בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין ולכמת את מספר התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפיים שחדרו למיקרו-סביבה המוקדמת של גידול המוח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה של גידולי מוח על ידי זיהוי גורמים חשובים לסחר של תאי חיסון היקפיים למיקרו-סביבה של גידול המוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מניבה נתונים כמותיים תלויי זמן על מספר ומצב ההפעלה של לויקוציטים שנכנסו למערכת העצבים המרכזית הזו.

לאחר הנחת עכבר מורדם לתוך מסגרת סטריאוטקטית, בצע חתך קו אמצע של שני סנטימטרים מעל הגולגולת מהעצם הקדמית לעצם העורפית באמצעות להב אזמל. לאחר מכן משוך את העור בחתך באמצעות מחזירי קוליברה. לאחר מכן, הורד מזרק מיקרוליטר המצויד במחט בגודל 33 ישירות מעל ה-bma.

התאם את מיקום המחט כדי להגיע לאתר היעד להשתלת הגידול. לאחר מכן השתמש במזרק טוברקולין של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 26 כדי לסמן מיקום זה על ידי הוצאה עדינה של הפריאוסטאום לאחר מכן. קדחו חור לתוך הגולגולת באתר היעד עם המקדח 0.8 מילימטר עד שהוא מגיע לדורה מאטר הבסיסי בזמן הקידוח.

הפעל לחץ לסירוגין ואחריו הסרה מהירה של המקדח ממשטח הגולגולת כדי למנוע חום וכוח מוגזמים. לאחר מכן, שטפו את מזרק המיקרוליטר עם 0.9% נתרן כלורי בצינור מיקרו פוליפרופילן חרוטי בנפח 1.7 מיליליטר כדי להבטיח שהמחט לא סתומה. העבירו בעדינות את צינור המיקרו-פוליפרופילן החרוטי בנפח 0.6 מיליליטר המכיל את תאי הגידול מספר פעמים כדי להחיות היטב את התאים.

לאחר מכן משכו שני מיקרוליטר של תאים למזרק המיקרוליטר וודאו שלא מוכנסות בועות אוויר למזרק. הוציאו מיקרוליטר אחד של התאים על כרית הכנה של אלכוהול איזופרופיל 70%, והשאירו בדיוק מיקרוליטר אחד של תאי גידול במזרק. לאחר מכן, הורידו את המחט למטה עד שהיא נוגעת בדורה מאטר.

לאחר מכן הורד את המחט 3.5 מילימטרים לתוך המוח, ולאחר מכן החזר את המחט ב -0.5 מילימטרים לאט וחלק. העבירו את התאים על ידי לחיצה על בוכנת המזרק במשך דקה עד שתיים. לבצע זלוף טרנס-קרדיאלי על העכבר המורדם עמוק.

הכנס מחט קהה לחדר השמאלי של הלב. השתמש בזוג מספריים קטן לדיסקציה כדי לחתוך את הפרוזדור הימני כדי לאפשר את הוצאת מערכת הדם של העכבר עם תמיסת טירו למשך מספר דקות עד שהכבד והריאות הלבינו לחלוטין מחוסר דם. ודא שאף כמות ברוטו של דם לא תמשיך לצאת מהפרוזדור הימני.

לפני הסרת המחט הקהה של רכזת האלומיניום בגודל 20 מהחדר השמאלי. לאחר הסרת המחט, שחרר את העכבר מגוש קצף הפוליסטירן המוקצף והפוך את הצד הגחוני של העכבר כלפי מטה. בעזרת מספריים גדולים לדיסקציה, הפרד את הראש משאר הגוף.

לאחר מכן חותכים את הקרקפת בקו האמצע בעזרת מספריים קטנים לדיסקציה הפועלים מהעצם העורפית לחוטם על מנת לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן החזירו את העור משני צידי הגולגולת והחזיקו את הגולגולת היטב. השתמש בזוג URS של עצם כדי לפרוץ בזהירות את הגולגולת החל מהעצם העורפית ולעבוד קדימה כדי לחשוף לחלוטין את המשטחים הגביים והצדדיים של המוח.

קצירת מוח העכבר מהגולגולת מבלי לגרום לו נזק עשויה להתגלות בתחילה כקשה. אלה שאינם מנוסים בטכניקה עשויים לרצות לנסות מספר פעמים לפני ביצוע ניסויים מתאימים. לאחר הסרת עצמות הגולגולת, סובב את ראש הצד הגחוני של העכבר כלפי מעלה.

חתוך את עצבי הגולגולת בבסיס המוח על מנת לשחרר אותו מהגולגולת. בהליך זה, באמצעות סכין גילוח חד קצוות נקי מבודדים את אזור המוח המכיל את הגידול על ידי ביצוע חתך סגיטלי במרכז המוח. כדי לנתח את שתי ההמיספרות, סובב את הצד המדיאלי של ההמיספרה המקבילה כלפי מטה ובצע חתך עטרה אחד במוח הקטן וחתך נוסף בנורת הריח כדי לבודד את רקמת המטרה המכילה את שתל הגידול.

לאחר מכן, הנח את רקמת המטרה במטחנת הרקמות המתכתית מזכוכית המכילה מיליליטר אחד של DPBS. דחוף את הבוכנה עד הסוף וסובב שבע פעמים כדי לשבש את הרקמה. לאחר מכן, הרם את הבוכנה כדי לאפשר לנוזל להתיישב בחזרה לתחתית מטחנת הרקמות.

חזור על שלב זה שלוש פעמים. עם זאת, סובב את הבוכנה רק ארבע פעמים במהלך שתי החזרות הבאות ושלוש פעמים במהלך החזרה האחרונה. כדי להימנע מטיפול יתר ברקמת המוח.

לאחר מכן מרחו שלושה נפחים של מיליליטר אחד של DPBS קר כקרח על דפנות הבוכנה כדי לשטוף את שאריות חומר המוח לתוך מטחנת הרקמות. לאחר מכן אנו משעים את חומר המוח TRID על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ומכניסים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר על קרח. שוטפים את דפנות מטחנת הרקמות למטה עם מיליליטר נוסף של DPBS קר כקרח ומוסיפים לאותו צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

שמור את כל הצינורות המכילים חומר מוח TRID על קרח עד שכל הדגימות מעובדות. לאחר מכן סובב את חומר המוח TRID בצינורות הצנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-740 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את חומר המוח הכדורי במיליליטר אחד של תערובת שהוכנה קודם לכן של קולגנאז ו-DNA אנזימי עיכול.

הנח את צינורות הצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר לתוך מתלה מבחנה והנח את המתלה באמבט מים CS בתא 37 מעלות למשך 15 דקות. לאחר מכן ערבב בעדינות את הדגימות פעמיים במהלך תקופת הדגירה על ידי הזזת הצינורות כדי להקל על פירוק הרקמות. לאחר מכן, הוסף שישה מיליליטר של DPBS קר לכל צינור כדי לדלל את אנזימי העיכול.

צנרת את זה למעלה ולמטה כדי להשעות ולסנן את הנפח הכולל דרך מסנני רשת ניילון סטריליים של 70 מיקרון לצינורות צנטריפוגה חדשים של 15 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, סובב את תרחיף תאי המוח כלפי מטה ב-740 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג כדור תא בודד. הסר את צינורות 15 מיליליטר מהצנטריפוגה והניח אותם על קרח.

לאחר מכן הגדל את הגדרת הטמפרטורה בצנטריפוגה לכ-21 מעלות צלזיוס כהכנה לשלב הבא. לאחר מכן, הסר לחלוטין את חגורת התא ותחילה השהה מחדש את כדורי התא במיליליטר אחד של מדיית צנטריפוגה בצפיפות של 70% באמצעות מיקרו פיפטה P 1000. לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר נוספים של מדיית צנטריפוגה בצפיפות של 70% לכל צינור.

חבשו את המכסים בצורה מאובטחת והומוגניזציה של תרחיף התאים על ידי היפוך עדין של הצינור מספר פעמים לאחר מכן העבירו את צינורות הצנטריפוגה של 15 מיליליטר המכילים תאי מוח תלויים בצפיפות של 70%. אמצעי צנטריפוגה מקרח למתלה מבחנה בטמפרטורת החדר בזה אחר זה. שכב בזהירות שני מיליליטר של תמיסת מדיית צנטריפוגה בצפיפות של 37% על חמשת מיליליטר של מדיית צנטריפוגה בצפיפות של 70% כדי ליצור ממשק נקי בין שתי שכבות מדיית הצנטריפוגה בצפיפות.

לאחר מכן סמן את מיקום הממשק בין שתי השכבות בטוש בעל קצה עדין כך שניתן יהיה לזהות אותו בקלות לאחר צנטריפוגה כאשר ההבחנה הופכת פחות ברורה. סובב את צינורות הצנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-740 פעמים G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ללא הפסקה. כדי למנוע שיבוש הממשק בין שכבות המדיה של צנטריפוגת הצפיפות לאחר מכן, אסוף את ה-pbmc שהצטברו בממשק בין שתי שכבות המדיה של צנטריפוגת הצפיפות על ידי הכנסת מיקרו פיפטה P 200 לתוך הצינור.

עוקפים בזהירות את שכבת השומנים פעם אחת ברמה של פס ה-PBMC, מחלצים לאט לאט 200 מיקרוליטר מפני השטח של שכבת המדיה הצנטריפוגה בצפיפות של 70% ומעבירים לצינור פקס פוליפרופילן המסומן בהתאמה על קרח. חזור על שלב זה פעם אחת כדי להשיג נפח כולל של 400 מיקרוליטר לדגימה. היכולת הניסיונית ליצור ממשק נקי בין שתי שכבות המדיה של צנטריפוגה בצפיפות היא קריטית לבידוד הניתן לשחזור של p BMCs.

יש לשפוך את אמצעי הצנטריפוגה בצפיפות של 37% לאט תוך כדי זווית הצינור 20 עד 30 מעלות מעל משטח הספסל. איור זה מציג את אסטרטגיית השער עבור שערי ניסוי טיפוסיים המוצבים על GR תאי מיאלואיד חיוביים חיוביים CD 11 B חיוביים המוצגים בשלב 5 ו-NK 1.1. תאי הרג טבעיים חיוביים המוצגים בשלב השישי מרובדים לאחר מכן על סמך ביטוי GZMB בשלבים חמישה ראשוניים ושישה ראשוניים בהתאמה.

באיור זה מדגים את הגודל הלימפואיד הקטן יותר של תאי הרג טבעיים חיוביים ל-GR 11 B חיובי ותאי הרג טבעיים חיוביים ל-FSCA לעומת SSCA מדגים את הגודל הלימפואיד הקטן יותר של תאי הרג טבעיים בהשוואה לאוכלוסייה המיאלואידית הגדולה יחסית בגודל הגדול יחסית, ובכך מספק אישור נוסף לזהותן של שתי תת-אוכלוסיות PBMC אלה. הנתונים כאן מראים כי השתלה של תאי גליומה של GL 26 sital one I לתוך הסינגן. מוח עכבר XC 57 שחור 6 J גורם במהירות לגיוס של CD 45 מספרי PBMC חיוביים המוצגים בקשר עם כל נקודת נתונים לאורך עקומת GL 26 sit GAL one I מייצגת את השראת הקיפול של הגידול החודר ל-pbmc מעל הבקרה.

GGL 26 יושב על גידולי NT בשעה שצוינה לאחר השתלת הגידול או HPI בהתבסס על קוקטייל הנוגדנים הספציפי ששימש בהדגמה GR תאי מיאלואיד חיוביים חיוביים CD 11 B ו-NK 1.1 תאי הרג טבעיים חיוביים הוכחו כנכנסים באופן ספציפי למיקרו-סביבת הגידול החסרה של GAL תוך 48 שעות מהשתלת הגידול. עם זאת, המספר הכולל של גליומה שחדרה לתאים מיאלואידים עלה בהרבה על זה של תאי הרג טבעיים. לאחר השליטה, המתודולוגיה מתוארת מקצירת המוח לזרימה.

ניתוח ציטומטרי יכול להתבצע תוך כשש שעות על ידי ניסוי אחד. חובה לנתח את כל הנפח של כל דגימת PBMC על ידי ציטומטר הזרימה על מנת להשיג השוואה הוגנת של המספר הכולל של ניסויים משלימים של גליומה החודרת ל-pbmc. ניתוח אימונוהיסטוכימי כזה עשוי להתבצע כדי לקבל נתונים מרחביים על חדירת תאי החיסון ולאפשר מדידה של גודל הגידול הכולל והמיקרואנטומיה בנקודות זמן התואמות את אלה שהוערכו באמצעות הליך זה.

טכניקה זו עשויה להיות מיושמת לחקר מודלים מגוונים של גידולי מוח, כולל אלה שנוצרו דה נובו עם שימוש באונקוגן המקודד DNA פלזמה ללא שינויים משמעותיים בהליך הכולל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תרחיפי תאי גליומה לסטריאוטקטי והשתל למוח עכבר, כיצד להעביר גידול בשפע, עכברים נושאי מוח, וכיצד לבודד ולהזרים ציטו באופן מטרי, לנתח גליומה החודרת לתאים חד-גרעיניים בדם היקפי.