פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

המטרה הכללית של שיטת ה-qPCR היא להעריך את העומס הנגיפי של equine herpesvirus-2 בדגימות ביולוגיות מסוסים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי האבחון של מחלות נשימה בסוסים, ובאספקת נתונים כמותיים עבור עזרים פרשניים חדשים לבעלי מקצוע. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היותה רגישה, ספציפית ומהירה.

יתרון נוסף הוא הפיתוח בהתאם לתקן AFNOR norme NF U47-600, המייצג הצרפתי בוועדה לנורמליזציה בינלאומית. את הפרוצדורה תדגים אריקה הו, חוקרת צעירה מהיחידה שלי. כדי למצות חומצות גרעיניות מדגימה ביולוגית של נוזלי נשימה, התחילו בתוך מנדף כימי בהוספת 140 µL של דגימה ביולוגית ל-560 µL של תמיסת ליזיס, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

הוסיפו 560 µL של אתנול לדגימה, והעבירו 630 µL מכלל התמיסה לעמודת סיליקה וסובבו בצנטריפוגה. העבירו את 630 µL הנותרים לעמודת הסיליקה וסובבו בצנטריפוגה שנית. לאחר העברת הדגימה לעמודה, השתמשו ב-500 µL מכל אחד מתוספי השטיפה AW1 ו-AW2 כדי לשטוף את העמודה פעמיים.

כדי לאלואציית החומצות הגרעיניות מהעמודה, הוסף 50 µL של תמיסת elution או באפר AVE בטמפרטורת החדר. סגור את הפקק והדגר בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה ב-6,000 ×g למשך דקה אחת.

כדי להגביר את ה-DNA, לאחר תיתוח הפריימרים והפרובה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו 22.5 µL של תערובת תגובה עבור כל תגובה על ידי הוספה של 12.5 µL של PCR master mix, פריימרים קדמיים ואחוריים בריכוז 20 µM, פרובה בריכוז 10 µM, וכמות מספקת של מים אולטרה-טהורים כנדרש כדי להגיע לנפח של 22.5 µL. כדי למנוע זיהום, הכינו תמיד את תערובת תגובת ה-PCR באזור ייעודי. חלקו 22.5 µL מתערובת התגובה המתאימה לכל באער תגובה בלוח של 96 באערים.

יש לכלול ביקורות שליליות לתהליכי המיצוי וה-PCR כדי להבטיח שאף אחד מהריאגנטים אינו מזוהם ב-DNA לא רצוי. לאחר מכן, יש להוסיף 2.5 µL מהדגימה, מביקורת השלילית של המיצוי, מביקורת השלילית של ה-PCR או מדגימת הביקורת החיובית לבארי התגובה המתאימים. לאחר מכן, יש לכסות את הפלטה באמצעות מדבקה לאטימה (adhesive plate seal).

סבבו בצנטריפוגה ב-6,000 gs למשך 10 שניות. הניחו את הפלטה במערכת real-time PCR. לאחר מכן, בחרו את התבנית עבור פריסת הבדיקה ואת הגדרות תוכנית ה-PCR המוצגות כאן, והפעילו את הריצה.

לאחר העברת הנתונים הגולמיים ממערכת ה-real-time PCR לגיליון אלקטרוני, הגדירו את הסף (threshold) בגרפי ההגברה מעל קו הבסיס (baseline) ובתוך אזור הצמיחה המעריכית כדי לקבל את מחזור הסף (threshold cycle) עבור כל דגימה. שרטטו את סדרת התקנים כעקומת תקן כדי להשיג ליניאריות. לאחר מכן, חשבו את מספר העותקים עבור הדגימות השונות על בסיס עקומת התקן.

כדי לקבוע את גבול הגילוי של תוצאות ה-qRT-PCR, העבירו 90 µL של מים אולטרה-טהוריםים לשש מבחנות. כדי להכין שש דילול נסיגתיים פי 10 של הפלסמיד למטרת איתור אזור הדילול (abatement zone), התחילו בהעברה של 10 µL מהדילול העובד של הפלסמיד למבחנה המכילה 90 µL של מים אולטרה-טהוריםים. ערבבו קצרות במערבל Vortex וסובבו את המבחנה בצנטריפוגה.

לאחר מכן, העבירו 10 microliters מהמבחנה למבחנת המים הבאה. לאחר ערבוב ב-vortex וסבוב בצנטריפוגה, חזרו על ההעברה עד שכל מבחנות המים יכילו את הפלסמיד. לאחר הגברת ה-DNA בשש הדילוליות הסיריאליות של פי עשרה כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה, קבעו את אזור ההפחתה (abatement zone), שהוא הדילול האחרון של הפלסמיד המפיק אות חיובי והדילול הראשון ללא זיהוי.

להכנת שישה דילולים סדרתיים ביחס של 1:2, העבירו 25 µL של מים אולטרה-טהוריםים לשש מבחנות. מהדילול האחרון של הפלסמיד שהניב אות חיובי בדילולים העשוריים, העבירו 25 µL מהמבחנה למבחנת המים הראשונה. ערבבו במערבל Vortex וסובבו בצנטריפוגה לפני הכנת חמשת הדילולים הנותרים, כפי שהודגם כעת.

בצע הגברה של ה-DNA מהדילולות הסדרתיות הדו-מכפלות כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. לאחר הגברת ה-DNA משלושת הניסויים הבלתי תלויים, חשב את מספר החזרות החיוביות מתוך 24 חזרות עבור כל רמת ריכוז של הפלסמיד. קבע את ה-LOD ברמת ביטחון של 95 אחוזים או LOD 95 percent PCR, שהיא הרמה המובילה לזיהוי של 23 חזרות חיוביות מתוך 24 חזרות.

כדי לקבוע את ה-LOD של השיטה, הכינו חמישה דילולים סדרתיים ביחס של 1:2, החל מ-25 µL של תמיסת העבודה של הפלסמיד, שהיא מרוכזת פי ארבעה מהריכוז האחרון בדילול עשירתי שהניב אות חיובי. הפלסמיד המשמש בשלב ההגברה נלקח מתמיסת עבודה של פלסמיד שהוכנה באזור ייעודי למניעת זיהום. זהו שלב קריטי.

העבירו 5 µL מכל דילול של הפלסמיד לארבעה מבחנות המכילות 135 µL של חומר המקור השלילי, כדי לקבל ארבע חזרות עבור חמשת הסטנדרטים החיוביים. בצעו מיצוי של ארבע החזרות עבור חמשת הסטנדרטים החיוביים ובצעו את תהליך ההגברה כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה. ספרו את מספר החזרות החיוביות מתוך שמונה חזרות עבור כל רמה של ריכוז פלסמיד.

לבסוף, קבעו את שיטת ה-LOD, שהיא הרמה האחרונה שבה שמונה חזרות מתוך שמונה חזרות הן חיוביות. שיטת ה-RT-PCR הכמותית המתוארת בסרטון זה מזהה ומכמתה equid herpesvirus-2 בנוזלים נשמיים. בניסוי זה, בוצעו דילולות סדרתיות פי עשרה כדי להעריך את אזור ההפחתה, שנמצא בין דילולות של 10⁻⁹ ל-10⁻¹⁰.

ערך ה-LOD PCR נקבע באמצעות סדרת דילול חדשה פי שניים באזור ההפחתה. כדי לקבוע את טווח הליניאריות ואת ה-LOQ PCR, נעשה שימוש בערך ה-LOD PCR כדי להתחיל טווח של שש דילולים סדרתיים פי עשרה בין 2.6, ערך ה-LOD PCR, לבין 260,000 עותקים ל-2.5 microliters של דגימה. ה-LOQ PCR הוא הריכוז הנמוך ביותר בטווח הליניאריות.

אפיון השיטה השלמה כולל את תיקוף כל השלבים הדרושים להשגת נתוני qRT-PCR, החל מהפקת DNA מדגימה נשימתית ועד להגברה וכמות של המטרה. הביצועים הכמותיים של שיטת הניתוח השלמה של ה-qRT-PCR הוערכו ותוקפו עם פרופיל דיוק המוצג בגרף זה. עומסי הגנום הוויראלי של EHV2 ב-172 דגימות של מטוחי אף מסוסים עם הפרעות נשימה כומתו כפי שמוצג כאן.

עומסי הגנום הוויראלי היו גבוהים יותר בסוסים צעירים, כאשר העומס הגבוה ביותר שזוהה היה 1.9 times 10 to the 11th עותקים למילליליטר. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בפחות משעתיים לכל שלב הגברה, וניתן לבצע את סך שלבי התיקוף בפחות מארבעה שבועות אם הם מבוצעים כראוי. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מסכנת זיהום, במיוחד בעת עבודה עם תמיסת פלסמיד.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף על מנת לענות על שאלות נוספות כמו זיהוי הגנום. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע מיצוי והגברה של DNA ואפיון עתודות ה-PCR שלהם. זכרו שעבודה עם דגימות ביולוגיות כמו פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר.

יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במנדף ובאזור ברמת אבטחה מותאמת, בעת ביצוע הליך זה.