בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאים חיסוניים ממוח העכבר האיסכמי לצורך כימות ואפיון פנוטיפי על ידי ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית. ניתוח דלקת פוסט-איסכמית במוח על ידי ציטומטריית זרימה רב-צבעונית מספק הבנה מעמיקה של התהליכים האימונולוגיים המעורבים בהתקדמות הנגע, תיקון והתוצאה הכוללת של השבץ. היתרון העיקרי של הליך זה הוא צנטריפוגת שיפוע צפיפות מהירה וצעד אחד, המאפשרת בידוד של מספר גבוה של תאי חיסון ברי קיימא ממוח העכבר האיסכמי.

היישום של טכניקה זו מכוון לזיהוי ואימות של אסטרטגיות טיפול אימונומודולטוריות חדשות שניתן ליישם בחלון זמן רחב יותר של השבץ. התחל בטבילה של קצה אחד של צינור משאבת זלוף פריסטלטי לתוך HBSS ללא סידן ומגנזיום קר כקרח. תקן מחט קהה בגודל 23 לקצה השני של הצינור.

והפעל את המשאבה כדי למלא לחלוטין את הצינור ב-HBSS. לאחר מכן, הניחו עכבר שעבר המתת חסד בגב על לוח חיתוך המוטבע במגש פלסטיק, והצמידו את הכפות הקדמיות והאחוריות, מתוחות ככל האפשר, עם מחטים בגודל 20. בעזרת זוג מלקחיים ישרים, אחד על שניים, כדי לתפוס את עור הבטן, בצע חתך רוחבי דרך המכלול ודופן הבטן עם מספריים חדים לקשתית כדי לחשוף את הכבד.

לאחר מכן הרם את עצם החזה והשתמש בלהב הקהה של זוג מספריים קהים של איריס כדי לחתוך את הסרעפת. המשיכו לחתוך את כלוב הצלעות הצדדי משני הצדדים בכיוון הזנב-גולגולתי, הקפידו לא לפגוע בעורקי הריאות, הלב ובית החזה, והשתמשו במלקחיים קהים כדי להתאים לדש העור. הצמד את הדש ללוח החיתוך והפרד בזהירות את הלב מרקמת החיבור.

החזק את הלב עם מלקחיים קהים, ואז הכנס את קצה המחט בגודל 23 בקצה צינור הזלוף לקודקוד החדר השמאלי, תוך הקפדה לא לפגוע במחיצה התוך חדרית. בעזרת מספריים חדים, חתכו את האטריום הימני והפעל מיד את המשאבה, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות בתוך השאיבה. כאשר הכבד הופך לצבע קפה בהיר, השתמש במספריים כירורגיות ישרות כדי לערוף את ראשו של העכבר ממש מאחורי הגולגולת.

לאחר מכן השתמש במספריים של הקשתית כדי לבצע חתך בקו האמצע בקרקפת. כאשר הגולגולת נראית לעין, הניחו קצה אחד של מספריים חדים של איריס לתוך הפורמן מגנום, ובצעו חתך רוחבי לתוך העצם. חזור על החתך בצד השני.

לאחר מכן השתמש במספריים חדים של איריס כדי לחתוך בזהירות מאותו חלל במעלה קו האמצע, לכיוון האף. בעזרת מלקחיים עדינים, יש לקלף בעדינות את עצמות הגולגולת מכל המיספרה במוח. לאחר מכן הרם את המוח בעזרת מרית, והשתמש במספריים חדים של קשתית כדי לנתח בזהירות את סיבי עצב הגולגולת המקבעים אותו לגולגולת.

הכנסת המוח לתוך צינור של 15 מיליליטר, המכיל 10 מיליליטר HBSS עם סידן ומגנזיום על קרח. כדי להפריד את רקמת המוח לתרחיף תא בודד, ראשית, השתמש בסכין גילוח נקי כדי להסיר בזהירות את גזע המוח והצרבולום. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח נקי נוסף כדי לחתוך את המוח למחצה, ולחתוך כל חצי כדור לאורך מישור העטרה לשלוש חתיכות בגודל שווה בערך.

בעזרת קצה הבוכנה של מזרק של חמישה מיליליטר, מועכים את חתיכות רקמת המוח דרך מסננת תאים של 100 מיקרון, שוטפים ברציפות את המסננת עם HBSS קר כקרח עם סידן ומגנזיום. לאחר מכן הניחו את הרקמות ההומוגניות על קרח. לאחר שכל הדגימות עובדו, סובבו את תרחיפי התאים והשליכו בזהירות את הסופרנטנטים.

השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר עיכול. לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים לצינור של שני מיליליטר ודגרו על התאים בסיבוב איטי ומתמשך ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שעה, מסננים את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון ושוטפים היטב את המסנן עם שלושה מיליליטר של מאגר כביסה המכיל DNase.

לאחר מכן שטפו את המסננת עם 15 מיליליטר של מאגר כביסה נטול DNase, סובבו את התאים והשליכו את הסופרנטנט. כדי להסיר את פסולת התא והמיאלין, השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של טמפרטורת החדר, מדיום שיפוע בצפיפות של 25% והעבירו את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר. מערבבים היטב את התאים בשיפוע עם פיפטינג עדין חוזר ונשנה.

ואז סובב את תמיסת התא. בתום ההפרדה, שאפו בזהירות את מעיל המיאלין והסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה והשעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מאגר שטיפה ללא DNase. העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר וסובבו אותם שוב, והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר כביסה קרה.

לאחר מכן ספרו את מספר התאים ברי הקיימא על ידי אי הכללה כחולה של טריפאן, ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס. לפני תחילת הצביעה החיסונית, דגרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם מגיב חוסם קולטן CD26/CD32 Fc נגד עכברים כדי למנוע כל קשירה לא ספציפית. לאחר מכן הוסיפו את הנוגדנים הראשוניים המצומדים בפלואורופור בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בשני מיליליטר של מאגר זרימה ציטומטרית. להסתובב. השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה, ואחסנו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד לניתוח זרימה ציטומטרית.

כדי לכמת את המספר המוחלט של תאי החיסון החודרים על ידי ספירת חרוזים, הפוך פיפט בדיוק 40 מיקרוליטר של זרימה ציטומטרית ו-10 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך צינור ספירה המכיל מספר ידוע של חרוזים פלואורסצנטיים. לאחר מכן, דגרו את תרחיף התא והחרוזים עם נוגדן CD45 המסומן על ידי FITC בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך ולאחר מכן מילוי הפוך של צינור הספירה עם 200 מיקרוליטר של מאגר זרימה ציטומטרית. לאחר מכן הפעל מיד את הדגימה על ציטומטר הזרימה, תיעוד החרוז ואירועי תאים חיוביים ל-CD45.

24 שעות לאחר חסימת עורק המוח האמצעי, ניתן לזהות את הלויקוציטים החודרים למוח על ידי ביטוי CD45 גבוה שלהם. בתוך האוכלוסייה הגבוהה CD45, הנויטרופילים הפולימורפו-גרעיניים מזוהים על ידי ביטוי LY-6G שלהם בעוד שלימפוציטים T מציגים פנוטיפ פני תא חיובי CD45 וחיובי ל-CD3. ניתן להבחין בין התאים הנותרים בעלי CD45 גבוה על ידי ביטוי CD19 ו-CD11b שלהם.

בעוד שניתן לסווג את המקטע החיובי ל-CD11b למונוציטים דלקתיים גבוהים ב-Ly-6C, ואוכלוסייה נמוכה ב-Ly-6C הכוללת את אוכלוסיות המונוציטים, המקרופאגים והתאים הדנדריטים. בשלב החריף של שבץ מוחי, נויטרופילים חיוביים ל-Ly-6G נכנסים למוח במהירות לאחר חסימת כלי הדם. לעומת זאת, השכיחות של תאי T חיוביים ל-CD3 בהמיספרה האיסכמית יורדת בהשוואה למוחות של ניתוחי דמה והמיספרה הנגדית.

בקרב האוכלוסייה החיובית ל-CD11b, איסכמיה מוחית מסיטה את האיזון לכיוון עליונות חזקה של מונוציטים דלקתיים גבוהים ב-Ly-6C. יתר על כן, ספירת הלויקוציטים הכוללת בחצי הכדור האוטם מוגברת משמעותית בהשוואה להמיספרה הנגדית ולמוח ניתוח דמה, 24 שעות לאחר חסימת עורק המוח האמצעי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאים חיסוניים מהמוח האיסכמי על ידי פיצול מכני, עיכול אנזימטי וצנטריפוגה של שיפוע צפיפות, וכיצד לאפיין תאים אלה על ידי ציטומטריית זרימה.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שתפוקת התאים הכוללת תלויה באופן קריטי בדיסוציאציה יסודית של רקמת המוח. יתר על כן, יש צורך בזלוף טרנס-קרדיאלי מספיק כדי למנוע זיהום של הלויקוציטים החודרים למוח בתאי חיסון לא דלקתיים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני ביטוי גנים או ניתוח פרופיל ציטוקינים כדי לקבל תובנות נוספות לגבי הרלוונטיות התפקודית של מורסה חיסונית מובהקת בהקשר של שבץ איסכמי.