התאים הלוקמיים המרחפים צפים בחופשיות בתווך. התאים הלוקמיים הבהירים של Phase נצמדים לפני השטח של התא החד-שכבתי הדבק, ותאי הלוקמיה Phase Dim נדדו מתחת לשכבה החד-שכבתית. להכנת עמודי החרוזים G10, ראשית יש לחמם מחדש 30 מיליליטר של מדיום תרבית תאים לכל עמודה ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי למשוך צמר זכוכית לגדילים דקים ורופפים. והוסף שכבות מרובות של גדילים ארוזים קלות למזרק אחד של 10 מיליליטר לכל עמודה הדרושה. כאשר המזרק מלא 2/3, חבר לקצה תא עצירה חד כיווני במצב סגור, והדק את המזרק על מעמד טבעת גבוה מספיק כדי שניתן יהיה להניח צינור איסוף חרוטי של 50 מיליליטר מתחת לתא העצירה.

כעת, הנח צינור איסוף מתחת לעמוד המזרק. והשתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להוסיף טיפות של חלקיקי G10, תלויים ב- PBS, על גבי צמר הזכוכית. המשיכו להוסיף את חלקיקי ה-G10 עד שנוצרת גלולה של שני מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף לעמודה שני מיליליטר של המדיום שחומם מראש. ופתח לאט לאט את שסתום תא העצירה, כך שהמדיום יזרום מהעמוד טיפה. כאשר 10 מיליליטר בינוני התנקזו במלואם דרך העמוד, סגור את תא העצירה.

השליכו את הזרימה והניחו צינור איסוף חדש מתחת לעמודה. כדי לקצור את תת-אוכלוסיית הגידול התלויה, שאפו את המדיום מצלחת התרבות המשותפת של התאים הלוקמיים, והשתמשו באותו מדיום כדי לשטוף בעדינות את הצלחת פעם אחת. לאחר מכן, העבירו את תת-אוכלוסיית התאים הלוקמיים המתרחפים לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר.

כדי לקצור את תת-אוכלוסיית הגידול Phase Bright, הוסף 10 מיליליטר של מדיום טרי בחזרה לצלחת התרבות המשותפת. ולשטוף בערך חמש פעמים במרץ מספיק כדי להסיר את התאים הלוקמיים הדבקים מבלי לעקור את השכבה החד-שכבתית של התא הדבק. לאחר מכן, העבירו את תת-האוכלוסייה של Phase Bright לצינור חרוטי משלה בנפח 15 מיליליטר.

כדי לקצור את תת-אוכלוסיית הגידול Phase Dim, הסר את המדיום הנותר עם שטיפת PBS של מיליליטר אחד. ונתק את התאים עם שלושה מיליליטר טריפסין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הקש בעדינות על דפנות הצלחת כדי לעקור את התאים הדבקים, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של FBS כדי לעצור את התגובה האנזימטית.

לאחר מכן, שטפו את הסרום שלוש עד חמש פעמים כדי לפרק את כל הצברים של תאים גדולים. ולהעביר את תת-האוכלוסייה הלא מטוהרת של Phase Dim לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. כאשר כל תת-האוכלוסיות נאספו, סובבו את התאים.

ולהשעות מחדש כל אחד מהכדורים במיליליטר אחד של מדיום מחומם מראש. כאשר תא העצירה סגור לחלוטין, עבור כל תת-אוכלוסייה, השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוסיף את כל נפח התאים של מיליליטר, טיפה, על החלק העליון של אחת מעמודות ה-G10 המוכנות, וודא שהתאים נשארים על גבי או בתוך גלולת ה-G10. אפשר לתאים לדגור על גלולת G10 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף לעמודה אחד עד שלושה מיליליטר של מדיום טרי שחומם מראש. ופתח את תא העצירה כך שהמדיום ייצא לאט מהעמודים, טיפה. המשך להוסיף מדיום מחומם מראש לעמודים, במרווחים של מיליליטר עד שניים.

כאשר נאספו בסך הכל 15 עד 20 מיליליטר של תאים לוקמיים, סגור את תא העצירה וכסה את צינור האיסוף. לאחר מכן, סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה במאגר הניתוח המתאים במורד הזרם. לאחר טריפסיניזציה של שכבת התא הדבקה, נצפות שתי אוכלוסיות נפרדות של תאים על ידי ניתוח פיזור קדימה לעומת צד.

לאחר הפרדת G10, מתאוששת אוכלוסייה טהורה של כל התאים. מעניין במיוחד, כל תאי ה-Phase Dim שהתאוששו מתאי סטרומה של מח עצם, או תרביות אוסטאובלסטים, מציגים מעט מאוד מוות לאחר חשיפתם לכימותרפיה ציטוטוקסית. בזמן ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור לבצע את השלבים הללו בצורה נכונה ככל האפשר כדי להפחית את כל השינויים הפנוטיפיים שעלולים להתרחש בתאים הלוקמיים.

טכניקה זו מספקת דרך לחוקרים בתחום חקר הלוקמיה למדל את הלוקמיה העמידה לכימותרפיה במודל מבחנה הדומה יותר למיקרו-סביבה של מח העצם.