פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

המטרה הכוללת של שיטת qPCR היא להעריך את העומס הנגיפי של וירוס הרפס סוסים-2 בדגימות ביולוגיות מסוסים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האבחון של מחלות נשימה בסוסים, נתונים כמותיים על עזרי פרשנות חדשים למטפלים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא רגישה, ספציפית ושיטה מהירה.

יתרון נוסף הוא הפיתוח על פי AFNOR norme NF U47-600, שהוא הנציג הצרפתי בוועדת הנורמליזציה הבינלאומית. תדגים את ההליך אריקה הואה, חוקרת צעירה מהיחידה שלי. כדי לחלץ חומצות גרעין מדגימה ביולוגית של נוזלי נשימה, מתחת למכסה אדים התחל בהוספת 140 מיקרוליטר של דגימה ביולוגית ל-560 מיקרוליטר של תמיסת ליזה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

הוסף 560 מיקרוליטר אתנול לדגימה, והחל 630 מיקרוליטר מהתמיסה הכוללת על עמוד סיליקה וצנטריפוגה. מרחו שוב את 630 המיקרוליטרים הנותרים על עמוד הסיליקה והצנטריפוגה. לאחר החלת הדגימה על העמודה, השתמש ב-500 מיקרוליטר כל אחד ממאגרי הכביסה AW1 ו-AW2 כדי לשטוף את העמודה פעמיים.

לאחר מכן, כדי לנטרל את חומצות הגרעין מהעמודה, הוסף 50 מיקרוליטר של פליטת טמפרטורת החדר או מאגר AVE. סוגרים את המכסה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך דקה. ואז צנטריפוגה ב -6, 000 גרם למשך דקה.

כדי להגביר את ה-DNA, לאחר טיטרציה של הפריימרים והגשושית על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו 22.5 מיקרוליטר של תערובת תגובה לכל תגובה על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PCR, 20 פריימרים מיקרו-מולאריים קדימה ואחורה, 10 מיקרו-מולרי של הגשושית, ומספיק מים טהורים במיוחד כנדרש כדי להגיע ל-22.5 מיקרוליטר. כדי למנוע זיהום, הכינו תמיד את תערובת תגובת ה-PCR באזור מסוים. Aliquot 22.5 מיקרוליטר של תערובת התגובה המתאימה לכל באר תגובה של צלחת 96 בארות.

כלול בקרות שליליות למיצוי ו-PCR כדי להבטיח שאף אחד מהריאגנטים אינו מזוהם ב-DNA לא רצוי. לאחר מכן הוסף 2.5 מיקרוליטר של הדגימה, הבקרה השלילית של המיצוי, הבקרה השלילית של ה-PCR או דגימת הבקרה החיובית לבארות התגובה המתאימות. לאחר מכן השתמש בחותם צלחת דבק כדי לכסות את הצלחת.

וצנטריפוגה במשקל 6,000 גרם למשך 10 שניות. הנח את הצלחת במערכת PCR בזמן אמת. לאחר מכן בחר את התבנית עבור פריסת הבדיקה והגדרות תוכנית ה-PCR המוצגות כאן, והתחל את הריצה.

לאחר העברת הנתונים הגולמיים ממערכת ה-PCR בזמן אמת לגיליון אלקטרוני, הגדר את הסף בעלילות ההגברה מעל קו הבסיס ובתוך אזור הגידול האקספוננציאלי כדי לקבל את מחזור הסף עבור כל דגימה. התווה כל תקן נקודה שנקבע כעקומה סטנדרטית כדי להשיג ליניאריות. לאחר מכן חשב את מספר העותק עבור הדגימות השונות על סמך העקומה הסטנדרטית.

כדי לקבוע את גבול הזיהוי של תוצאות qRT-PCR, החלק 90 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד לשישה צינורות. כדי להכין שישה דילולים סדרתיים פי עשרה של הפלסמיד כדי למקד לאזור ההפחתה, התחל בהעברת 10 מיקרוליטר מדילול העבודה של הפלסמיד לצינור עם 90 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. מערבולת קצרה וצנטריפוגה את הצינור.

לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר מהצינור לצינור המים הבא. לאחר מערבולת וצנטריפוגה חזור על ההעברה עד שכל צינורות המים מקבלים את הפלסמיד. לאחר הגברת ה-DNA בששת הדילולים הסדרתיים פי עשרה כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה, קבע את אזור ההפחתה, שהוא הדילול האחרון של הפלסמיד המייצר אות חיובי ואת הדילול הראשון ללא הזיהוי.

להכנת שישה דילולים סדרתיים כפולים, הוציאו 25 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד לשישה צינורות. מהדילול האחרון של הפלסמיד שנתן אות חיובי מהדילולים פי עשרה, העבירו 25 מיקרוליטר מהצינור לצינור המים הראשון. מערבולת וצנטריפוגה לפני הכנת חמשת הדילולים הנותרים כפי שהודגם זה עתה.

הגבירו את ה-DNA מהדילולים הסדרתיים הכפולים כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. לאחר הגברת ה-DNA משלושת הניסויים הבלתי תלויים חשב את מספר השכפולים החיוביים מתוך 24 שכפולים עבור כל רמה של ריכוז פלסמיד. קבע את ה-LOD בביטחון של 95 אחוז או LOD 95 אחוז PCR, שהיא הרמה שמביאה לזיהוי של 23 שכפולים חיוביים מתוך 24 שכפולים.

כדי לקבוע את ה-LOD של השיטה: הכן חמישה דילולים סדרתיים כפולים החל מ-25 מיקרוליטר של דילול העבודה של הפלסמיד שהוא מרוכז פי ארבעה מהריכוז האחרון מדילול פי עשרה שנתן אות חיובי. הפלסמיד המשמש בשלב ההגברה מגיע מדילול עבודה של פלסמיד שהוכן באזור ספציפי כדי למנוע זיהום. זה צעד קריטי.

העבר 5 מיקרוליטר מכל דילול של פלסמיד לארבעה צינורות עם 135 מיקרוליטר של חומר המשאב השלילי כדי להשיג ארבעה שכפולים של חמשת התקנים החיוביים. בצע חילוץ של ארבעת השכפולים עבור חמשת התקנים החיוביים ובצע את הליך ההגברה כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. ספור את מספר השכפולים החיוביים מתוך שמונה שכפולים עבור כל רמה של ריכוז פלסמיד.

לבסוף, קבע את שיטת LOD, שהיא הרמה האחרונה שבה שמונה שכפולים מתוך שמונה שכפולים הם חיוביים. שיטת ה-RT-PCR הכמותית המתוארת בסרטון זה מזהה ומכמתת את וירוס ההרפס-2 בנוזלי הנשימה. בניסוי זה, נעשו דילולים סדרתיים פי עשרה כדי להעריך את אזור ההפחתה, שנמצא בין דילולים 10 ל-9 השלילי ו-10 ל-10 השלילי

ערך ה-LOD PCR נקבע באמצעות דילול טורי כפול חדש באזור ההפחתה. כדי לקבוע את טווח הליניאריות ו-LOQ PCR ערך ה-LOD PCR שימש להתחלת הטווח של שישה דילולים טוריים פי עשרה בין 2.6, ערך ה-LOD PCR, ו-260,000 עותקים לכל 2.5 מיקרוליטר דגימה. ה-LOQ PCR הוא הריכוז הנמוך ביותר בתחום הליניאריות.

האפיון של השיטה כולה הוא אימות של כל השלבים הדרושים להשגת נתוני qRT-PCR מהפקת DNA מדגימת הנשימה, ועד להגברה וכימות של המטרה. הביצועים הכמותיים של השיטה האנליטית השלמה qRT-PCR הוערכו ואומתו באמצעות פרופיל דיוק המיוצג בגרף זה. הגנום הנגיפי של EHV2 נטען ב-172 דגימות ספוגית אף מסוסים עם הפרעות נשימה כאשר כומתו כפי שמוצג כאן.

עומסי הגנום הנגיפי היו גבוהים יותר בסוסים צעירים, כאשר העומס הגבוה ביותר זוהה ב-1.9 פעמים 10 עד 11 עותקים למיליליטר. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעתיים לכל שלב הגברה, וניתן לבצע את סך שלבי האימות תוך פחות מארבעה שבועות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מסכנת זיהום, במיוחד בעבודה עם תמיסת פלסמיד.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף על מנת לענות על שאלות נוספות כמו זיהוי גנום. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע מיצוי והגברה של DNA ולאפיין את עתודות ה-PCR שלהם. אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות כמו פתוגנים יכולה להיות מסוכנת ביותר.

תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות מסוימים כגון עבודה במכסה המנוע, ואזור רמת אבטחה מותאם בעת ביצוע הליך זה.