Name: פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למד שיטת PCR כמותי לאבחון Equine herpesvirus-2 בנוזלי נשימה של סוסים. השיטה מספקת נתונים כמותיים רגישים וספציפיים לתמיכה באבחון מחלות נשימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לסופי קסטניה ולנדיה דובלי-בונואה על תמיכתן הטכנית. עבודה זו קיבלה תמיכה כספית מהמועצה הכללית של קלבדוס והסכמה של אזור Basse-Normandie וממשלת צרפת (CPER 2007-2013; פרויקט R25 עמ' 3). המחברים רוצים להודות למומחים של קבוצת AFNOR ובמיוחד לז'אן-פיליפ באפרו ואריק דובואה.

<ol><li>Brault, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+of+foals+to+natural+infection+with+equid+herpesvirus-2+and+its+association+with+febrile+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Immunol.Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness.</a> Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).</li>
<li>Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+gammaherpesviruses%3A+pathogenesis%2C+epidemiology+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis.</a> Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).</li>
<li>Hue, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+equid+gammaherpesviruses+%28EHV-2%2C+EHV-5%29+in+nasal+swabs+using+an+accredited+standardised+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method.</a> J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).</li>
<li>Diallo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+real-time+PCR+for+the+detection+and+differentiation+of+equid+herpesvirus+1+%28EHV-1%29+and+equid+herpesvirus+4+%28EHV-4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4).</a> Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).</li>
<li>Williams, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+multinodular+pulmonary+fibrosis%3A+a+newly+recognized+herpesvirus-associated+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Pathol%22%5BJournal%5D)">Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease.</a> Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).</li>
<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.Quant.Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).</li>
<li>EPA Office of Water (4607). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EPA-815-B-04-001.+Quality+Assurance%2FQuality+Control+Guidance+for+Laboratories+Performing+PCR+Analyses+on+Environmental+Samples%22">EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples</a>. , (2004).</li>
<li>Telford, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+herpesviruses+2+and+5+are+gamma-herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses.</a> Virology. 195 (2), 492-499 (1993).</li>
<li>Fortier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+equid+herpesvirus-5+in+respiratory+liquids%3A+A+retrospective+study+of+785+samples+taken+in+2006-2007%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007.</a> Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).</li>
<li>Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+and+variation+in+viral+load+during+equid+herpesvirus-2+infection+of+foals%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals.</a> Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-1.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+1%3A+Requirements+and+recommandations+for+the+implementation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-2.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+2%3A+Requirements+and+recommendations+for+the+development+and+the+validation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+ISO-CEI+17025.+General+requirements+for+the+competence+of+testing+and+calibration+laboratories%22">EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories</a>. , (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals+2010.+Chapter1.1.1.4%2F+5.+Principles+and+Methods+of+Validation+of+Diagnostic+Assay+for+Infectious+Diseases%22">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases</a>. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).</li>
<li>Apaza, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+genogrouping+of+noroviruses+from+children%27s+stools+by+Taqman+One-step+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR.</a> J Vis.Exp. (65), e3232(2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis.Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>NCBI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BLAST+Homepage+and+Selected+Search+Pages.+Introducing+the+BLAST+homepage+and+form+elements%2Ffunctions+of+selected+search+pages%22">BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages</a>. , (2015).</li>
<li>Greiner, M., Gardner, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+diagnostic+tests+in+veterinary+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies.</a> Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).</li>
<li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מאז שנות ה -2000, בזמן אמת PCR כבר להחליף את הטכניקות תקן הזהב (תרבית תאים ושיטות התרבות חיידקים) ב מספר גדל והולך של מעבדות. יישום הטכניקה הוא קל יחסית. עם זאת אימות של שיטות מעבדה חיונית זיהוי מולקולרי וכימותי פתוגנים כדי להבטיח נתונים מדויקים, דיר אמין. מאז צעד החילוץ הוא המקור העיקרי של אובדן של חומר ביולוגי, היא עשויה להיחשב המקור העיקרי של שגיאה של כימות בין פרוטוקול אחד למשנו. ככזה, יצירת עקומת סטנדרט של פלסמיד DNA במהלך qRT-PCR, בעיקר מהמדווח בספרות, מציין את העומס הגנום הנגיפי אבל לא לוקח בחשבון את הצעד החילוץ. תיאור של אסטרטגיה דה נובו עבור תהליך אימות השיטה כולה בנורמה AFNOR NF U47-600-2 מייצג התקדמות משמעותית בתחום זה. כפי שמודגםבמאמר זה עבור EHV-2 בסוסים, או על ידי אחרים בדבורים 21, זו מחייבת הבחנה ברורה בין שלב הפיתוח על שלב האימות עם אפיון של PCR ואפיון של השיטה כולה. מגבלה אחת בגישה מעניינת לכך היא כי כל שינוי בפרוטוקול יגרום החובה revalidate את התהליך המלא אשר יכול להיות מאוד יקר. מגבלה זו גם הייתה מודגשת על ידי העובדה כי בין כותלי כימות תלוי המקור שממנו הווירוס מופק (למשל, נוזלים בדרכי נשימה, איברים, דם או שתן). למעשה, כל מטריצה ​​מציג ספציפיות שונות במאפייני פיסיקלי כימיה שלהם וזה חשוב להגדיר כל מטריצה ​​שונה באופן עצמאי לצורך איתור וכימות ויראלי ידי qRT-PCR. לפיכך, עומס הגנום הנגיפי של כל דגימה ביולוגית ניתן לכמת באופן מדויק יותר מן החילוץ. האפיון גם לוקח בחשבון את mod thermocyclerאל וכאשר שימוש שיטה בעבר היטב מאופיינת (למשל, שיטת qPCR EHV-2 המתואר במאמר זה) מחייב סוג חדש של מכונית במעבדת ההורה או מעבדה אחרת, יש לאשר את הביצועים של מכשיר זה. האישור של הביצועים של assay qPCR הוא תנאי הכרחי עבור כל הבדיקות להביא למעבדה. זו מושגת בדרך כלל על ידי ניתוח מדגם התייחסות עם מאפיינים ידועים. כזה המחאה היא תנאי ונחשב חובה כמבוקש על ידי הנורמה AFNOR NF 47-600-1 כדי לאמת את הביצועים של qPCR (לוד, יעילות LOQ) ואת חוסנו של השיטה כולה (לוד, LOQ). לא רק במהלך השלבים פיתוח ואפיון אלא גם כאשר נעשה שימוש במחקר, או למטרות אבחון, ניתן לזהות את גורמי הסיכון ואת מבוקרים היטב על מנת להבטיח סטנדרטיזציה של הפרוטוקול. מדאיג במיוחד הוא אימון צוות נאות, כוח אדם מיומן, בקרת איכות של החומרים מתכלהמשומשים והאחסון שלהם, שליטה על התנאים והמודעות סביבתיים מיידית תנאים המטרולוגי שעשויים להשפיע על הביצועים של המכשירים המדעיים המעורבים assay. שימוש דגימות התייחסות להשוואות בין-מעבדה גם יכול לסייע בשליטה על חוסר הוודאות. באופן זה, השוואה של נתונים בין מעבדות ניתן הקל. ואכן, בדיקות מיומנות בין-מעבדה חיוניות להעריך ולאשר את השחזור של השיטה. תוצאות עומס הגנום נגיפיות אשר באות לידי ביטוי יחידות בינלאומיות (IU) של המטריצה ​​הביולוגית נתחה (IU: עותקים / מיליליטר עבור נוזלים או עותקים / g עבור רקמות) הם קלים יותר לשימוש על מנת להשוות את התוצאות בין מעבדות שונות. כל התוצאות מעל LOQ מבוטאות עותקים / מ&quot;ל ​​וגם תוצאה בין לוד LOQ נלקח כתוצאה חיובית שאינם מדידים. הצגת נתוני quantificational של הגנום בצורה זו תואמת יותר במדויק למחזורים של ניתוחים (הגברה של הגנום). למעשה, בניסויים בתרביות תאים, ביטוי של העומס הנגיפי על ידי TCID 50 (מקור להדבקת תרבות החציוני רקם מנה) תלוי באופי של זני התאים וירוסים. כל שורת זן בעל קינטיקה הזיהום ייחודית וכמה וירוסים כמו EHV-2 יכול לקחת כמה ימים לפני השפעת cytopathogenic הראשונה היא נראה לעין. לסיכום, שיטה חדשה זו של אפיון של qRT-PCR אמורה להקל על הרמוניזציה של מצגת נתונים ופרשנות בין מעבדות. זה יהיה שימושי מאוד עבור יישומים פוטנציאליים חדשים של qRT-PCR בעתיד כמו הקמת ערך חתוך עבור הכרזה על מצב המחלה ולא רק הנוכחות או היעדר של הפתוגן.

הרפס-2 Equid (EHV-2) מעורב תסמונת נשימתית, עם ביטויים קליניים פוטנציאליים כגון ונזלת, דלקת הלוע ואת בלוטות לימפה נפוחות 1-3. וירוס זה הוא חשוד גם יקושר עם ביצועים הירודים של סוסים, אשר עלול לגרום השפעה כלכלית משמעותית ושלילית עבור תעשיית הסוס 2. עד עכשיו, את תקן הזהב עבור גמא EHV (γ-EHV) זיהוי הייתה השיטה תרבית תאים. על אי הנוחות הראשונה של הליך זה היה העדר אפליה בין EHV-2 ואחרים γ-EHV של (למשל, EHV-5). על אי הנוחות השנייה הייתה ההתפתחות האיטית של תהליך cytopathic, אשר לוקח 12 עד 28 ימים להתבטא 4,5. פיתוח של תגובת שרשרת פולימראז כמותי בזמן אמת תוקף מנורמל (qRT-PCR) שיטה יעזור לזהות את נגיף במהירות, להפלות בין EHV-2 ו EHV-5 וכדי ללמוד את הקשר בין עומס הגנום הנגיפי ואת הודות המחלה להיבט כימות. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) תוארה לראשונה בשנת 1986 על ידי מוליס 6 והוא עומד להפוך לסטנדרט זהב החדש ברוב בתחומי אבחון ביולוגי (אדם, סביבת וטרינרים). שיטה זו, המבוססת על ההגברה של חלק מהגנום של פתוגנים, מציגה יתרונות רבים: סגולית, רגישות במהירות. יתר על כן, את הסיכון של זיהום amplicon נסוג מאז כניסתו של qRT-PCR והבטיח איכות 7. עם זאת, הכרת PCR כשיטה סטנדרט זהב חדשה צריכה יותר נתוני ביצועים משופרים רק אלא גם הפגנת הבקרה של צעדי פיתוח ותיקוף של השיטה כולה ללא שפלה של ביצועים לאורך זמן. הכלי המולקולרי הראשון השתמש לצורך זיהוי של EHV-2 היו זמן גהגברה הלא ספציפית onsuming ומעורב עם PCR מקוננות ואחריו רצף 8. הגנים הממוקדים עבור נגיפי ההרפס היו חומצת deoxyribonucleic (DNA) פולימראז ו- DNA אריזת 9. עם זאת, מקוננים PCR מהווה סיכון גבוה של זיהום על ידי amplicons. מאז, בדיקות PCR קונבנציונליות עוצבו כדי להגביר את interleukin גן 10 דמוי או גן B גליקופרוטאין, ביקורת בשנת 2009 2. לאחרונה, מאפייני PCR בזמן אמת תוארו עבור כימות של EHV-2 10 אבל לא התקבלו נתונים לגבי אימות של השיטה כולה כולל תהליך החילוץ. בפרוטוקול זה, הליכי פיתוח ותיקוף מתוארים ביחס שיטה PCR כמותי עבור איתור וכימות של DNA EHV-2 בנוזלי הנשימה סוסים פי נורמליזציה האגודה Française de (AFNOR) הנורמה NF U47-600 3,11,12, שהוא הנציג הצרפתיועדת הנורמליזציה הבינלאומית. נורמה זו מפרט את &quot;דרישות והמלצות ליישום, פיתוח ותיקוף PCR וטרינרית שיטת ניתוח הגנריקה&quot; 11,12, על פי NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 וכדי OIE (הארגון העולמי לבריאות בעלי חיים) . המלצות 2010 14 פרוטוקול אימות EHV-2 qRT-PCR כרוך הליך בת שלושה חלקים: (א) פיתוח של assay qRT-PCR, (ב) אפיון של assay qRT-PCR לבד (ג) אפיון של השלם שיטת אנליטית (מתוך מיצוי של חומצות גרעין מן המדגם הביולוגי ניתוח PCR). האפיון של assay qRT-PCR ושל השיטה אנליטית כולו כולל הגדרה של שתי מגבלות: הגבלה על זיהוי (לוד) וגבול כימות (LOQ). ה- PCR 95% לוד מייצג את המספר הנמוך ביותר של עותקי חומצות גרעין ליחידת נפח כי ניתן לאתר ב -95% מכלל CASes. ה- PCR 95% LOQ מייצג את הכמות הנמוכה ביותר של עותקי חומצות גרעין שיכול להיקבע תוך התחשבות הוודאויות. שיטת qRT-PCR זה מאפשר איתור מדויק וכימות המהירה של EHV-2 בנוזלי הנשימה. יתר על כן, השיטה יכולה להיות מיושמת במעבדות אחרות כדי להבטיח הליך סטנדרטי ותבנית כללית לפיתוח מבחני qRT-PCR חדשים אחרים.

<table><tbody><tr><td>AB-1900 צבע טבעי ABgene 96 צלחת באר&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>סרט דבק qPCR אבסולוט&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16629</td><td>סרט דבק המשמש לאיטום הצלחת לפני הפעלת ה-qRT-PCR</td></tr><tr><td>0.5 מ"ל מיקרו-צינורות, חצאית, כובעים</td><td>Dutsher</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 98%</td> <td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים</td><td>Eurofins</td><td>הזמנה</td><td></td>מותאמת אישית</tr><tr><td>Probe</td><td>Life Technologies</td><td>הזמנה</td><td></td>מותאמת אישית</tr><tr><td>פלסמיד</td><td>Eurofins</td><td>הזמנה</td><td></td>מותאמת אישית</tr><tr><td>QIAamp&nbsp; ערכת מיני ויראלית RNA (מכילה: עמודת QIAamp Mini, AVL&nbsp; מאגר,&nbsp; מאגר AW1, מאגר AW2, מאגר AVE, צינורות איסוף)&nbsp;</td><td>מאגר Qiagen</td><td>52906</td><td>AVL: חימום מראש 5 דקות ב-72 מעלות; C</td></tr><tr><td>רצף בשיטת סנגר</td><td>Eurofins</td><td>הזמנה</td><td></td>מותאמת אישית</tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA פתרון חיץ</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו-מדעי</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus מערכות PCR בזמן אמת</td> טכנולוגיות <td>חיים</td><td>4376600</td><td>טרום חימום 15 דקות&nbsp;</td></tr></tbody></table>

פיתוח ותיקוף של שיטת ה- pcr כמותי עבור equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

הפרוטוקול מתאר שיטת RT-PCR כמותית לזיהוי וכימות של EHV-2 בנוזלי נשימה של סוסים על פי נורמת NF U47-600. לאחר שלב הפיתוח והאימות הראשון, בוצעו שני שלבי אפיון נפרדים על פי הנורמה של AFNOR: (א) אפיון בדיקת qRT-PCR בלבד ו-(ב) אפיון השיטה האנליטית כולה. האימות של השיטה האנליטית כולה כלל תיאור של כל השלבים בין מיצוי חומצות הגרעין לניתוח ה-PCR הסופי. 
אימות השיטה כולה חשוב מאוד לזיהוי וירוסים על ידי qRT-PCR על מנת לקבל קביעה מדויקת של עומס הגנום הנגיפי. מכיוון ששלב המיצוי הוא המקור העיקרי לאובדן חומר ביולוגי, הוא עשוי להיחשב כמקור העיקרי לטעות בכימות בין פרוטוקול אחד למשנהו. מסיבה זו, נורמת AFNOR NF-U-47-600 ממליצה לכלול את טווח דילול הפלסמיד לפני שלב החילוץ. בנוסף, מגבלות הכימות תלויות במקור ממנו מופק הנגיף. תוצאות עומס הגנום הנגיפי, המתבטאות ביחידות בינלאומיות (IU), קלות יותר לשימוש על מנת להשוות תוצאות בין מעבדות שונות. 
שיטה חדשה זו לאפיון של qRT-PCR אמורה להקל על הרמוניזציה של הצגת נתונים ופרשנות בין מעבדות.

השיטה RT-PCR כמותי, כפי שתואר לעיל, יושמה כדי לזהות ולכמת ההרפס-2 equid בנוזלי הנשימה. איור 1 מדגים תרשים זרימת עבודה סכמטי עבור פיתוח ותיקוף שיטה כמותית RT-PCR פי הנורמה AFNOR NF U47-600. הספציפי של primers ו הבדיקות אומתו במהלך פיתוח צעד-אחר-צעד של PCR. רק EHV-2 זנים היו מוגברים במערכת זו. כתוצאה מכך, הביצועים של היו qRT-PCR להתאפיין. ראשית, כדי להעריך את PCR לוד, דילול סדרתי 6 פי עשר בוצע להקים את אזור ההפחתה (איור 2). בדוגמה זו, 6 דילולים סדרתי פי עשרה נעשו בין 10 -5 ו 10 -10 (בין 26,000 ו 0.26 עותקים / 2.5 מדגם μl) כדי להעריך את PCR בלוד. אזור ההפחתה lies בין דילולים של 10 -9 ו 10 -10 (בין 2.6 ו 0.26 עותקים / 2.5 מדגם μl). כדי לקבוע את הערך PCR LOD במקרה זה, 6 דילולים סדרתי כפולה של פלסמיד נעשו באזור הפחתה זו בין 5.2 לבין 0.16 עותקים / 2.5 מדגם μl. שווי לוד PCR היה 2.6 עותקים / 2.5 מדגם μl. כדי לקבוע את הטווח ליניאריות LOQ PCR, ערך PCR לוד שמש להתחיל בטווח של 6 דילולים סדרו פי עשרה, בין 2.6 (LOD PCR) ו 260,000 עותקים / 2.5 מדגם μl. איור 3 ממחיש רגרסיה ליניארית עבור EHV2 qRT-PCR ממשפט אחד. ההופעות של רגרסיה ליניארית (איור 4) הן תוקפות ארבעה פעמים באמצעות החישובים המתואר בטבלה 3. החישובים נערכים על מנת להגדיר את הטווח ליניאריות פי הקריטריונים Bias המוחלט אני value ≤0.25 להיכנס 10, מה רמת i של עומס פלסמיד. במקרה זה, הליניאריות טווח שהשתרע בין 2.6 ו 260,000 עותקים / 2.5 מדגם μl. ה- PCR LOQ הוא הריכוז הנמוך ביותר בטווח ליניאריות (כלומר, 2.6 עותקים / 2.5 מדגם μl במקרה זה). U לין היה נחוש בדעתו להיות 0.12 יומן 10 בטווח 2.6-260,000 עותקים / 2.5 μl של ה- DNA. לאחר פיתוח (איור 1, כחול) ואפיון של qRT-PCR (איור 1, צהוב), הנורמה U47-600 AFNOR NF ממליצה אפיון של שיטה אנליטית כולו מן מיצוי DNA כדי qRT-PCR (איור 1, כתום). הרגישות והסגוליות אבחון חושבו כמתואר בטבלה 4. ההופעות הכמותית של שיטה אנליטית כולו qRT-PCR הוערך ומאומתים עם פרופיל דיוק ( <strong&gt; איור 5). פרוטוקול זה, אשר משתמש המדינה- of-the-art טכנולוגיה מולקולרית, אפשר לנו לזהות ולכמת את עומס הגנום הנגיפי EHV-2 ב 172 דגימות ספוגית אף המתקבל סוסים עם הפרעות נשימה ו / או חשד קליני לזיהום. תחולת EHV-2 מהשדה דגימות (ביולוגי) היה 50% (86/172) באוכלוסיה זו. הניתוחים כמותיים הראו כי המון הגנום הנגיפי של EHV-2 היו גבוהים יותר משמעותית סוסים צעירים ואת לחלק מחדש של המון הגנום הנגיפי ירד עם הגיל (איור 6). במחקר הנוכחי, העומס הגנום הנגיפי הגבוה EHV-2 (1.9 x 10 11 עותקים / מ&quot;ל) זוהה סייחים (איור 6). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" /> איור 1: תרשים זרימת עבודה לפיתוח (כחול), אפיון של RT-PCR כמותי(צהוב) ואת האפיון של שיטה אנליטית כולו מן מיצוי DNA כדי qRT-PCR (כתום) על פי הנורמה AFNOR NF U47-600-2. התרשים עבודה קורות חיים השלבים השונים לפיתוח, אפיון של RT כמותיים -PCR ואת האפיון של שיטה אנליטית כולו מן מיצוי DNA כדי qRT-PCR. לכל שלב, תרשים העבודה מציין את מספר ריצות נדרשו, דילולים לבצען ומספר האנליסטים הנדרשים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" /> איור 2: קביעת אזור ההפחתה עם תוצאות נציגים עקומות בזמן אמת PCR שהושג עם 6 דילולים סדרו פי עשרה של פלסמיד. כדי להעריך את אזור ההפחתה, 6 סדרתי פי עשרהדילולים נעשים בין 10 -5 (26,000 עותקים / 2.5 מדגם μl) ו 10 -10 (0.26 עותקים / 2.5 מדגם μl). אזור הפחתה טמון בין דילולים של 10 -9 (2.6 עותקים / 2.5 מדגם μl) ו 10 -10 (0.26 עותקים / 2.5 מדגם μl). במקרה זה, 6 דילולים סדרתי כפולה של פלסמיד נעשו באזור הפחתה זו כדי לקבוע את PCR 95% לוד, בין 5.2 ו 0.16 עותקים / 2.5 מדגם μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" /> איור 3:. רגרסיה לינארית עבור EHV2 qRT-PCR הליניאריות של בדיקות כמותיות הוא היכולת ליצור תוצאות ואלה עומדות ביחס ישר לריכוז של היעד הנוכחי בתוך טווח מסוים. זה יכול להיות מודל על ידירגרסיה ליניארית (y = ax + b) בין התגובה אינסטרומנטלי (סף מחזור או CT) הלוגריתם של הכמות של היעד (מספר עותקי יעד / 2.5 מדגם μl). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" /> איור 4:. ביצועים של רגרסיה ליניארית של EHV-2 qPCR Mean הטיה מייצגים את ההבדל הממוצע בין כמות פלסמיד מדודה ( <img alt="fig4-1" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" /> ) ואת כמות פלסמיד התיאורטית (x &#39;i) עבור כל רמת פלסמיד. הקווים האנכיים מייצגים את הוודאות ליניאריות (U Lini) המחושבת על פי הנוסחה <img alt="fig4-2" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" /> שם SD&#39;i הוא סטיית התקן o<html> f נמדד פלסמיד כמות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" /> איור 5:. פרופילי דיוק מבוססים על תוצאות האימות של שיטת EHV-2 qRT-PCR הקו הירוק (עיגולים) מייצג את אמיתות הנתונים (טעות שיטתית, או הטיה). גבולות הקבילות מוגדרים ב ± 0.75 יומן 10 על ידי המעבדה (קווים מקווקווים). התחתונים ואת גבולות הדיוק העליונים נקבעו עבור כל רמת עומס פלסמיד מתוך ההטיה הממוצעת ± פעמי סטיית ההתקן של הנתונים האמינים (קווים אדומים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 1 &quot;&gt; <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" /> איור 6:. כימות המון הגנום הנגיפי של EHV-2 לפי גיל חלוקת עומס הגנום הנגיפי של EHV-2 בדגימות ספוגית האף מיוצגת עבור קבוצות גיל שונות. הקווים האופקיים מייצגים את ערכי החציון בתוך סטיית התקן (מ &#39;= חודשים). * שונה באופן משמעותי על ידי ANOVA עם ניומן-Keuls פוסט הוק בדיקה (p &lt;0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> גן היעד </td><td colspan="3"> Primers, חללית רצפי plasmide (5&#39;-3 &quot;) </td><td> עמדת נוקלאוטיד </td><td> גודל מוצר (נוקלאוטידים) </td><td colspan="2"><strong&gt; תנאי רכיבה תרמיים </td><td> הפניות </td></tr><tr><td rowspan="4"> EHV2 GB (HQ247755.1) </td><td colspan="3"> קדימה: GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td><td> 2113-2130 </td><td rowspan="4"> 78 </td><td> 95 ° C 5 דקות </td><td></td><td rowspan="4"> 11 </td></tr><tr><td colspan="3"> הפוך: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA </td><td> 2189-2170 </td><td> 95 ° C 15 שניות </td><td rowspan="2"> 45 מחזורים </td></tr><tr><td colspan="3"> Probe: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB </td><td> 2132-2157 </td><td> 60 ° C 1 דקות </td></tr><tr><td colspan="3"> פלסמיד: ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG </td><td> 2081-2381 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1:. רצפים של פריימרים, בדיקות ובקרות DNA סינתטי חיובית בשימוש בפרוטוקול זה רצף של פלסמיד (DNA סינתטי חיובי) תואמת נוקלאוטיד עמדות 2081-2381 של רצף EHV2gB (HQ247755.1). העיצוב של primers ו בדיקות להשתמש בפרוטוקול זה הושג באמצעות תוכנה ספציפית. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> פתוגנים </td><td rowspan="2"> הפניה (מקור) </td><td rowspan="2"> מספר הזנים </td><td> תוצאות </td></tr><tr><td> EHV-2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-2 </td><td> VR701 (ATCC) </td><td rowתוחלת = &quot;2&quot;&gt; 20 </td><td rowspan="2"> חִיוּבִי </td></tr><tr><td> 20 דגימות (אוסף FDL) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-5 </td><td> KD05 (GERC) </td><td rowspan="2"> 20 </td><td rowspan="2"> שלילי </td></tr><tr><td> 20 דגימות (אוסף FDL) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-3 </td><td> VR352 (ATCC) </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> שלילי </td></tr><tr><td> T934 WSV (GERC) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-1 </td><td> זן קנטאקי קי A (ATCC) </td><td rowspan="2"> 3 </td><td rowspan="2"> שלילי </td></tr><tr><td> 2 דוגמאות (אוסף FDL) </td></tr><tr><td> EHV-4 </td><td> VR2230 (ATCC) </td><td> 1 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> מטופש ההרפס AHV5 </td><td> אוסף FDL </td><td> 1 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td rowspan="2"> סוּסִיוירוס שפעת </td><td> A / סוסים / Jouars / 4/2006 (H3N8) </td><td rowspan="2"> 1 </td><td rowspan="2"> שלילי </td></tr><tr><td> (ספר עיון JX091752) </td></tr><tr><td> וירוס arteritis סוסים </td><td> VR796 (ATCC) </td><td> 2 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Rhodococcus שוה </td><td> אוסף FDL </td><td> 1 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Subsp שוה סטרפטוקוקוס. Zooepidemicus </td><td> אוסף FDL </td><td> 1 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Subsp שוה סטרפטוקוקוס. שָׁוֶה </td><td> אוסף FDL </td><td> 1 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> burnetii Coxiella </td><td> ADI-142-100 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Chlamydophila abortus </td><td> ADI-211-50 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Klebsiella Pneumoniae </td><td> אוסף FDL </td><td> 1 </td><td> שלילי </td></tr></tbody></table> טבלה 2: סגולי אנליטית של qRT-PCR עבור EHV-2. <img alt="טבלה 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" /> טבלה 3: חישוב אי הוודאות משוא פנים ליניאריות (מותאם מ NF U47-600-2 12). עבור כל ניסוי, ההופעות של רגרסיה ליניארית (y = ax + b) הן תוקפות באמצעות הטבלה כאשר y הוא סף המחזור מתקבל; a הוא המדרון שהושג;. X היא רמת פלסמיד ו- B הוא ליירט i הוא פלסמיד הרמה (i משתנית מ -1 עד רמות k); k הוא מספר רמות פלסמיד המשמש (למשל, k = 6 ב tהשולחן) שלו; j הוא הניסוי (j משתנית בין 1 ל I של ניסויים); I הוא מספר הניסויים, מורכב בין 3 ו -6 ניסויים (למשל I = 4 בטבלה זו) x i הוא כמות פלסמיד המוערכת לכל. אני פלסמיד רמה. x &#39;אני שווה לכל כמות פלסמיד התיאורטית שהושגה עם x המשוואה&#39; i = להיכנס 10 (x i) לכל i פלסמיד רמה. במהלך כל ניסוי j, סף המחזור מתקבל לכל i רמת פלסמיד מחושבת עם רגרסיה ליניארית אני y, j = a x j i, j + b j. <img alt="table3-1" src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" /> הוא כמות פלסמיד נמדד במהלך j לדין. Bias i </<html> sub&gt; ההבדל שנצפה בין כמות פלסמיד מדודת כמות פלסמיד התיאורטית עבור כל בדיקה בכל רמת פלסמיד. <img alt="table3-2" src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" /> הוא הערך הממוצע של <img alt="table3-3" src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" /> על ידי כל אני פלסמיד רמת; SD &#39;אני הוא סטיית התקן של הגודל הנמדד <img alt="table3-4" src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" /> לכל i רמת פלסמיד; Mean הטיה היא הממוצע של Bias i; U Lini הוא חוסר הוודאות ליניאריות שנקבעה לכל i פלסמיד רמה שנמדדת SD&#39;i ולהתכוון הטיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 1 &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;FO: keep-עם-next.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> מצב אמיתי של מדגם </td></tr><tr><td></td><td></td><td> חִיוּבִי </td><td> שלילי </td></tr><tr><td rowspan="3"> תוצאות שהושגו עם השיטה כולה </td><td> חִיוּבִי </td><td> RP (ריאלית חיובית) </td><td> FP (false positive) </td></tr><tr><td> שלילי </td><td> FN (תוצאה שלילית שגויה) </td><td> RN (ריאלי שלילי) </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> RP + FN </td><td> FP + RN </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Se = RP / (FN + RP) </td><td> Sp = RN / (RN + FP) </td></tr></tbody></table> לוח 4:. חישוב רגישות אבחון (Se) וסגוליות (SP) של השיטה כולה שולחן שוורץ שימש לחישוב confidמרווח ence ב 95% של הרגישות והסגוליות של השיטה כולה כמתואר NF U47-600-2.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ואימות של שיטת PCR כמותית המשמשת לזיהוי וכימות של DNA EHV-2 בנוזלי נשימה של סוסים. פרוטוקול האימות EHV-2 qRT-PCR כולל הליך בן שלושה חלקים: פיתוח, אפיון בדיקת qRT-PCR בלבד ואפיון השיטה האנליטית כולה.

פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

המטרה הכללית של שיטת ה-qPCR היא להעריך את העומס הנגיפי של equine herpesvirus-2 בדגימות ביולוגיות מסוסים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי האבחון של מחלות נשימה בסוסים, ובאספקת נתונים כמותיים עבור עזרים פרשניים חדשים לבעלי מקצוע. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היותה רגישה, ספציפית ומהירה.יתרון נוסף הוא הפיתוח בהתאם לתקן AFNOR norme NF U47-600, המייצג הצרפתי בוועדה לנורמליזציה בינלאומית. את הפרוצדורה תדגים אריקה הו, חוקרת צעירה מהיחידה שלי. כדי למצות חומצות גרעיניות מדגימה ביולוגית של נוזלי נשימה, התחילו בתוך מנדף כימי בהוספת 140 µL של דגימה ביולוגית ל-560 µL של תמיסת ליזיס, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.הוסיפו 560 µL של אתנול לדגימה, והעבירו 630 µL מכלל התמיסה לעמודת סיליקה וסובבו בצנטריפוגה. העבירו את 630 µL הנותרים לעמודת הסיליקה וסובבו בצנטריפוגה שנית. לאחר העברת הדגימה לעמודה, השתמשו ב-500 µL מכל אחד מתוספי השטיפה AW1 ו-AW2 כדי לשטוף את העמודה פעמיים.כדי לאלואציית החומצות הגרעיניות מהעמודה, הוסף 50 µL של תמיסת elution או באפר AVE בטמפרטורת החדר. סגור את הפקק והדגר בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה ב-6,000 ×g למשך דקה אחת.כדי להגביר את ה-DNA, לאחר תיתוח הפריימרים והפרובה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו 22.5 µL של תערובת תגובה עבור כל תגובה על ידי הוספה של 12.5 µL של PCR master mix, פריימרים קדמיים ואחוריים בריכוז 20 µM, פרובה בריכוז 10 µM, וכמות מספקת של מים אולטרה-טהורים כנדרש כדי להגיע לנפח של 22.5 µL. כדי למנוע זיהום, הכינו תמיד את תערובת תגובת ה-PCR באזור ייעודי. חלקו 22.5 µL מתערובת התגובה המתאימה לכל באער תגובה בלוח של 96 באערים.יש לכלול ביקורות שליליות לתהליכי המיצוי וה-PCR כדי להבטיח שאף אחד מהריאגנטים אינו מזוהם ב-DNA לא רצוי. לאחר מכן, יש להוסיף 2.5 µL מהדגימה, מביקורת השלילית של המיצוי, מביקורת השלילית של ה-PCR או מדגימת הביקורת החיובית לבארי התגובה המתאימים. לאחר מכן, יש לכסות את הפלטה באמצעות מדבקה לאטימה (adhesive plate seal).סבבו בצנטריפוגה ב-6,000 gs למשך 10 שניות. הניחו את הפלטה במערכת real-time PCR. לאחר מכן, בחרו את התבנית עבור פריסת הבדיקה ואת הגדרות תוכנית ה-PCR המוצגות כאן, והפעילו את הריצה.לאחר העברת הנתונים הגולמיים ממערכת ה-real-time PCR לגיליון אלקטרוני, הגדירו את הסף (threshold) בגרפי ההגברה מעל קו הבסיס (baseline) ובתוך אזור הצמיחה המעריכית כדי לקבל את מחזור הסף (threshold cycle) עבור כל דגימה. שרטטו את סדרת התקנים כעקומת תקן כדי להשיג ליניאריות. לאחר מכן, חשבו את מספר העותקים עבור הדגימות השונות על בסיס עקומת התקן.כדי לקבוע את גבול הגילוי של תוצאות ה-qRT-PCR, העבירו 90 µL של מים אולטרה-טהוריםים לשש מבחנות. כדי להכין שש דילול נסיגתיים פי 10 של הפלסמיד למטרת איתור אזור הדילול (abatement zone), התחילו בהעברה של 10 µL מהדילול העובד של הפלסמיד למבחנה המכילה 90 µL של מים אולטרה-טהוריםים. ערבבו קצרות במערבל Vortex וסובבו את המבחנה בצנטריפוגה.לאחר מכן, העבירו 10 microliters מהמבחנה למבחנת המים הבאה. לאחר ערבוב ב-vortex וסבוב בצנטריפוגה, חזרו על ההעברה עד שכל מבחנות המים יכילו את הפלסמיד. לאחר הגברת ה-DNA בשש הדילוליות הסיריאליות של פי עשרה כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה, קבעו את אזור ההפחתה (abatement zone), שהוא הדילול האחרון של הפלסמיד המפיק אות חיובי והדילול הראשון ללא זיהוי.להכנת שישה דילולים סדרתיים ביחס של 1:2, העבירו 25 µL של מים אולטרה-טהוריםים לשש מבחנות. מהדילול האחרון של הפלסמיד שהניב אות חיובי בדילולים העשוריים, העבירו 25 µL מהמבחנה למבחנת המים הראשונה. ערבבו במערבל Vortex וסובבו בצנטריפוגה לפני הכנת חמשת הדילולים הנותרים, כפי שהודגם כעת.בצע הגברה של ה-DNA מהדילולות הסדרתיות הדו-מכפלות כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. לאחר הגברת ה-DNA משלושת הניסויים הבלתי תלויים, חשב את מספר החזרות החיוביות מתוך 24 חזרות עבור כל רמת ריכוז של הפלסמיד. קבע את ה-LOD ברמת ביטחון של 95 אחוזים או LOD 95 percent PCR, שהיא הרמה המובילה לזיהוי של 23 חזרות חיוביות מתוך 24 חזרות.כדי לקבוע את ה-LOD של השיטה, הכינו חמישה דילולים סדרתיים ביחס של 1:2, החל מ-25 µL של תמיסת העבודה של הפלסמיד, שהיא מרוכזת פי ארבעה מהריכוז האחרון בדילול עשירתי שהניב אות חיובי. הפלסמיד המשמש בשלב ההגברה נלקח מתמיסת עבודה של פלסמיד שהוכנה באזור ייעודי למניעת זיהום. זהו שלב קריטי.העבירו 5 µL מכל דילול של הפלסמיד לארבעה מבחנות המכילות 135 µL של חומר המקור השלילי, כדי לקבל ארבע חזרות עבור חמשת הסטנדרטים החיוביים. בצעו מיצוי של ארבע החזרות עבור חמשת הסטנדרטים החיוביים ובצעו את תהליך ההגברה כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. ספרו את מספר החזרות החיוביות מתוך שמונה חזרות עבור כל רמה של ריכוז פלסמיד.לבסוף, קבעו את שיטת ה-LOD, שהיא הרמה האחרונה שבה שמונה חזרות מתוך שמונה חזרות הן חיוביות. שיטת ה-RT-PCR הכמותית המתוארת בסרטון זה מזהה ומכמתה equid herpesvirus-2 בנוזלים נשמיים. בניסוי זה, בוצעו דילולות סדרתיות פי עשרה כדי להעריך את אזור ההפחתה, שנמצא בין דילולות של 10⁻⁹ ל-10⁻¹⁰.ערך ה-LOD PCR נקבע באמצעות סדרת דילול חדשה פי שניים באזור ההפחתה. כדי לקבוע את טווח הליניאריות ואת ה-LOQ PCR, נעשה שימוש בערך ה-LOD PCR כדי להתחיל טווח של שש דילולים סדרתיים פי עשרה בין 2.6, ערך ה-LOD PCR, לבין 260,000 עותקים ל-2.5 microliters של דגימה. ה-LOQ PCR הוא הריכוז הנמוך ביותר בטווח הליניאריות.אפיון השיטה השלמה כולל את תיקוף כל השלבים הדרושים להשגת נתוני qRT-PCR, החל מהפקת DNA מדגימה נשימתית ועד להגברה וכמות של המטרה. הביצועים הכמותיים של שיטת הניתוח השלמה של ה-qRT-PCR הוערכו ותוקפו עם פרופיל דיוק המוצג בגרף זה. עומסי הגנום הוויראלי של EHV2 ב-172 דגימות של מטוחי אף מסוסים עם הפרעות נשימה כומתו כפי שמוצג כאן.עומסי הגנום הוויראלי היו גבוהים יותר בסוסים צעירים, כאשר העומס הגבוה ביותר שזוהה היה 1.9 times 10 to the 11th עותקים למילליליטר. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בפחות משעתיים לכל שלב הגברה, וניתן לבצע את סך שלבי התיקוף בפחות מארבעה שבועות אם הם מבוצעים כראוי. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מסכנת זיהום, במיוחד בעת עבודה עם תמיסת פלסמיד.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף על מנת לענות על שאלות נוספות כמו זיהוי הגנום. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע מיצוי והגברה של DNA ואפיון עתודות ה-PCR שלהם. זכרו שעבודה עם דגימות ביולוגיות כמו פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר.יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במנדף ובאזור ברמת אבטחה מותאמת, בעת ביצוע הליך זה.

development-validation-quantitative-pcr-method-for-equid-herpesvirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

מחקר זה מתאר את האבחנה של שפעת העופות בעופות בר באמצעות מערכת ניידת rRT-PCR. השיטה מנצלת מיובשים בהקפאה ריאגנטים למסך ציפורי בר בסביבה הלא במעבדה, תרחיש טיפוסי של התפרצות. שימוש בכלים מולקולריים מספק חלופות מדויק ורגיש לאבחון מהיר.

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

סרטון זה מדגים שיטה כמותית לזיהוי זיהום ויראלי באמצעות PCR שעתוק לאחור בזמן אמת. שלב השעתוק ההפוך ממיר את הרנ"א ל-cDNA, אשר לאחר מכן מוגבר באמצעות מחזורי PCR. נוכחותו של RNA ויראלי במדגם מאושרת על ידי ניתוח עקומות ההגברה והדיסוציאציה של ה- DNA המתקבל מה- PCR.

PCR כמותי בזמן אמת לאבחון זיהומים ויראליים

ב-15 השנים האחרונות, וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 (CAV2) הוכיחו את יעילותם בהתמרת תאים במבחנה וב-vivo ונמצאים בשימוש נרחב לחיסון וריפוי גנטי. כאן, אנו מתארים הליך לבנייה, ייצור וטיהור של וקטורי CAV2, מה שמוליד תרחיפים נגיפיים בעלי טיטר גבוה.

ייצור וטיהור של וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 שאינם משוכפלים

בדיקות תפוקה גבוהה של פתוגנים מבוססים DNA ו- RNA על ידי ננו PCR מתוארות באמצעות כלבים syndromic ולוח PCR נשימת סוסים.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.

Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

אנו מציגים פרוטוקול מלאה לאבחון שלאחר המוות של כלבת בעלי חיים תחת תנאי שדה באמצעות מבחן חיסוני מהיר האבחון (RIDT), מן הבדיקה ביופסיה המוח לפרשנות הסופי. אנו גם לתאר יישומים נוספים באמצעות המכשיר לניתוח מולקולרי הגנוזות ויראלי.

שדה הנתיחה לאחר המוות חיסוני מהיר מבחן אבחון עבור הגדרות מוגבלות משאב עם יישומים מולקולריים נוספים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ותיקוף של שיטות מעבדה טובות בזיהוי תואם של וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית לתמיכה בפיתוח קליני של וקטורים של ריפוי גנטי.

בדיקת תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי טיפתי לזיהוי וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו במחקרי שפיכה ביולוגית של דמעות

למד שיטת PCR כמותי לאבחון Equine herpesvirus-2 בנוזלי נשימה של סוסים. השיטה מספקת נתונים כמותיים רגישים וספציפיים לתמיכה באבחון מחלות נשימה.

פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

גלה סרטונים נוספים