פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח מודל בעלי חיים מבוסס וקטור ויראלי למחלת פרקינסון באמצעות הזרקה סטריאוטקטית במערכת העצבים המרכזית. ניתן להשתמש בשיטה זו לפיתוח מודלים נורמליים של בעלי חיים המאפשרים ניסויים פרה-קליניים בתרופות ויכולים להועיל בחקר המנגנון המולקולרי של מחלת פרקינסון כמו גם הפרעות ניווניות רבות אחרות. היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שהיא יכולה לשמש למיקוד ספציפי של אזורי מוח.

ניתן להשיג ביטוי מוחי גבוה ושניתן להשתמש בו ליצירת מודלים של בעלי חיים בזנים ומינים ספציפיים של בעלי חיים. פותחו מערכות הווקטור הסופיות השונות. הבחירה במערכת הווקטורית תלויה בגודל התעלה שאתה רוצה לבטא, משך ביטוי הגנים, הצלילים שאתה רוצה לכוון אליהם ובעיות בטיחות ביולוגית.

מי שתדגים את ההליך תהיה Annelies Aertgeerts, טכנאית מהמעבדה שלנו. התחל בהרדמה נכונה של נקבת חולדת וויסטאר בת שמונה שבועות על פי פרוטוקולים מאושרים. בדוק כי מישור הרדמה כירורגי הושג על ידי לחיצה על כל כף, ושים לב להיעדר רפלקס הנסיגה.

לאחר מכן, השתמש במשתיל MicroTransponder כדי למקם MicroTransponder על גב החולדה. בדוק שה-MicroTransponder ממוקם כהלכה ושניתן לקבל קריאה. כעת גזרו את השיער על קרקפת החולדה, ומרחו חומר הרדמה מקומי על הקרקפת והאוזניים.

העבירו את החולדה למכסה זרימה למינרית, ובצעו את שאר ההליך בטכניקה אספטית. הנח את החולדה במסגרת הסטריאוטקסית, על ידי אבטחת מוטות האוזניים, ואחריהם מוט הפה והאף. כסו את גוף החולדה בשמיכת נייר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף.

יש למרוח חומר סיכה לעיניים כדי למנוע התייבשות של העיניים. לאחר מכן יש לחטא את הקרקפת על פי נהלים מאושרים. משתמשים כאן באחוז יוד אחד באיזופרופיל 70%.

לאחר ביצוע חתך קטן בקו האמצע של הקרקפת, יש לגרד בעדינות את הקרומים שעל הגולגולת ולשטוף במי מלח. לאחר שאפשרתם לגולגולת להתייבש, וודאו שניתן לראות בבירור ברגמה ולמבדה. כעת, מלאו מזרק מיקרו-הזרקה בנפח 10 מיקרו ליטר, 30 מד 20 מילומטר ב-AAV רקומביננטי והניחו אותו על משאבת המיקרו-הזרקה הממונעת המחוברת למכשיר הסטריאוטקסי.

עבור טרנזקציה ספציפית של הנוירונים הדופמינרגיים של החומר השחור, וקטורי AV רקומביננטיים הם הבחירה הראשונה בגלל הטיטר הגבוה שלהם ויעילותם להתמרת נוירונים דופמינרגיים. בדוק את הזרימה, על ידי שחרור טיפה של AAV. השלך כל AAV ששוחרר בחומר ניקוי רב ערכי.

בדוק ויזואלית שהראש מקובע ישר במסגרת הראש. לאחר מכן בדוק שהגולגולת שטוחה, על ידי הזזת קצה המחט לברגמה ומדידת הגובה בנקודה זו, על ידי הורדת קצה המחט בכיוון הגב-גחון עד למגע בגולגולת. חזור על ההליך בלמבדה.

לאחר החזרת המחט לברגמה, הזז את המחט בכיוון האחורי האחורי והמדיאלי לכיוון הסטריאוטקסי להזרקת מיקרו. רשום את הקואורדינטות. באתר ההזרקה יש למדוד את גובה הגולגולת כמו קודם, ולוודא שהוא אינו שונה מיותר מ-0.3 מ"מ מגובה הברגמה.

לאחר מכן קדחו בזהירות חור של שני מילימטר בגולגולת. לאחר קידוח החור, מדוד את גובה הדורה כדי לקבוע את הייחוס שממנו יש ליישם את הקואורדינטה הגבית-גחונית. חודרים לדורה באמצעות מחט בגודל 26.

ספגו כל דם עם הרקמה הסטרילית, והמשיכו רק לאחר הפסקת כל הדימום. כעת הורד לאט לאט את המחט של מזרק המיקרו-הזרקה הטעון מראש למוח לקואורדינטה הגבית-גחונית. ועצרו לרגע.

לאחר מכן הזרקו שלושה מיקרו-ליטר AAV בקצב של 0.25 מיקרו ליטר לדקה. לאחר ההזרקה, הניחו למחט להישאר במקומה למשך חמש דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת לאורך מסלול המחט לפני הסרתה לאט. תפר את הקרקפת באמצעות פוליאסטר קלוע מקודד 3.0 וחטא את העור עם אחוז יוד אחד ו-70% איזופרופיל.

כדי לשחרר את מוט האף והפה, ולאחר מכן את שני מוטות האוזניים, כדי להסיר בעדינות את החיה מהמכשיר הסטריאוטקסי. בשלב זה יש לתת משככי כאבים, ובמידת הצורך חומר היפוך הרדמה. לאחר מכן הניחו את החולדה בכלוב נקי על צלחת חימום המוגדרת ל-38 מעלות צלזיוס, ועקבו מקרוב עד שהיא מתעוררת.

לאחר הניתוח, ניתן לחקור את הקינטיקה של ניוון עצבי בכל החיה באמצעות בדיקות התנהגותיות והדמיית PET ולאחר הקרבה, תוך שימוש בטכניקות אימונוהיסטוכימיות. בדיקת הצילינדר להערכת שימוש ספונטני בגפיים הקדמיות, בוצעה בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת מיקרו של AAV רקומביננטי המבטא A53T מוטציה אלפא סינוקלאין לתוך החומר השחור. משלושה שבועות לאחר ההזרקה, הפגיעה המוטורית המשמעותית נצפתה בחולדות שקיבלו את המינון החציוני.

ארבעה שבועות לאחר ההזרקה, נצפתה ירידה של 50% בשימוש ספונטני בכף הקדמית הנגדית. בעוד שבעלי החיים שהוזרקו ל-eGFP לא הראו אסימטריה בשימוש בכף הקדמית. חולדות שקיבלו מינון גבוה יותר של AAV 2/7A53T אלפא סינוקלאין רקומביננטי, הראו פגיעה בולטת יותר בשימוש בכף הרגל הקדמית לאחר 29 ימים לאחר ההזרקה.

כדי להוכיח שהליקוי המוטורי שנצפה היה תלוי בדופמין, ניתנה מנה אחת של L-doba. כאשר בדיקת הצילינדר חזרה על עצמה 45 דקות לאחר הטיפול ב-L-dopa, נצפתה התאוששות מלאה של השימוש בכף הקדמית בבעלי חיים שהוזרקו AAV 2/7A53T אלפא סינוקלאין. כדי לעקוב אחר הקינטיקה של ניוון עצבי דופמינרגי ניגרוסטריאטלי באופן לא פולשני לאורך זמן, בבעלי חיים בודדים, קשירה המועברת דופמין כומתה באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים של בעלי חיים קטנים עם F-18FECT כרדיוליגנד.

קשירת DAT פחתה משמעותית בבודימן הזנב המקביל של חולדות רקומביננטיות AAV 2/7A53T אלפא סינוקלאין שהוזרקו לאורך זמן. לאחר 32 יום נצפתה ירידה בקשירת DAT של עד 85%. כבקרה חיובית, הזרקת הרעלן העצבי 6 OHDA ב-SN גרמה לאובדן של 90% מקשירת DAT תוך שבעה ימים.

קטעי מוח מחולדות שהוזרקו עם AAV 2/7A53T אלפא סינוקלאין רקומביננטי לאורך זמן היו צבועים חיסונית עבור טירוזין הידרוקסילאז, סמן של נוירונים דופמינרגיים. נתון זה מדגים את האובדן המתקדם של נוירונים דופמינרגיים במשך תקופה של 29 יום לאחר מיקרו-הזרקה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 45 דקות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בהתאמות וקטוריות סופיות באיכות גבוהה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות, כמו הדמיית PET לא פולשנית, ניתוח התנהגות וניתוח אימונוהיסטוכימי על מנת לקבוע את רמת הניוון העצבי והנוירופתולוגיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבצע הזרקת וקטור ויראלי לחומר השחור על מנת לפתח מודלים של בעלי חיים מבוססי וקטור ויראלי למחלת פרקינסון.

אל תשכח שעבודה עם וקטורים נגיפיים עלולה להיות מסוכנת, וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה תחת זרימה למינרית וטיהור פסולת נכון בהתאם להליך זה.