Name: ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: למד ניתוח כמותי של ביטוי חלבון in situ בעוברי עכבר preimplantation לחקר מפרט Lineage. השיטה מאפשרת ניתוח high-throughput בתמונות מיקרוסקופ קונפוקל ברזולוציית תא בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לסטפנו די טליה, אלברטו פוליאפיטו, ונקטרמן סשאן ופנאגיוטיס קסנופולוס, על המשוב על הטיפול בנתונים, ניתוח וייצוג, לברניקה פלוסה על הסיוע בתכנון פרוטוקול האימונופלואורסצנטי ובדיקת הנוגדנים ולחברי מעבדת Hadjantonakis על ההערות על כתב היד ועל פיתוח פרוטוקול זה. העבודה במעבדה שלנו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01-HD052115 ו-R01-DK084391, ועל ידי NYSTEM N13G-236.

<ol><li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li>
<li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+a+blastocyst%3A+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li>
<li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+get+together%3A+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2015).</li>
<li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+2D%2F3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li>
<li>Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li>
<li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li>
<li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li>
<li>Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).</li>
<li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li>
<li>Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li>
<li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li>
<li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li>
<li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li>
<li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li>
<li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li>
<li>Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li>
<li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%3A+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li>
<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
<li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%2C+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li>
<li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+RR+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).</li>
<li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial%3A+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li>
<li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1%2C+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li>
<li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבצע ניתוח כמותי של immunofluorescence כל הר על עוברי עכברים בשלב preimplantation. פרוטוקול immunofluorescence חזק 22 ואחריו ברזולוציה גבוהה, כל הר הדמית confocal ועל ידי פילוח תמונה באמצעות פיסת מחויטת של תוכנת 4. בעוד הבחירה של פרוטוקול immunofluorescence אינה קריטית, אנו מוצאים את אחד המוצג כאן 22 להיות מהיר, אמין ולספק אות יציבה עבור רבים של הנוגדנים בדקנו. פרוטוקולים אחרים עשויים להיות מלווה, ובלבד בקשתם עקבית לאורך ...

עובר preimplantation העכבר הוא פרדיגמה ללמוד את הופעתה ותחזוקה של pluripotency in vivo, כמו גם מודל לחקר מפרט גורל תא דה נובו epithelialization ביונקים. שלבי preimplantation של פיתוח יונקים מוקדשים הקמת שלוש שושלות התאים שמרכיבים את הבלסטוציסט, כלומר epiblast פלוריפוטנטיים - אשר מוליד את רוב הרקמות סומטיים בתאים ניבט - ושתי שושלות extraembryonic, את trophectoderm (TE) ואת endoderm פרימיטיבי (PRE) (איור 1 א) 1,2. פרוטוקול זה מתאר את הנהלים (1) הקציר ולתקן עוברי עכברים בשלב preimplantation, (2) לבצע immunofluorescence לתייג חלבונים בעלי עניין, (3) לבצע כל הר הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם יכולות חתך-z ו- (4) לבצע פילוח הגרעין של תמונות confocal ומנתח תמונה כמותית שלאחר מכן. צינור זה מאפשר tהוא משוחד מדידת רמות החלבון בגין המחאת זהויות תא לאפיין תת-אוכלוסיות של תאים באתרו. פרוטוקול זה יכול להתבצע בתוך זמן קצר של 3 - 4 ימים עבור המלטה אחת (בדרך כלל עד 10 עוברי עכברים), מאוסף העובר בניתוח הנתונים (איור 1B). הניתוח סימולטני של המלטות כמה יגדיל את ניתוח ההדמיה ונתונים נטלו הזמן, ובכך להאריך את אורכו הכולל של פרוטוקול. עובר העכבר הבמה preimplantation הוא מערכת צייתנית באופן ניסיוני אשר, בהינתן גודלו הקטן וסטריאוטיפית מורפולוגיה 3, הוא גם מתאים בתחום הדמית טוטו של תהליכים תאיים עם רזולוצית תא בודד. כדי לבצע ניתוח משוחד, מערכות ברמה של מספר סטטיסטית הרלוונטי של עוברים, אוטומטית, צינור ניתוח כמוני רצוי. עם זאת, בשל צפיפות גרעיני גבוה של מסת התאים הפנימית (ICM) של הבלסטוציסט ( <stרונג&gt; האיור 1A, 2D), פלטפורמות פילוח תמונה מקובלת אינו מספק מספיק דיוק להקים זרימת עבודה אוטומטי או חצי אוטומטי. מצד שני, פילוח ידני, בעוד מדויק, אינו מאפשר העיבוד של קבוצות גדולות של תאי עוברים, וגם לא מתאים להגדרה לשחזור, משוחדת של זהויות תא - שהוא קריטי במיוחד כאשר לומד שלבי התפתחות, שהדפוסים של סמן ביטוי לא נפתר במלואה (למשל, אינה מציג חלוקה בינארית פני אוכלוסייה). פתחנו לאחרונה ומאומתים שיטת פילוח תמונה מותאמת בעוברי העכבר preimplantation ועבור תאי גזע עובריים בעכבר (ESCs) המשיג דיוק גבוה, תוך דורשי השקעת משתמש מינימאלי 4-8. צינור הניתוח שמובא כאן סובב סביב כלי הפילוח המבוסס תמונת MATLAB הפילוח הגרעיני האינטרקטיווי מודולרי (דקות) 4. MINS performs פילוח גרעיני ללא פיקוח על קבוצות גדולות של ערימות-Z confocal לאחר שמשתמש קימת מספר מינימאלי של מאפייני תמונה, באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) (טבלה 1) 4. צינור זה הוכיח עצמו יעיל עבור דור של נתוני העברת נתונים גבוהים על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא סוג שני בר, מטופלים בניסוי וגנטי עוברת משונה ESCs 5-7. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את היישום של דקות עד פילוח תמונות העובר preimplantation הבמה. לדוגמאות של ביצועים MINS על ESCs עיין 4,7. הצעד פילוח גרעיני אוטומטי מפחית באופן משמעותי את נטל הזמן של תהליך זיהוי התא, ואילו מדידות עוצמת מרחבית הקרינה לאפשר קביעה משוחדת של זהויות התא לבין הדור של מפות תלת-ממדיות של תחומים ביטוי גנים בעמדה תא בעובר (איור 1C </strong&gt;). יתר על כן, את יכולת ההרחבה של זרימת העבודה זו עושה את זה החלות על הניתוח של המלטות פרט באמצעות קבוצות גדולות של עוברי מטופלים באופן ניסיוני, או עוברי של רקע גנטי שונה 5,6. MINS זמין באופן חופשי http://katlab-tools.org (התוכנה דורשת רישיון MATLAB). אין גישה שפותחה עד היום מאפשר הדור של נתונים מעמיקים כזה על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא עוברי preimplantation העכבר. כל הניסיונות עד כה ב לכימות סוגים אלה של נתונים הוגבלו על נחישות quantitation ידני של מספרים סלולריים עבור אוכלוסיות שונות בעובר (או לגמרי באופן ידני, או תוכנה בסיוע) 9-19. הגישה זו (שילוב תוכנה דקה) כבר מותאמת ונבדקה על עוברי preimplantation עכבר ESCs; זאת ביצועיו על מערכות אחרות עם צפיפות גבוהה גרעינית, למרות עדיין נבדק, צפויים להיות שווה ערך.

<table><tbody><tr><td><חזק>אוסף עוברים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בדיקה קהה לבדיקת תקע</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לניתוח</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר זכוכית</td><td>פישר</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>צינור שואב מורכב מראש & שופר</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>צינורות גומי ארוכים יותר</td><td>פישר</td><td>14-178-2AA&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה של חומצה טירוד</td><td>Millipore</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 4 בארות</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אימונופלואורסצנטי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 בארות U-bottom צלחות</td><td>פישר</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>סיגמא</td><td>H0146</td><td></td></tr> <tr><td><חזק>נוגדנים ראשוניים</חזקים></td><td></td><td></td><td><חזק>ריכוז</חזק></td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R& D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-9053</td><td>1:100, קיבוע 10 דקות</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-1237</td><td>1:100, קיבוע O/N</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-5279</td><td>1:100, 10 דקות לקיבוע O/N</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>שונות</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td><חזק>הדמיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ כלי זכוכית עם תחתית זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחשב עם מערכת הפעלה</td><td></td> Windows 64 סיביות <td>n/a</td><td>ודא דרישות מערכת מינימליות ב-http://katlab-tools.org וב-Lou et al., (2014) דוחות תאי גזע</td></tr><tr><td>MATLAB (תוכנה)</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS (תוכנה)</td><td>חינם</td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט lineage עכבר preimplantation עוברים

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע כמוני, תא בודד באתרו מנתח של ביטוי חלבון ללמוד מפרט שושלת בעוברי preimplantation עכבר. הנהלים הדרושים אוסף העובר, immunofluorescence, הדמיה על מיקרוסקופ confocal, ופילוח תמונה וניתוח מתוארים. שיטה זו מאפשר לכמת את הביטוי של סמנים גרעיניים מרובים ואת מרחבית (XYZ) קואורדינטות של כל תאים בעובר. הוא מנצל MINS, כלי תוכנה פילוח תמונה שפותחו במיוחד עבור ניתוח של תמונות confocal של עוברים preimplantation ואת תאי גזע עובריים מושבות (ESC). MINS מבצעת פילוח גרעיני ללא פיקוח ברחבי ממדי X, Y ו- Z, ומייצרת מידע על מצבת תא בחלל תלת ממדים, כמו גם רמות קרינה גרעינית עבור כל ערוצים עם קלט משתמש מינימאלי. בעוד פרוטוקול זה בצורה מיטבית עבור הניתוח של תמונותשל עוברי עכברים בשלב preimplantation, זה יכול בקלות להיות מותאם הניתוח של כל דוגמאות אחרות מפגינות יחס אות לרעש טוב ואיפה צפיפות גרעינית גבוהה מציבה משוכה פילוח תמונה (לדוגמא., ניתוח ביטוי של תאי גזע עובריים (ESC מושבות), הבחנת תאים בתרבית, עוברים של מינים אחרים או בשלבים, וכו &#39;).

כדי להקל על נתונים לפרשנות מצגת, יש להיזהר שלא לפגוע בעוברים במהלך האיסוף והמניפולציה, כך שכל התאי ואת המיקום היחסי שלהם ניתן לנתח איור 2 א -. D מציגה דוגמאות של blastocysts השלם בשלבים שונים עם חלל מורחב. צריך לפגוע להתרחש, טיפול נוסף יש לנקוט בעת ניתוח ופירוש התוצאות. איכות ואמינות של הנתונים המופקים באמצעות פרוטוקול זה תלוי באיכ...

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת את רמות החלבון באתרן בעוברים טרום השרשה של עכברים. אז שיטה זו מאפשרת לנו לבצע ניתוח תפוקה גבוהה של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה של תא בודד בצורה חצי אוטומטית. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לכמת ריכוזי חלבון בתמונות קונפוקליות בהן יש צפיפות גרעינית גבוהה וכאשר רוצים לחקור הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים.כדי להתחיל, השתמש בלהבה פתוחה על פיפטת פסטור מזכוכית כדי לצייר קצה נימי בקצה. שפשפו בעדינות את הקצה הרחוק של הפיפטה על הנימים, כדי לשבור אותו תוך יצירת קצה קהה. לאחר הקרבת עכברה בהריון ביום ההתפתחות העוברי הרצוי, יש לחשוף את קרבי הבטן לפי פרוטוקול הטקסט ולאתר את הרחם.החזיקו את קצה צוואר הרחם, חתכו את צוואר הרחם ומשכו בעדינות כלפי מעלה כדי למתוח את שתי קרני הרחם. חתוך ממנו את השומן, הקפד לא לנקב את דופן הרחם. חותכים מעל הביציות, מתחת לשחלות, כדי לשחרר את כל הרחם, ומניחים על צלחת פטרי.לאחר מכן, כסו את הרחם ב-PBS, והפרידו את שתי קרני הרחם על ידי חיתוך הקצה הפרוקסימלי משני צידי צוואר הרחם. לאחר מכן הפרד כל צינור ביצית מהרחם על ידי חיתוך מתחת למיצר המחבר ביניהם. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במזרק של מ"ל אחד עם מחט תת-עורית כדי לשטוף את הבלסטוציסטים מהרחם לתוך מדיום מניפולציה, על ידי דחיפה של 0.5-1 מ"ל של מדיום דרך כל קרן מפתח צוואר הרחם.אפשר עד דקה עד שתי דקות עד שהבלסטוציסטים ישקעו לתחתית הכלי לאחר השטיפה. לאחר מכן אתר את הבלסטוציסטים, ובעזרת פיפטת פסטור זכוכית מבוקרת פה עם קצה נימי, אסוף את הבלסטוציסטים והעביר לטיפה טרייה של מדיום. לאחר שטיפת הבלסטוציסטים, הסר את ה-zona pellucida על ידי שימוש בתמיסת טירוד חומצית כדי לשטוף את העוברים לזמן קצר.ברגע שהזונה כבר לא נראית לעין, העבירו את הבלסטוציסטים בחזרה למדיום המניפולציה. שטפו את הבלסטוציסטים ב-PBS בטמפרטורת החדר, וקבעו אותם על ידי העברה ל-4% PFA ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, העבירו את הבלסטוציסטים בחזרה ל-PBS לאחסון בארבע מעלות צלזיוס.לאחר ביצוע אימונופלורסנציה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה עדינה בפה כדי להכין מיקרו-טיפות של PBS או תמיסת כתמים גרעיניים על משטח הזכוכית של צלחת זכוכית 35 מ"מ, וכסה אותן בשמן מינרלי. מניחים את העוברים במיקרו-טיפות ומסדרים בצורה עקבית, רצוי עם גישה לחלל ICM במקביל למשטח הזכוכית, ואז מניחים את הכלי על מחזיק המיקרוסקופ. כדי לבצע דמיון קונפוקלי, השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר המספקת יחס אות לרעש חזק מבלי להלבין את הפלואורופורים.התאם את ערכת הרווח והכיבוי כדי להשיג את הטווח הדינמי הרחב ביותר מבלי לחשוף יתר על המידה את הדגימה. לכידת רוב או כל טווח גווני האפור תקל על זיהוי הבדלים קטנים בעוצמה בין תמונות. עקוב אחר הפרטים הנוספים המתוארים בפרוטוקול הטקסט כדי לדמות עוברים לאורך כל ציר Z.עקוב אחר ממשק המשתמש הגרפי של כלי הפילוח מבוסס MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation, או MINS, כדי לטעון תמונה קונפוקלית או ערימת Z שלמה של נתונים גולמיים שנוצרו על ידי המיקרוסקופ. כדי להציג את התוצאה של כל שלב, לחץ על כפתור התצוגה המתאים. תג צהוב מעל הלחצן מציין את הפעולה בתהליך.תג ירוק מציין שהפעולה הושלמה. הערך את התוצאה של שלב הזיהוי לפני שתמשיך לסגמנטציה. אם הוא אינו משביע רצון, שנה את פרמטרי הזיהוי והפעל אותו מחדש.מתפריט ההפעלה של מצב אצווה, לחץ על הוסף קבצים"וטען את כל הקבצים לעיבוד בבת אחת. נקישה התחל הפעלת מצב אצווה "ואפשר זמן לתוכנה לעבד את הקבצים. פלט הפילוח יישמר באותה ספרייה כמו הקבצים המקוריים.זהה תוצאות חיוביות כוזבות כגון שלפוחיות אפופטוטיות או אלמנטים אחרים שאינם גרעינים שלמים אך ייתכן שזוהו ככאלה על ידי MINS. מחק את הרשומות המתאימות עבור תוצאות חיוביות מוטעות מסטטיסטיקת הכוכבים. csv.שמור את קובץ starstatistics. csv המקורי לעיון עתידי וערוך רק עותק שלו. אם גרעין מפולח יתר על המידה והוצג כשני גרעינים או יותר, מזג את הרשומות על ידי ממוצע רמת העוצמה שלהן, או שמור את אחת הרשומות עבור אותו תא והשליך את השאר.כדי לפתור תחת סגמנטציה, זהה אירועים שבהם MINS לא הצליח לזהות את הגבול בין שני גרעינים או יותר ופילח אותם כאחד, או שבהם הוא לא הצליח לזהות גרעין לחלוטין. השתמשו ב- ImageJ למדידת רמת האפור הממוצעת של כל אחד מהערוצים בתאים התחתונים או הלא מקוטעים. לאחר מכן, מצא חתך מדיאלי של הגרעין התחתון או הלא מפולח בתעלת ה-DNA, באמצעות כלי הבחירה ביד חופשית, מתאר את היקף הגרעין התחתון או הלא מפולח.לאחר מכן, לחץ על Control M"או עבור לתפריט ניתוח" ובחר מדוד"זה ירשום את הערך האפור הממוצע עבור האזור המתואר ויציג אותו בחלון חדש. באמצעות אותו אזור מתואר שנבחר זה עתה בתעלת ה-DNA, חזור על המדידה של כל אחד מערוצי הקרינה המעניינים. התוצאות יהפכו לקודמות בחלון תוצאות המדידות.לאחר מכן השתמש במידות שהתקבלו כדי להחליף את הרשומות השגויות בקובץ starstatistics. csv. אם הגרעין עבר תת-פלח שכפל את השורה שלו, הקצה מזהי תאים שונים לכל תא חדש והצג את הערכים שהתקבלו ב-ImageJ תחת העמודה המתאימה.במקרה זה, שני התאים יחלקו קואורדינטות מרחביות. כאשר יש לשקול גרעינים מיטוטיים בנפרד בניתוח, ציין אותם ידנית והוסף את המידע לקובץ הנתונים. עיין בפרוטוקול הטקסט לקבלת הוראות נוספות לעיבוד תמונה.איור זה מציג דוגמאות של בלסטוציסטים שלמים בשלבים שונים עם חלל מורחב. מוצגות כאן דוגמאות לנוגדנים טובים למספר חלבונים גרעיניים, כולל CDX2, GATA4, GATA6, NANOG ו-OCT4. דגימה זו סומנה עם החלבון הציטופלזמי DAB2 שנותן יחס אות לרעש גבוה.בפאנל זה מוצגות דוגמאות לצביעה גרועה עבור GATA4 עם יחס אות לרעש נמוך, כאשר הדגימות תוקנו למשך 10 דקות בלבד. נוגדן אנטי-GATA4 הספציפי הזה דורש קיבוע בן לילה כדי לספק אות חזק. עוברים אלה צולמו עם יעד טבילה בשמן פי 40 עם NA של 1.30 ומרחק עבודה של 0.21 מ"מ הלוחות האמצעיים מראים הגדלות של ה-ICMs או הגרעינים הבודדים וניתן להבחין בגבול ביניהם.הלוחות התחתונים ממחישים כיצד ככל שהעובר מתקדם יותר, כך הצפיפות הגרעינית גבוהה יותר, וכך גדל הסיכוי לטעויות סגמנטציה. תמונות אלה מציגות שגיאות ש-MINS יכולה לבצע, כגון זיהוי גרעינים אפופטוטיים כתאים חיים, סגמנטציית יתר או תת-סגמנטציה. רצף זה של פרוסות Z חושף אירוע תת-סגמנטציה, שבו שני תאים זוהו כאחד.לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך שלושה עד ארבעה ימים מתחילתו ועד סופו, עם עומס זמן של שעתיים עד ארבע שעות ביום. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות עקביים מאוד עם תנאי הניסוי, כלומר פרוטוקולים אימונו-פלואורסצנטיים ופרמטרים של הדמיה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית של עכברים לבצע ניתוח כמותי באתרו של ביטוי גנים וחלבונים בתאים בודדים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד לרכוש נתוני תמונה המתאימים לניתוח ביטוי כמותי באתר.

quantitative-analysis-protein-expression-to-study-lineage

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

ניתוח ביטוי החלבון במסתמי עכברים עובריים צעירים נפגע על ידי הרקמה המוגבלת הזמינה. כתב יד זה מספק פרוטוקול להכנת חלבון מאזורי שסתום עכבר עובריים מתפתחים לניתוח כתמים מערביים.

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

שעון הסגמנטציה מניע ביטוי גנים תנודתי על פני המזודרם הקדם-סומיטי (PSM). פעילות חריץ דינמית היא המפתח לתהליך זה. אנו משתמשים בהדמיה וניתוחים חישוביים כדי לחלץ דינמיקה זמנית מנתוני ביטוי מרחבי כדי להוכיח שביטוי ליגנד דלתא וקולטן Notch מתנדנד ב-PSM של בעלי חוליות.

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

שיטה זו מתארת בגישה לשחזור ועמיד עבור ההשוואה של רמות החלבון ברקמות שונות, timepoints התפתחותיים שונים באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי blotting בגישה.

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

אנו מתארים טכניקה לפרופיל microRNAs בעוברי עכבר מוקדם. פרוטוקול זה מתגבר על האתגר של קלט תאים נמוך והעשרת RNA קטנה. תוואי זה יכול לשמש כדי לנתח שינויים בביטוי miRNA לאורך זמן בנסיגות תאים שונים של עובר העכבר המוקדם.

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

כאן אנו מתארים אפיון פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסות של שושלות תאים עם גורלות רקמות ידועים בעובר בעל חוליות Xenopus laevis .

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

למד ניתוח כמותי של ביטוי חלבון in situ בעוברי עכבר preimplantation לחקר מפרט Lineage. השיטה מאפשרת ניתוח high-throughput בתמונות מיקרוסקופ קונפוקל ברזולוציית תא בודד.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

גלה סרטונים נוספים