ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים
22 בפברואר 2016
פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת את רמות החלבון באתרן בעוברים טרום השרשה של עכברים. אז שיטה זו מאפשרת לנו לבצע ניתוח תפוקה גבוהה של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה של תא בודד בצורה חצי אוטומטית. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לכמת ריכוזי חלבון בתמונות קונפוקליות בהן יש צפיפות גרעינית גבוהה וכאשר רוצים לחקור הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים.
כדי להתחיל, השתמש בלהבה פתוחה על פיפטת פסטור מזכוכית כדי לצייר קצה נימי בקצה. שפשפו בעדינות את הקצה הרחוק של הפיפטה על הנימים, כדי לשבור אותו תוך יצירת קצה קהה. לאחר הקרבת עכברה בהריון ביום ההתפתחות העוברי הרצוי, יש לחשוף את קרבי הבטן לפי פרוטוקול הטקסט ולאתר את הרחם.
החזיקו את קצה צוואר הרחם, חתכו את צוואר הרחם ומשכו בעדינות כלפי מעלה כדי למתוח את שתי קרני הרחם. חתוך ממנו את השומן, הקפד לא לנקב את דופן הרחם. חותכים מעל הביציות, מתחת לשחלות, כדי לשחרר את כל הרחם, ומניחים על צלחת פטרי.
לאחר מכן, כסו את הרחם ב-PBS, והפרידו את שתי קרני הרחם על ידי חיתוך הקצה הפרוקסימלי משני צידי צוואר הרחם. לאחר מכן הפרד כל צינור ביצית מהרחם על ידי חיתוך מתחת למיצר המחבר ביניהם. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במזרק של מ"ל אחד עם מחט תת-עורית כדי לשטוף את הבלסטוציסטים מהרחם לתוך מדיום מניפולציה, על ידי דחיפה של 0.5-1 מ"ל של מדיום דרך כל קרן מפתח צוואר הרחם.
אפשר עד דקה עד שתי דקות עד שהבלסטוציסטים ישקעו לתחתית הכלי לאחר השטיפה. לאחר מכן אתר את הבלסטוציסטים, ובעזרת פיפטת פסטור זכוכית מבוקרת פה עם קצה נימי, אסוף את הבלסטוציסטים והעביר לטיפה טרייה של מדיום. לאחר שטיפת הבלסטוציסטים, הסר את ה-zona pellucida על ידי שימוש בתמיסת טירוד חומצית כדי לשטוף את העוברים לזמן קצר.
ברגע שהזונה כבר לא נראית לעין, העבירו את הבלסטוציסטים בחזרה למדיום המניפולציה. שטפו את הבלסטוציסטים ב-PBS בטמפרטורת החדר, וקבעו אותם על ידי העברה ל-4% PFA ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, העבירו את הבלסטוציסטים בחזרה ל-PBS לאחסון בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר ביצוע אימונופלורסנציה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה עדינה בפה כדי להכין מיקרו-טיפות של PBS או תמיסת כתמים גרעיניים על משטח הזכוכית של צלחת זכוכית 35 מ"מ, וכסה אותן בשמן מינרלי. מניחים את העוברים במיקרו-טיפות ומסדרים בצורה עקבית, רצוי עם גישה לחלל ICM במקביל למשטח הזכוכית, ואז מניחים את הכלי על מחזיק המיקרוסקופ. כדי לבצע דמיון קונפוקלי, השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר המספקת יחס אות לרעש חזק מבלי להלבין את הפלואורופורים.
התאם את ערכת הרווח והכיבוי כדי להשיג את הטווח הדינמי הרחב ביותר מבלי לחשוף יתר על המידה את הדגימה. לכידת רוב או כל טווח גווני האפור תקל על זיהוי הבדלים קטנים בעוצמה בין תמונות. עקוב אחר הפרטים הנוספים המתוארים בפרוטוקול הטקסט כדי לדמות עוברים לאורך כל ציר Z.
עקוב אחר ממשק המשתמש הגרפי של כלי הפילוח מבוסס MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation, או MINS, כדי לטעון תמונה קונפוקלית או ערימת Z שלמה של נתונים גולמיים שנוצרו על ידי המיקרוסקופ. כדי להציג את התוצאה של כל שלב, לחץ על כפתור התצוגה המתאים. תג צהוב מעל הלחצן מציין את הפעולה בתהליך.
תג ירוק מציין שהפעולה הושלמה. הערך את התוצאה של שלב הזיהוי לפני שתמשיך לסגמנטציה. אם הוא אינו משביע רצון, שנה את פרמטרי הזיהוי והפעל אותו מחדש.
מתפריט ההפעלה של מצב אצווה, לחץ על הוסף קבצים"וטען את כל הקבצים לעיבוד בבת אחת. נקישה התחל הפעלת מצב אצווה "ואפשר זמן לתוכנה לעבד את הקבצים. פלט הפילוח יישמר באותה ספרייה כמו הקבצים המקוריים.
זהה תוצאות חיוביות כוזבות כגון שלפוחיות אפופטוטיות או אלמנטים אחרים שאינם גרעינים שלמים אך ייתכן שזוהו ככאלה על ידי MINS. מחק את הרשומות המתאימות עבור תוצאות חיוביות מוטעות מסטטיסטיקת הכוכבים. csv.
שמור את קובץ starstatistics. csv המקורי לעיון עתידי וערוך רק עותק שלו. אם גרעין מפולח יתר על המידה והוצג כשני גרעינים או יותר, מזג את הרשומות על ידי ממוצע רמת העוצמה שלהן, או שמור את אחת הרשומות עבור אותו תא והשליך את השאר.
כדי לפתור תחת סגמנטציה, זהה אירועים שבהם MINS לא הצליח לזהות את הגבול בין שני גרעינים או יותר ופילח אותם כאחד, או שבהם הוא לא הצליח לזהות גרעין לחלוטין. השתמשו ב- ImageJ למדידת רמת האפור הממוצעת של כל אחד מהערוצים בתאים התחתונים או הלא מקוטעים. לאחר מכן, מצא חתך מדיאלי של הגרעין התחתון או הלא מפולח בתעלת ה-DNA, באמצעות כלי הבחירה ביד חופשית, מתאר את היקף הגרעין התחתון או הלא מפולח.
לאחר מכן, לחץ על Control M"או עבור לתפריט ניתוח" ובחר מדוד"זה ירשום את הערך האפור הממוצע עבור האזור המתואר ויציג אותו בחלון חדש. באמצעות אותו אזור מתואר שנבחר זה עתה בתעלת ה-DNA, חזור על המדידה של כל אחד מערוצי הקרינה המעניינים. התוצאות יהפכו לקודמות בחלון תוצאות המדידות.
לאחר מכן השתמש במידות שהתקבלו כדי להחליף את הרשומות השגויות בקובץ starstatistics. csv. אם הגרעין עבר תת-פלח שכפל את השורה שלו, הקצה מזהי תאים שונים לכל תא חדש והצג את הערכים שהתקבלו ב-ImageJ תחת העמודה המתאימה.
במקרה זה, שני התאים יחלקו קואורדינטות מרחביות. כאשר יש לשקול גרעינים מיטוטיים בנפרד בניתוח, ציין אותם ידנית והוסף את המידע לקובץ הנתונים. עיין בפרוטוקול הטקסט לקבלת הוראות נוספות לעיבוד תמונה.
איור זה מציג דוגמאות של בלסטוציסטים שלמים בשלבים שונים עם חלל מורחב. מוצגות כאן דוגמאות לנוגדנים טובים למספר חלבונים גרעיניים, כולל CDX2, GATA4, GATA6, NANOG ו-OCT4. דגימה זו סומנה עם החלבון הציטופלזמי DAB2 שנותן יחס אות לרעש גבוה.
בפאנל זה מוצגות דוגמאות לצביעה גרועה עבור GATA4 עם יחס אות לרעש נמוך, כאשר הדגימות תוקנו למשך 10 דקות בלבד. נוגדן אנטי-GATA4 הספציפי הזה דורש קיבוע בן לילה כדי לספק אות חזק. עוברים אלה צולמו עם יעד טבילה בשמן פי 40 עם NA של 1.30 ומרחק עבודה של 0.21 מ"מ הלוחות האמצעיים מראים הגדלות של ה-ICMs או הגרעינים הבודדים וניתן להבחין בגבול ביניהם.
הלוחות התחתונים ממחישים כיצד ככל שהעובר מתקדם יותר, כך הצפיפות הגרעינית גבוהה יותר, וכך גדל הסיכוי לטעויות סגמנטציה. תמונות אלה מציגות שגיאות ש-MINS יכולה לבצע, כגון זיהוי גרעינים אפופטוטיים כתאים חיים, סגמנטציית יתר או תת-סגמנטציה. רצף זה של פרוסות Z חושף אירוע תת-סגמנטציה, שבו שני תאים זוהו כאחד.
לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך שלושה עד ארבעה ימים מתחילתו ועד סופו, עם עומס זמן של שעתיים עד ארבע שעות ביום. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות עקביים מאוד עם תנאי הניסוי, כלומר פרוטוקולים אימונו-פלואורסצנטיים ופרמטרים של הדמיה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית של עכברים לבצע ניתוח כמותי באתרו של ביטוי גנים וחלבונים בתאים בודדים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד לרכוש נתוני תמונה המתאימים לניתוח ביטוי כמותי באתר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה לביצוע ניתוח כמותי של ביטוי חלבונים ברמה של תא בודד in situ, במטרה לחקור את קביעת השושלת (lineage specification) בעוברים של עכברים בשלב טרום ההשתבצות. השיטה מאפשרת ניתוח של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה של תא בודד בתפוקה גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של התא
רקע
- כימות רמות חלבונים in situ הוא קריטי להבנת ההתפתחות העוברית.
- רזולוציה של תא בודד מסייעת בחקר הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית היא כלי רב עוצמה לדימוג מבנים תאיים.
- שיטה זו ישימה לעוברים של עכברים בשלב טרום-השתבצות.
מטרת המחקר
- לכימות ריכוזי חלבונים בעוברי עכבר בשלב טרום ההשרמה.
- לניתוח של קביעת שורת הדור (lineage specification) במהלך ההתפתחות המוקדמת.
- לשיפור ההבנה של ההטרוגניות התאית ברקמות עובריות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף בלאסטוציסטים מעכברים בהריון.
- זיהוי אימונופלואורסצנטי של חלבונים בשיטת whole-mount.
- דימוי של דגימות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית.
- סגמנטציה גרעינית וניתוח תמונה לצורך כימות.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של רמות חלבון ברזולוציה של תא בודד.
- זיהוי דפוסי ביטוי של חלבונים בעוברי שלב טרום-השתבצות.
- תובנות לגבי קביעת שושלות תאים במהלך ההתפתחות המוקדמת.
- הדגמה של יכולות סריקה בתפוקה גבוהה (high-throughput) של השיטה.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חסונה לבדיקת ביטוי חלבונים בעוברים.
- היא מקלה על הבנת תהליכי התפתחות ברמה התאית.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול עבור חלבונים שונים הנמצאים במוקד המחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
ניתוח כמותי של ביטוי חלבונים ברמה התאית בעוברים שלפני השתבצות מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של היפותזות הנוגעות לקביעת שורת הדם (lineage specification). גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי אספקת נתונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית של סמנים גרעיניים הקריטיים למסלולי התפתחות מוקדמים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי קישור בין הטרוגניות מולקולרית להחלטות לגבי גורל התא.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של סממנים גרעיניים מרובים והקואורדינטות המרחביות שלהם בעוברים שלמים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת דפוסי ביטוי של חלבונים הקשורים לאירועי הגדרת שושלת תאים.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח באמצעות יצירת נתונים בעלות רזולוציה גבוהה וניתנים לשחזור על מעורבות מטרות במערכות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: יצירת מערכות ביולוגיות מתוקפות עם קריאות פלואורסצנציה גרעינית כמותיות לסריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- שחזוריות: מאפשרת תהליכי דימיון וסגמנטציה סטנדרטיים המפחיתים שונות בדגימות בעלות צפיפות גרעינית גבוהה.
- מדרגיות: תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מושבות של תאי גזע עובריים, תרביות המבדילות עצמן ועוברי מינים שונים עם התאמה מינימלית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין דינמיקת ביטוי חלבונים בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות פנוטיפיקה מרחבית וכמותית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מפחיתה עמימות במודלים של מחויבות שושלת תאים על ידי פתרון הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים ברזולוציה של תא בודד.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת בסיס להחלטות go/no-go באמצעות קביעת ספים אובייקטיביים לביטוי משותף של חלבונים ומיקומם במסלולים התפתחותיים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת כימות של ביטוי חלבונים המונחה על ידי השערות, עוד לפני מאמצים לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובתיקוף יעדים באמצעות סגמנטציה גרעינית לא-מפוקחת וכמותיות פלואורסצנציה רב-ערוצית.
- סריקה: מספקת פלטים סטנדרטיים ומוכנים לבדיקה, המתאימים להערכת השפעות של תרכובות על רשתות ביטוי חלבונים עובריים.
- אנליטיקה: מייצרת קואורדינאטות מרחביות (XYZ) ורמות פלואורסצנציה גרעינית לכל ערוץ, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית של מצבי ביטוי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: תואם לגילוי סממנים ביולוגיים על ידי קישור דפוסי ביטוי חלבונים לקביעת שושלת במודלים התפתחותיים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת דימוי ואנליזה הניתנת לשימוש חוזר לחקר הגתרוגניות תאית במערכות פרה-קליניות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהחלטות שורות תאיות מוקדמות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות סגמנטציה אוטומטית וקלט משתמש מינימלי באמצעות תוכנת MINS.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי כך שמאפשר הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות המעורבות במסלולים התפתחותיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות נתוני ביטוי חלבונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית, אימונופלואורסצנציה ותוכנות לסגמנטציה גרעינית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים קונפוקליים עם סריקת לייזר ובכלי MINS מבוסס MATLAB לניתוח תמונות בתלת-ממד.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי קיבוע, צביעה והדמיה כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה לצפיפות גרעינית משתנה וליחסי אות-רעש שונים במערכות מודל שונות.
- מוגבל על ידי זמינות הדגימות והצורך באופטימיזציה בעת יישום על מטרות שאינן עובריות או בעלות שכיחות נמוכה.
