Name: הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: למד את פרוטוקול CLARITY/CUBIC להדמיית סיבים סרוטונרגיים בחוט השדרה של עכבר. שיטה זו מאפשרת תצפית תלת-ממדית של סיבים אלה במצבם הטבעי ומספקת תובנות חדשות לגבי ארגון מערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המצוינות של מועצת המחקר האוסטרלית לתפקוד מוחי אינטגרטיבי (ARC Centre Grant CE140100007), מענק פרויקט NHMRC (#1086643). פרופ' ג'ורג' פקסינוס נתמך על ידי מענק עמית מחקר ראשי בכיר של NHMRC (#1043626).

משפט ואתיקה: כל הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים לעקוב אחר ההנחיות של טיפול בבעלי חיים ועדת האתיקה (ACEC) מאוניברסיטת ניו סאות &#39;ויילס (מספר ACEC שאושרה הינה 14 / 94a). 1. הכנה של חוט השדרה עכבר שקוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון הידרוג&#39;ל קר קרח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון paraformaldehyde 16% (PFA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 16 גרם אבקת paraformaldehyde לתוך 70 מ&quot;ל מים מזוקקים מחומם מראש (50-55 מעלות צלזיוס) ומערבבים על בוחש מגנטי מחוממת עד paraformaldehyde נמס. הערה: אל תאפשר הפתרון לחמם מעל 55 מעלות צלזיוס ולהיות מודעים לכך paraformaldehyde הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון paraformaldehyde כדי גליל ולהוסיף מים מזוקקים עד 100 מ&quot;ל. מצננים את הפתרון paraformaldehyde באמצעות מקרר 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 125 מ&quot;ג יוזם VA-044 ב 26.25 מ&quot;ל מים מזוקקים ו לקרר את הפתרון בתוך 4° מקרר C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון acrylamide מגניב 5 מ&quot;ל (40%), 1.25 מ&quot;ל פתרון Bis (2%) (זהירות: Bis ופתרונות acrylamide רעילים, עלול לגרום למומים גנטיים או סרטן), 5 מ&quot;ל 10x PBS, 12.5 מ&quot;ל 16% פתרון PFA, ואת פתרון יוזם VA-044 על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל הפתרונות שהוצעו על הקרח. הערה: הנפח הכולל הוא 50 מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף וגבייה של קורד עכבר השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש עכבר עם זריקה intraperitoneal של קטמין (80 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xyzaline (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) מדולל מלוחים 0.9% נורמלי. המינון לעכבר יכול להיות נמוך מזה של חולדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על משטח פלסטיק מתאים במנדף, לתקן את הגפיים של העכבר מהגוף (סרט דביק יעיל) פעם העכבר אינו מגיב קמצוץ כדי עורו של כף הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור העכבר מעל החזה ואחר כך בחזה העצם כדי לחשוף את הלב עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משאבת peristaltic, עם מחט 25 G מצורף thסוף הדואר של צינורות, הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי של הלב, לגזור אטריום הזכות ליצור נקודת יציאה בדם ולאחר מכן להתחיל כביסה עם 40 מ&quot;ל 0.9% מלח רגיל בשיעור של כ -10 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשיושלם, perfuse את העכבר עם 35 פתרון הידרוג&#39;ל קר מ&quot;ל קרח. הערה: perfuse במהירות של 10 מ&quot;ל / דקה, כדי למנוע נפיחות של רקמת העצבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את העור על הגב עם להב ולאחר מכן להסיר את השרירים ליד החוליות. לאחר חיתוך קשתות בחוליות בצד אחד מרפרף אותם לצד השני, לקחת חוט השדרה מתוך עמוד השדרה עם מספריים בסדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי חוט השדרה עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חוט השדרה 15 מ&quot;ל של תמיסת הידרוג&#39;ל לילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 מ&quot;ל של פתרון הידרוג&#39;ל ויוצקים את שאר הפתרון עם מגזרים חוט השדרה אל צינור 5 מ&quot;ל. מלאו את צינור 5 מ&quot;ל עם הפתרון הידרוג&#39;ל עד שהוא לגמרי מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתוח חתיכה קטנה של parafilm על גבי הצינור 5 מ&quot;ל ולאחר מכן לעטוף parafilm סביב הצוואר של הצינור. הערה: ודא המגעים parafilm הפתרון הידרוג&#39;ל ואין בועות בין פתרון הידרוג&#39;ל ואת parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינור 5 מ&quot;ל ב 37 &#160; מעלות צלזיוס בתנור למשך הלילה. שימו הפתרון הידרוג&#39;ל עד שזה הופך ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצינור 5 מ&quot;ל מהתנור ולהסיר את הג&#39;ל מהצינור עם ברגים (כגון קצה פיפטה גרפו 1 מ&quot;ל). הסר את הג&#39;ל רקמה חוט השדרה על ידי דבק הרקמות הגסות הג&#39;ל ולאחר מכן לקחת את הרקמה הגסה משם (הג&#39;ל ידבק הרקמה ולכן יוסר על ידי הרקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת הג&#39;ל רקמת חוט השדרה, לשטוף את חוט השדרה 4 פעמים עם PBS 1x (pH 7.4) במשך 24 שעות על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון סליקה מעוקב ידי המסת אוריאה 3.85 גרם ו 3.85 גרם N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediam<html> ine ב 5.38 מ&quot;ל מים מזוקקים. הערה: בוחש חם משמש. להוסיף פוליאתילן גליקול 2.31 גרם האתר מונו-p-isooctylphenyl / טריטון X-100 הפתרון פעם ברור מתקרר לטמפרטורת החדר. הערה: 10 גרם של שלושה כימיקלים אלה הם לעכבר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חוט השדרה עכבר coronally לתוך 2-3 מקטעים ארוכים מ&quot;מ עם סכין גילוח ולשים אותם לתוך 5 מ&quot;ל של הפתרון סליקה מעוקב לעיל. מניחים על שייקר בתנור ב 37 &#160; ° צלזיוס במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לאחר מכן, לשנות את הפתרון וסליקה אחד טרי. הערה: הפתרון מעל מוכן לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שניים עד שלושה ימים לאחר מכן לאחר רענון פתרון הסליקה מעוקב, לבדוק את השקיפות של הרקמה כנגד נייר עם גופן 8 אותיות. אם הוא שקוף, האותיות ניתן לראות דרך רקמת פינה. הסר את פתרון הסליקה ולהוסיף 4 מיליליטר של PBST (0.1% Triton-X100) כדי לשטוף את הרקמה 4 פעמים ביום (כל 6 שעות). </li></ol></li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת מגזרי חוט שדרת פתרון הנוגדן הראשוני (-סרוטונין אנטי, וגדל ארנב, מדולל 1: 100 ב PBST) במשך 3 ימים על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון נוגדן ולהוסיף 4 מ&quot;ל של PBST (0.1% Triton-X100) לשטוף את פלחי חוט השדרה 4 פעמים ביום (כל 6 שעות) בתנור 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון PBST ולהוסיף הפתרון נוגדנים משני (594 IgG מצומדות עז נגד ארנב, מדולל 1: 100 ב PBST) כדי לדגור הרקמה במשך 3 ימים על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון נוגדנים משני ולהוסיף 4 מיליליטר של PBST לשטוף מגזרי חוט השדרה 4 פעמים ביום (כל 6 שעות) על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס. למחרת הרקמה מוכנה הדמיה. </li></ol> הדמיה 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון PBST ולהוסיף 4 מ&quot;ל של גליצרול 85% על מנת להפוך את מקדם השבירה של הרקמה אפילו. </li><li&gt; בדקי את הבהירות של הרקמה. לאחר ברור נע בין 1 hr, לשים את הרקמה על גבי זכוכית נושאת גדולה, דקה אשר מתאימה את המסגרת החזקה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-צילום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים כמה טיפות של גליצרול 85% ליד רקמת חוט השדרה ו coverslip אותו עם כוס coverslip 22 x 50 מ&quot;מ 2. הערה: הכיוון של חוט השדרה מחליט כיצד התמונה נראית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השקופית זכוכית על מסגרת ההחזקה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון ולהעביר את הרקמה לתוך מסלול האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ננומטר לייזר נאון הליום קו 594 ולהתאים את עוצמת הלייזר לרמה אופטימלית על ידי בדיקת הבהירות של איתות חיובי בתמונה חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את אזור הסריקה של רקמת חוט השדרה באמצעות המטרה 20X (במים, NA 0.7) ולהכין ליצור Z- מחסנית, ואת העומק של כל שלב מוגדר 3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הרקמה מלמעלה לתחתית הערימה-z תחת objec 20Xמגני אוזניים ואז המטרה 63X (בשמן, NA 1.4) (גודל הצעד היה 1 מיקרומטר), בהתאמה. לשחזר קטעי וידאו 3D באמצעות תוכנת 3D 28. </li></ol>

<ol><li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs%3A+partial+involvement+of+serotonergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li>
<li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li>
<li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li>
<li>Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+serotonin+metabolism+within+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+during+nucleus+raphe+magnus+stimulation%2C+as+revealed+by+in+vivo+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection.</a> Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).</li>
<li>Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+serotonin+release+in+the+rat%27s+lumbar+spinal+cord+following+electrical+stimulation+of+the+nucleus+raphe+magnus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus.</a> Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).</li>
<li>Bullitt, E., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+course+of+descending+serotoninergic+pathways+innervating+the+rodent+dorsal+horn+and+lamina+X%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X.</a> J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).</li>
<li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord%3A+an+anterograde+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li>
<li>Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonergic+innervation+of+the+dorsal+horn+of+rat+spinal+cord%3A+light+and+electron+microscopic+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study.</a> J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).</li>
<li>Morrison, S. F., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+branching+patterns+and+funicular+trajectories+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons.</a> J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).</li>
<li>Barman, S. M., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axons+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons+branch+in+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord.</a> Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).</li>
<li>Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphespinal+projections+in+the+North+American+opossum%3A+evidence+for+connectional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity.</a> J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).</li>
<li>Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+serotonergic+projections+to+the+lumbar+spinal+cord+in+the+monkey+using+a+combined+retrograde+transport+and+immunocytochemical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique.</a> Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).</li>
<li>Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+somatotopic+organization+of+nuclei+projecting+via+the+dorsolateral+funiculus+in+rats%3A+a+retrograde+tracing+study+using+HRP+slow-release+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels.</a> Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY%3A+senile+plaques%2C+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781(2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsiriX%3A+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Digit+Imaging%22%5BJournal%5D)">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר מראה כיצד סיבי serotonergic תמונה בחוט השדרה עכבר עם CLARITY בשילוב וטכניקות מעוקב. הוא מציג תהליך סליקה מהר לעומת פרוטוקול הסליקה הפסיבי שפותח על ידי Cheung et al. 14 והתומר et al. 15 ומאפשר רקמת חוט השדרה כדי להיות נתמך היטב על ידי הידרוג&#39;ל במהלך סליקה. צעד חשוב במהלך קיבעון של חוט השדרה עכבר, כפי שדווח על ידי Cheung et al. 14 ותומ...

הקרנות על-עמוד השדרה אחראיות על אפנון התנהגויות מגוונות כגון תפיסת כאב. אחת ההקרנות הנושאות מידע נוסיספטיבי מכילה סיבים סרוטונינרגיים, שמקורם במוח האחורי ובגרעיני הרשתית הסמוכים1,2. מחקרים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים הראו שחרור מוגבר של סרוטונין בקרן הגב של חוט השדרה לאחר גירוי חשמלי של גרעיני הראפ במוח האחורי3-5. בחולדה ובאופוסום, לסיבי רפה-ספינל סרוטונרגיים יש מסופים צפופים, לא רק בקרן הגב6-8, אלא גם באזור הביניים7,9,10, קרן הגחון7,11, ואפילו למינה 1012,13. אין מחקרים דומים בעכבר. המחקר הנוכחי נועד למפות את דפוס הסיום של סיבים סרוטונרגיים הנובעים מגרעיני הרפ במוח האחורי וגרעיני הרשתית הסמוכים להם בחוט השדרה של העכבר באמצעות שיטת CLARITY14 שפורסמה לאחרונה ושינויה - CUBIC15. 
פלואורסצנציה קונבנציונלית או אימונוהיסטוכימיה של פרוקסידאז של חוט השדרה מראה בבירור את התפלגות הסיבים הסרוטונרגיים בחומר האפור של חוט השדרה בחתכים בעובי 30-40 מיקרומטר. עם זאת, גישה זו אינה מראה את ההמשכיות של דרכי הסיבים הסרוטונרגיים בחומר הלבן ואת הביטחונות שלהם בחומר האפור. למרות שהשחזור התלת מימדי של חתכים היסטולוגיים קידם את הידע שלנו על דרכי סיבים, זה נותר אתגר עבור היסטולוגים ואנטומיסטים לעקוב אחר מסלול בודד עקב עיוותים קטנים ברקמה הנגרמים על ידי חיתוך. כדי לעקוף את המכשול הזה, מספר חוקרים פיתחו פרוטוקולים שונים להפיכת מבנה הרקמה כולו לשקוף, ואיסוף תמונה של רקמה ללא שינוי בקובץ וידאו יחיד17-21. עד כה, טכניקת הידרוג'ל רקמות (CLARITY) שפותחה על ידי קבוצת 14,15 של Deisseroth, המוחלפת בשומנים, הכלאה של אקרילאמיד, תואמת הדמיה/צביעה חיסונית, שפותחה על ידי קבוצת14,15 של Deisseroth, כמו גם CUBIC, שפותחה על ידי Susaki et al16 הם המוצלחים ביותר. מאז פרסום הפרוטוקולים, חוקרים רבים החלו להשתמש בטכניקות אלה כדי לחקור היבטים שונים של רקמות ביולוגיות, כולל לא רק המוח22-25, אלא גם הלב, הכליות, המעיים והריאות26,27. 
על ידי קיבוע חוט השדרה של העכבר עם תמיסת ההידרוג'ל (CLARITY) וניקוי עם ריאגנטים CUBIC (שהיא שיטה מהירה בהרבה מזו שתוארה בפרוטוקול CLARITY המקורי14,15), גוש רקמת חוט השדרה באורך 2-3 מ"מ נוקה תוך שבועיים וצביעה אימונופלואורסצנטית לסרוטונין הושלמה תוך שמונה ימים. עם שילוב של חומרים כימיים בלבד, ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית כדי ליצור תמונה של דרכי סיבים בודדים בקובץ וידאו תלת מימדי תוך כחודש.

<table><tbody><tr><td>Photoinitiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>תמיסת אקרילאמיד 40%</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2% תמיסת ביס</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>סיגמא</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU אוריאה</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis (2-הידרוקסיפרופיל) אתילנדיאמין</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU נוגדן סרוטונין</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב עזים IgG (H+L), Alexa Fluor&reg; 594 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A-11012</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ רב פוטונים</td> https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 <td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש clarity / טכניקה מעוקבת

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

סיבי יורד ארוך אל חוט השדרה חיוני תנועה, תפיסת כאב, והתנהגויות אחרות. דפוס סיום סיבים בחוט השדרה של רוב מערכות סיבים אלה לא נחקר ביסודיות בכל מינים. סיבי serotonergic, אשר פרויקט אל חוט השדרה, נחקרו בחולדות ואופוסומים על סעיפים היסטולוגית המשמעות התפקודית שלהם כבר להסיק על סמך דפוס סיום סיבים שלהם בחוט השדרה. עם התפתחות CLARITY וטכניקות מעוקב, אפשר לחקור מערכת סיבים זה והפצתו בחוט השדרה, אשר צפוי לחשוף תכונות שלא היו ידועים קודם של מסלולים supraspinal serotonergic. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט הדמיה הסיבים serotonergic בחוט השדרה העכבר באמצעות CLARITY בשילוב וטכניקות מעוקב. השיטה כרוכה זלוף של עכבר עם פתרון הידרוג&#39;ל והבהרה של הרקמה עם COMBINation סליקת ריאגנטים. רקמת חוט שדרה נוקתה למשך קצת פחות משבועות, ואת מכתים immunofluorescent עוקב נגד סרוטונין הושלם בתוך פחות מעשרה ימים. עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון, הרקמה נסרקה תמונת 3D שוחזרה באמצעות תוכנת Osirix.

סעיף זה מציג תוצאות מכתים נוגדן סרוטונין במוח שדרת העכבר השקוף באמצעות שילוב של CLARITY ופרוטוקולים מעוקבים. אנו מראים כי סיבי serotonergic נוכח בכל הרבדים של חוט השדרה עם דומיננטיות בחלק הגחוני של צופר הגחון (איור 1, ראו גם וידאו 1). רקמת הביקורת לא צריך סיבים חיוביים (תוצאה הייתה לא מוצגת). בקרן הגחון, סיבים serotonergic צפופים נמצאים בחלק הוונטרומדיאלי של צופר הגחון והם להאריך לכיוון החלק הלטרלי של צופר הגחון <s...

הקרנות על-עמוד השדרה חשובות לתפיסת כאב והתנהגויות אחרות, וסיבים סרוטונרגיים הם אחת ממערכות הסיבים הללו. המחקר הנוכחי התמקד ביישום הפרוטוקול המשולב CLARITY/CUBIC על חוט השדרה של העכבר על מנת לחקור את סיום הסיבים הסרוטונרגיים הללו.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

המטרה הכללית של ניסוי CLARITY/CUBIC זה היא לחשוף את המאפיינים התלת-ממדיים של סיבים סרוטונינרגיים בחוט השדרה של העכבר, אשר אינם ניתנים לצפייה באמצעות היסטולוגיה מסורתית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירו-אנטומיה, כגון כיצד מפוזרים הסיבים הסרוטונינרגיים לאורך חוט השדרה? היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת צפייה בסיבים סרוטונינרגיים in situ, לצד זיהוי של וקטורים שאינם ניתנים לצפייה באמצעות היסטולוגיה מסורתית.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ארגון מערכת העצבים המרכזית, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כגון מערכת הלב וכלי הדם. ביקשנו להשתמש בשיטה זו לראשונה כאשר הגענו למגבלות בשימוש בשיטת סימון (tracing) מסורתית לניתוח סיבים סרוטונינרגיים בעמוד השדרה של עכבר. התחילו בקיבוע גפיו של עכבר מורדם למשטח ניתוח פלסטי בתוך מ 빠르게 מנדף.יש לוודא היעדר תגובה לצביטה בבהוות ובעזרת מספריים לפתוח את העור מעל בית החזה. לאחר מכן, יש לפתוח את בית החזה כדי לחשוף את הלב ולהחדיר מחט בקוטר 25 gauge המחוברת לצינור של משאבה פריסטלטית אל תוך החדר השמאלי. יש לגזור את העלייה הימנית כדי ליצור נקודת יציאה לדם.לאחר מכן, שטפו את הלב עם 40 milliliters של תמיסת מלח בריכוז 9% בקצב של כ-10 milliliters לדקה. כאשר כל הדם נשטף, בצעו פרפוזיה לבעל החיים עם 35 milliliters של הידרוג'ל קר שהוכן

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מיקרוסקופיה multiphoton של איברים שלמים עכבר ניתן על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה, אך לא כל הפרוטוקולים לשמר את אות הניאון של חלבוני ניאון. באמצעות שיטה אופטית סליקה עם התייבשות אתנול מבוסס ואלכוהול בנזיל: סליקה בנזואט נזיל, אנחנו מראים תמונות multiphoton ברזולוציה גבוהה של כל המוח של עכבר מביע YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

מקור: } Pekarek, B. T., et. al., הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)} בסרטון זה, אנו מדגימים את ההכנה, ההדמיה והניתוח של מוח עכבר מנוקה כדי לבחון סוכות דנדריטיות, מורפולוגיה של עמוד השדרה והתפלגות עצבית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וטכניקות שחזור תלת מימד.

הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית של סוכות דנדריטיות שלמות ומורפולוגיה של עמוד השדרה במוח עכבר נקי

כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים המסומנים בפלורסנט בתוך רקמות גדולות, באופן אידיאלי, יש לדמות את הדגימות הביולוגיות ללא חתך. 3DISCO הוא הליך ניקוי רקמות פשוט המבוסס על דגירה רציפה עם ממיסים אורגניים. עם הניקוי, האיברים הופכים שקופים ומאפשרים סריקת לייזר מקצה לקצה של הדגימה.

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

טכניקות ניקוי אופטי מחוללות מהפכה באופן שבו רקמות נראות. בדוח זה אנו מתארים שינויים בפרוטוקול המקורי של Clear Lipid-Hybridized Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) שמניב תוצאות עקביות יותר ופחות יקרות.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

מורפולוגיה דנדריטית עצבית לעתים קרובות עומדת בבסיס התפקוד. ואכן, תהליכי מחלה רבים המשפיעים על התפתחות הנוירונים באים לידי ביטוי עם פנוטיפ מורפולוגי. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ורבת עוצמה לניתוח ארבורים דנדריטיים שלמים ואת קוציהם הקשורים.

הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY

הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

טכניקות זעיר פולשניות ומכשיר מעבדה פשוט משפרים את יכולת השכפול של מודל הפגיעה בחוט השדרה על ידי הפחתת הנזק האופרטיבי לחיות הניסוי ומתן אפשרות לתחזוקה של המורפולוגיה האנטומית. השיטה כדאית משום שהתוצאות האמינות וההליך הניתן לשחזור מקלים על חקירת מנגנוני תיקון המחלה.

הקמת מודל פגיעה בעמוד השדרה של חבלה בעכבר המבוסס על טכניקה זעיר פולשנית

מחקר זה מציג פרוטוקול לחילוץ והכנה של דגימות מוח וחוט שדרה שלם עם אותות פלואורסצנטיים משומרים, המשפר את יעילות הניסוי ושלמות הנתונים כדי לקדם את המחקר במדעי המוח.

מיצוי וניקוי רקמות הכנת דגימות מוח-חוט שדרה של עכברים

למד את פרוטוקול CLARITY/CUBIC להדמיית סיבים סרוטונרגיים בחוט השדרה של עכבר. שיטה זו מאפשרת תצפית תלת-ממדית של סיבים אלה במצבם הטבעי ומספקת תובנות חדשות לגבי ארגון מערכת העצבים המרכזית.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

גלה סרטונים נוספים