ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים
February 22nd, 2016
פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת את רמות החלבון באתרן בעוברים טרום השרשה של עכברים. אז שיטה זו מאפשרת לנו לבצע ניתוח תפוקה גבוהה של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה של תא בודד בצורה חצי אוטומטית. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לכמת ריכוזי חלבון בתמונות קונפוקליות בהן יש צפיפות גרעינית גבוהה וכאשר רוצים לחקור הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים.
כדי להתחיל, השתמש בלהבה פתוחה על פיפטת פסטור מזכוכית כדי לצייר קצה נימי בקצה. שפשפו בעדינות את הקצה הרחוק של הפיפטה על הנימים, כדי לשבור אותו תוך יצירת קצה קהה. לאחר הקרבת עכברה בהריון ביום ההתפתחות העוברי הרצוי, יש לחשוף את קרבי הבטן לפי פרוטוקול הטקסט ולאתר את הרחם.
החזיקו את קצה צוואר הרחם, חתכו את צוואר הרחם ומשכו בעדינות כלפי מעלה כדי למתוח את שתי קרני הרחם. חתוך ממנו את השומן, הקפד לא לנקב את דופן הרחם. חותכים מעל הביציות, מתחת לשחלות, כדי לשחרר את כל הרחם, ומניחים על צלחת פטרי.
לאחר מכן, כסו את הרחם ב-PBS, והפרידו את שתי קרני הרחם על ידי חיתוך הקצה הפרוקסימלי משני צידי צוואר הרחם. לאחר מכן הפרד כל צינור ביצית מהרחם על ידי חיתוך מתחת למיצר המחבר ביניהם. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במזרק של מ"ל אחד עם מחט תת-עורית כדי לשטוף את הבלסטוציסטים מהרחם לתוך מדיום מניפולציה, על ידי דחיפה של 0.5-1 מ"ל של מדיום דרך כל קרן מפתח צוואר הרחם.
אפשר עד דקה עד שתי דקות עד שהבלסטוציסטים ישקעו לתחתית הכלי לאחר השטיפה. לאחר מכן אתר את הבלסטוציסטים, ובעזרת פיפטת פסטור זכוכית מבוקרת פה עם קצה נימי, אסוף את הבלסטוציסטים והעביר לטיפה טרייה של מדיום. לאחר שטיפת הבלסטוציסטים, הסר את ה-zona pellucida על ידי שימוש בתמיסת טירוד חומצית כדי לשטוף את העוברים לזמן קצר.
ברגע שהזונה כבר לא נראית לעין, העבירו את הבלסטוציסטים בחזרה למדיום המניפולציה. שטפו את הבלסטוציסטים ב-PBS בטמפרטורת החדר, וקבעו אותם על ידי העברה ל-4% PFA ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, העבירו את הבלסטוציסטים בחזרה ל-PBS לאחסון בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר ביצוע אימונופלורסנציה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה עדינה בפה כדי להכין מיקרו-טיפות של PBS או תמיסת כתמים גרעיניים על משטח הזכוכית של צלחת זכוכית 35 מ"מ, וכסה אותן בשמן מינרלי. מניחים את העוברים במיקרו-טיפות ומסדרים בצורה עקבית, רצוי עם גישה לחלל ICM במקביל למשטח הזכוכית, ואז מניחים את הכלי על מחזיק המיקרוסקופ. כדי לבצע דמיון קונפוקלי, השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר המספקת יחס אות לרעש חזק מבלי להלבין את הפלואורופורים.
התאם את ערכת הרווח והכיבוי כדי להשיג את הטווח הדינמי הרחב ביותר מבלי לחשוף יתר על המידה את הדגימה. לכידת רוב או כל טווח גווני האפור תקל על זיהוי הבדלים קטנים בעוצמה בין תמונות. עקוב אחר הפרטים הנוספים המתוארים בפרוטוקול הטקסט כדי לדמות עוברים לאורך כל ציר Z.
עקוב אחר ממשק המשתמש הגרפי של כלי הפילוח מבוסס MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation, או MINS, כדי לטעון תמונה קונפוקלית או ערימת Z שלמה של נתונים גולמיים שנוצרו על ידי המיקרוסקופ. כדי להציג את התוצאה של כל שלב, לחץ על כפתור התצוגה המתאים. תג צהוב מעל הלחצן מציין את הפעולה בתהליך.
תג ירוק מציין שהפעולה הושלמה. הערך את התוצאה של שלב הזיהוי לפני שתמשיך לסגמנטציה. אם הוא אינו משביע רצון, שנה את פרמטרי הזיהוי והפעל אותו מחדש.
מתפריט ההפעלה של מצב אצווה, לחץ על הוסף קבצים"וטען את כל הקבצים לעיבוד בבת אחת. נקישה התחל הפעלת מצב אצווה "ואפשר זמן לתוכנה לעבד את הקבצים. פלט הפילוח יישמר באותה ספרייה כמו הקבצים המקוריים.
זהה תוצאות חיוביות כוזבות כגון שלפוחיות אפופטוטיות או אלמנטים אחרים שאינם גרעינים שלמים אך ייתכן שזוהו ככאלה על ידי MINS. מחק את הרשומות המתאימות עבור תוצאות חיוביות מוטעות מסטטיסטיקת הכוכבים. csv.
שמור את קובץ starstatistics. csv המקורי לעיון עתידי וערוך רק עותק שלו. אם גרעין מפולח יתר על המידה והוצג כשני גרעינים או יותר, מזג את הרשומות על ידי ממוצע רמת העוצמה שלהן, או שמור את אחת הרשומות עבור אותו תא והשליך את השאר.
כדי לפתור תחת סגמנטציה, זהה אירועים שבהם MINS לא הצליח לזהות את הגבול בין שני גרעינים או יותר ופילח אותם כאחד, או שבהם הוא לא הצליח לזהות גרעין לחלוטין. השתמשו ב- ImageJ למדידת רמת האפור הממוצעת של כל אחד מהערוצים בתאים התחתונים או הלא מקוטעים. לאחר מכן, מצא חתך מדיאלי של הגרעין התחתון או הלא מפולח בתעלת ה-DNA, באמצעות כלי הבחירה ביד חופשית, מתאר את היקף הגרעין התחתון או הלא מפולח.
לאחר מכן, לחץ על Control M"או עבור לתפריט ניתוח" ובחר מדוד"זה ירשום את הערך האפור הממוצע עבור האזור המתואר ויציג אותו בחלון חדש. באמצעות אותו אזור מתואר שנבחר זה עתה בתעלת ה-DNA, חזור על המדידה של כל אחד מערוצי הקרינה המעניינים. התוצאות יהפכו לקודמות בחלון תוצאות המדידות.
לאחר מכן השתמש במידות שהתקבלו כדי להחליף את הרשומות השגויות בקובץ starstatistics. csv. אם הגרעין עבר תת-פלח שכפל את השורה שלו, הקצה מזהי תאים שונים לכל תא חדש והצג את הערכים שהתקבלו ב-ImageJ תחת העמודה המתאימה.
במקרה זה, שני התאים יחלקו קואורדינטות מרחביות. כאשר יש לשקול גרעינים מיטוטיים בנפרד בניתוח, ציין אותם ידנית והוסף את המידע לקובץ הנתונים. עיין בפרוטוקול הטקסט לקבלת הוראות נוספות לעיבוד תמונה.
איור זה מציג דוגמאות של בלסטוציסטים שלמים בשלבים שונים עם חלל מורחב. מוצגות כאן דוגמאות לנוגדנים טובים למספר חלבונים גרעיניים, כולל CDX2, GATA4, GATA6, NANOG ו-OCT4. דגימה זו סומנה עם החלבון הציטופלזמי DAB2 שנותן יחס אות לרעש גבוה.
בפאנל זה מוצגות דוגמאות לצביעה גרועה עבור GATA4 עם יחס אות לרעש נמוך, כאשר הדגימות תוקנו למשך 10 דקות בלבד. נוגדן אנטי-GATA4 הספציפי הזה דורש קיבוע בן לילה כדי לספק אות חזק. עוברים אלה צולמו עם יעד טבילה בשמן פי 40 עם NA של 1.30 ומרחק עבודה של 0.21 מ"מ הלוחות האמצעיים מראים הגדלות של ה-ICMs או הגרעינים הבודדים וניתן להבחין בגבול ביניהם.
הלוחות התחתונים ממחישים כיצד ככל שהעובר מתקדם יותר, כך הצפיפות הגרעינית גבוהה יותר, וכך גדל הסיכוי לטעויות סגמנטציה. תמונות אלה מציגות שגיאות ש-MINS יכולה לבצע, כגון זיהוי גרעינים אפופטוטיים כתאים חיים, סגמנטציית יתר או תת-סגמנטציה. רצף זה של פרוסות Z חושף אירוע תת-סגמנטציה, שבו שני תאים זוהו כאחד.
לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך שלושה עד ארבעה ימים מתחילתו ועד סופו, עם עומס זמן של שעתיים עד ארבע שעות ביום. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות עקביים מאוד עם תנאי הניסוי, כלומר פרוטוקולים אימונו-פלואורסצנטיים ופרמטרים של הדמיה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית של עכברים לבצע ניתוח כמותי באתרו של ביטוי גנים וחלבונים בתאים בודדים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד לרכוש נתוני תמונה המתאימים לניתוח ביטוי כמותי באתר.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה לביצוע ניתוח כמותי, בודד-תאים, in situ, של ביטוי חלבון לחקר ייעוד שושלת בעובר עכבר לפני השתלה. השיטה מאפשרת ניתוח בעל תפוקה גבוהה של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה של תא בודד.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה תאית
רקע
- כימות רמות חלבון in situ הוא קריטי להבנת התפתחות עוברית.
- רזולוציה של תא בודד מסייעת בחקר הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית היא כלי רב עוצמה להדמיית מבנים תאיים.
- שיטה זו ישימה לעובר עכבר לפני השתלה.
מטרת המחקר
- כימות ריכוזי חלבון בעובר עכבר לפני השתלה.
- ניתוח ייעוד שושלת במהלך ההתפתחות המוקדמת.
- שיפור הבנת ההטרוגניות התאית ברקמות עובריות.
שיטות ששימשו
- איסוף בלסטוציסטים מעכברות בהריון.
- זיהוי אימונופלואורוסצנטי של חלבונים בהרכבה מלאה.
- הדמיית דגימות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- חלוקת גרעין ותיקון תמונה לצורך כימות.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של רמות חלבון ברזולוציה של תא בודד.
- זיהוי דפוסי ביטוי חלבונים בעובר לפני השתלה.
- תובנות לגבי ייעוד שושלת במהלך ההתפתחות המוקדמת.
- הדגמה של יכולות תפוקה גבוהה של השיטה.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חזקה לחקר ביטוי חלבונים בעובר.
- היא מאפשרת הבנת תהליכי התפתחות ברמה התאית.
- הפרוטוקול יכול להתאים לחלבונים שונים של עניין.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative single-cell protein expression analysis in preimplantation embryos enables mechanistic de-risking of lineage specification hypotheses. This approach supports target validation by providing spatially resolved, quantitative data on nuclear markers critical for early developmental pathways. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking molecular heterogeneity to cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitation of multiple nuclear markers and their spatial coordinates in intact embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein expression patterns associated with lineage specification events.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating high-resolution, reproducible data on target engagement in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems with quantitative nuclear fluorescence readouts for downstream compound screening.
- Reproducibility: Enables standardized imaging and segmentation workflows that reduce variability in high nuclear density samples.
- Scalability: Supports platform reuse across embryonic stem cell colonies, differentiating cultures, and cross-species embryos with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression dynamics to preclinical validation through spatial and quantitative phenotyping.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in lineage commitment models by resolving heterogeneities within cell populations at single-cell resolution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing objective thresholds for protein co-expression and localization in developmental pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven quantification of protein expression prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through unsupervised nuclear segmentation and multi-channel fluorescence quantification.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs suitable for evaluating compound effects on embryonic protein expression networks.
- Analytics: Generates spatial (XYZ) coordinates and nuclear fluorescence levels per channel, enabling statistical comparison of expression states across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by linking protein expression patterns to lineage specification in disease-relevant developmental models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging and analysis capability for studying cellular heterogeneity in diverse preclinical systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in early lineage decisions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated segmentation and minimal user input via MINS software.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in developmental pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, spatially resolved protein expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, immunofluorescence, and nuclear segmentation software.
- Depends on access to laser scanning confocal microscopes and MATLAB-based MINS tool for 3D image analysis.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, staining, and imaging protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for varying nuclear density and signal-to-noise ratios across model systems.
- Limited by sample availability and the need for optimization when applying to non-embryonic or low-abundance targets.
