נוהל הקלטת פוליגרפים למדידת שינה בעכברים
25 בינואר 2016
הרישום של אלקטרואנצפלוגרמה (EEG) ואלקטרומיוגרמה (EMG) בעכברים שמתנהגים בחופשיות הוא צעד קריטי למתאם התנהגות ופיזיולוגיה עם שינה וערות. הפרוטוקול הניסיוני המתואר כאן מספק מערכת מבוססת כבלים לרכישת הקלטות EEG ו-EMG בעכברים.
המטרה הכוללת של הליך רישום פוליגרפי זה היא לקבוע את מצב הערנות של עכברים ולמדוד את זמן הערות, שינה בתנועת עיניים מהירה או שינה בתנועת עיניים לא מהירה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כמעט בכל תחום במדעי המוח המבקש לתאם התנהגות ופיזיולוגיה עם פעילות של נוירונים בקליפת המוח בבעלי חיים מתנהגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה להקליט הרבה צמתים, אלקטרואנצפלוגרמה ואלקטרומיוגרמה וניתן לשלב אותה עם שתלי מוח אחרים כמו סיבים אופטיים וצינוריות עירוי.
הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מאוד מכיוון שהשתלת האלקטרודה צריכה להתבצע כראוי ואיכות האלקטרודה היא קריטית ביותר כדי לשפוט את המצבים הפיזיים. מי שידגים את ההליך יהיה יוקו טקאטה, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. לפני שמתחילים, יש לעקר את כל כלי הניתוח במעקר חרוזים חם.
לאחר שהעכבר אושר כמורדם על ידי צביטה בבוהן, גלח את השיער על הראש והצוואר. לאחר מכן, אבטח את הבית למסגרת הסטריאוטקסית וקבע את הראש בין שני מוטות האוזניים. לאחר מכן, מרחו משחת עיניים על העיניים כדי למנוע יובש.
המשך בניקוי העור המגולח עם קרצוף על בסיס אלכוהול ויוד. לאחר מכן, חתוך לאורך קו האמצע בעזרת אזמל כדי לחשוף את הגולגולת ולהדק את העור לצד באמצעות קליפסים כדי לשמור על אזור הניתוח פתוח. בעזרת חותך קרביד עם מקדחה של 0.8 מילימטר, צרו שני חורים.
שים חור אחד מעל אזור קליפת המוח הקדמית. שים את החור השני מעל האזור הקודקודי של ההמיספרה הימנית. לאחר מכן, בעזרת מברג של תכשיטן, הברג ברגי הקלטת EEG מנירוסטה לתוך החורים.
הכנס את הברגים בשניים עד שניים וחצי סיבובים בלבד כדי לקבל מיקום אפידורלי מעל קליפת המוח. הברגים לא צריכים להתנועע לאחר הכנסתם. זה חשוב מאוד.
כעת, תקן את מכלול האלקטרודות עם הפינים כלפי מעלה לגולגולת. יש לחבר את האלקטרודות ישר. השתמש במקלון צמר גפן כדי לעזור לאבטח את מיקום האלקטרודה ולהדביק את האלקטרודה באמצעות ציאנואקרילט ואחריו מלט דנטלי.
לאחר מכן, צרו חורים קטנים בטרפז והכניסו את אלקטרודת ה- EMG לחורים הללו. לאחר מכן, תפר את העור בחוט משי בקוטר 0.1 מילימטר. כעת, הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח אותו על כרית חום.
תן לעכבר זריקות תוך-צפקיות של אמפיצילין ומלוקסיקם ופקח על העכבר עד שהוא חוזר לשכיבה על החזה. לאחר מכן, שכן את העכבר לבד. שבוע לאחר השתלת האלקטרודות, העבירו את העכבר לכלוב ניסוי בתא הקלטה אטום לרעש.
אבטח את מכלול האלקטרודות EEG/EMG בעכבר לכבל הקלטה המחובר לטבעת החלקה. חבר את כבל ממיר ה-AD למסנן אותות EEG/EMG ampliifier המחובר לטבעת ההחלקה. השתמש בממיר AD כדי להמיר את האות לאות דיגיטלי של 128 הרץ ולבסוף, להקליט את האות למחשב.
הרגיל את העכבר במשך יומיים-שלושה בתא ההקלטה. אם רישום ה-EEG/EMG כולל מתן תרופות, טפל בעדינות בעכבר בכל יום כמו אלה שהיו שם מתן תרופה. לאחר מכן, הפעל את תוכנת ההקלטה EEG/EMG.
כדי להתחיל, לחץ על הכרטיסייה מידע על קובץ נתונים ולחץ על התיבה שליד שם הקובץ. הזן שם קובץ ולחץ על Save. לאחר מכן, מהכרטיסייה תנאי הקלטה, בחר את כל ערוצי ה-EEG/EMG שיש להקליט.
כמו כן, בחר את תדירות הדגימה תחת כרטיסייה זו. כעת, בכרטיסייה פרטי ערוץ, בדוק אם הערוצים שנבחרו מוצגים כהלכה. לאחר האישור, התחל את הרשומה על-ידי בחירה תחילה בכרטיסייה הגדרת שעון עצר.
לאחר מכן, לחץ על צג כדי להציג EEG ו-EMG. אם האותות מוצגים כהלכה, הגדר את זמן השעון להתחלה ולסיום ההקלטה באזור הטיימר הראשי. לאחר מכן, לחץ על צג כפתור כדי להתחיל את ההקלטה.
כעת, רשום את האותות בתנאי בסיס ובתנאי טיפול שונים במשך מספר ימים. בסיום הניסוי, המתת חסד של העכבר עם פנטוברביטל. הפעל את התוכנה לניתוח EEG/EMG.
פתח את הנתונים הגולמיים של EEG/EMG, שהם קובץ KCD. לחץ על הכרטיסייה שינה והגדר את זמן ה-Epoch ל-10 שניות. לאחר מכן, בחר Multi-screening כדי לנקד אוטומטית את כל עשר תקופות השניות לשלושה שלבים על בסיס המשרעות של ה-EEG וה-EMG ועל סמך ניתוח ספקטרלי ההספק של ה-EEG.
לאחר מכן, לחץ על תנאי FFT עבור הכרטיסייה EEG. שם, הגדר את הפרמטרים לניתוח ספקטרלי ההספק. השתמש ב-256 נקודות נתון המתאימות לכל שתי שניות של EEG, השתמש בפונקציית חלון המינג והשתמש בממוצע של חמישה ספקטרומים לתקופה.
לאחר מכן לחץ על אישור.כעת, לחץ על התחל סינון כדי להתחיל את הסינון האוטומטי. לאחר מכן, פתח את הנתונים המאוחסנים, שנשמרים בפורמט קובץ RAF ובדוק את תוצאות ההקרנה האוטומטית. לפי הצורך, תקן את התוצאות אם הן אינן עומדות בקריטריונים הסטנדרטיים.
כדי לבצע תיקון, לחץ והחזק את לחצן העכבר השמאלי בתקופה שגויה וגרור את הסמן על פני מחרוזת התקופות שקולות באופן שגוי. שחרר את לחצן העכבר השמאלי ובחר את מצב ההתנהגות הנכון בחלון המוקפץ. בתנאי הבסיס, העכברים הפגינו מקצב שינה-ערות ברור התואם את אופיים הלילי.
במהלך תקופת האור של 12 שעות, העכברים היו בממוצע 6.7 שעות של שנת NREM ו-0.9 שעות של שנת REM. ואילו במהלך תקופת החושך של 12 השעות שלהם, הערות הייתה הדומיננטית. כמו כן נרשמו מדידות נוספות.
אלה כללו את התפלגות עידן השינה, משך הזמן הממוצע שלהם ומעברי השלבים עבור כל מצב ערני. ספקטרום הספק EEG עבור שנת NREM ו-REM מראה צפיפות הספק EEG חזקה בתחום התדרים של 0.5 עד ארבעה הרץ עבור שנת NREM בהשוואה לצפיפות הספק של 6 עד 10 הרץ עבור שנת REM. כדי להעריך את השפעת הקפאין על השינה, עכברי C57 שחורים 6 טופלו ברכב ביום אחד ובקפאין ביום שלמחרת.
זריקות תוך צפקיות של קפאין ניתנו בשלב מוקדם של מחזור האור. כצפוי, ההקלטה גילתה שהקפאין הגדיל את כמות הערות בעכברים. עלייה של פי שלושה בערנות התרחשה במשך שלוש שעות לאחר ההזרקה.
לאחר השליטה, ניתן לבצע את הליך השתלת האלקטרודות תוך פחות מ-20 דקות. ניקוד ותיקון נתוני ה-EEG לפרק זמן של 24 שעות יכול להיעשות תוך כ-30 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר הקלטה של אלקטרואנצפלוגרמה ואלקטרומיוגרמה בעכברים וכיצד להעריך אם וכמה זמן בעל חיים ער או ישן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוצדורה של רישום פוליגרפי להערכת מצב העירות של עכברים בעלי התנהגות חופשית באמצעות מדידות EEG ו-EMG. השיטה מאפשרת לחוקרים להקריב קורלציה בין התנהגות ופיזיולוגיה לבין מצבי שינה, ובכך לספק תובנות לגבי פעילותם של נוירונים קורטיקליים.
מרכיבים מרכזיים של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ניתוח התנהגותי
רקע
- הקלטות של אלקטרואנצפלוגרמה (EEG) ואלקטרומיוגרמה (EMG) הן חיוניות לחקר השינה והערות.
- ניתן לשלב את הטכניקה עם שתלים מוחיים אחרים לצורך איסוף נתונים מקיף.
- השתלה נכונה של האלקטרודות היא קריטית להשגת מדידות מדויקות.
- הדגמות ויזואליות משפרות את ההבנה של ההליך הכירורגי.
מטרת המחקר
- לקביעת מצב העירנות של עכברים.
- למדידת הזמן שהושקע במצבי שינה שונים.
- להצלבת נתונים פיזיולוגיים עם תצפיות התנהגותיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- רישום פוליגרפי של EEG ו-EMG בעכברים.
- שימוש במערכת מבוססת כבלים לרכישת נתונים.
- השתלה כירורגית של אלקטרודות בתנאים סטריליים.
- הדגמה חזותית של הליך ההשתלה.
תוצאות עיקריות
- הקלטה מוצלחת של אותות פיזיולוגיים מרובים.
- יכולת להעריך שינה וערנות בעכברים בעלי התנהגות חופשית.
- שילוב עם מערכים ניסויים אחרים הוא בר ביצוע.
- איכות מיקום האלקטרודות משפיעה באופן משמעותי על דיוק הנתונים.
מסקנות
- שיטה זו חיונית להבנת הקשר בין התנהגות לפיזיולוגיה.
- היא מספקת מסגרת למחקרים עתידיים בתחומי מדעי המוח השונים.
- טכניקה וציוד נאותים הם קריטיים לקבלת תוצאות מהימנות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מובילה
הערכה מדויקת של מצבי שינה-ערות במודלים פרה-קליניים חיונית להפחתת סיכונים של מועמדים לתרופות המכוונות למערכת העצבים המרכזית (CNS), וזאת על ידי קישור פנוטיפים התנהגותיים לפעילות עצבית בבסיסם. שיטת רישום פוליגרפית זו מאפשרת ניטור כמותי ואורכי של מצבי ערנות בעכברים בעלי התנהגות חופשית, ובכך תומכת בתיקוף מכניסטי של תרכובים מווסתים שינה. הטכניקה מספקת רצף תרגומי מהשלב של מעורבות המטרה ועד לפלט התפקודי, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בשלבי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי קורלציה בין מצבי שינה המוגדרים באמצעות EEG/EMG לבין מניפולציות פרמקולוגיות או גנטיות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות מדידות אובייקטיביות וכמותיות של מצבי ערנות, המפחיתות עמימות מכניסטית.
- ערך חיזוי: מייצר נתוני תגובה למנה ומסלול זמן המגבירים את הביטחון במעורבות המטרה ובמודולציה של המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר אותות EEG ו-EMG סטנדרטיים ובנאמנות גבוהה המתאימים למסלולי ניקוד אוטומטיים המשתמשים בניתוח ספקטרלי ובספי סף של אמפליטודה.
- פלט כמותי: מספק סיווג מבוסס תקופות (epochs) של ערות, שינה מסוג NREM ושינה מסוג REM, המאפשר השוואות הדירות בין קבוצות.
- יכולת הרחבה: תואם למערכי הקלטה כרוניים, המאפשרים הערכה אורכית לאורך תנאי טיפול ומחזורי השעון הביולוגי.
מחקר תרגומי ופקליני
- רלוונטיות למחלות: מדמה את ארכיטקטורת השינה האנושית באמצעות מדדי שינה כמותיים של NREM ו-REM, ובכך תומך במחקרים על הפרעות שינה ומצבים נוירופסיכיאטריים.
- הלימה לסממנים ביולוגיים תרגומיים: שינויים בספקטרום ההספק של ה-EEG (דלתא 0.5–4 Hz עבור NREM, תטא 6–10 Hz עבור REM) משמשים כסממנים ביולוגיים כמותיים למעברים בין מצבי שינה.
- קידום מותאם סיכונים: נתוני התפלגות שינה-ערנות מספקים מידע לאפיון בטיחות ויעילות פרה-קליניים, במיוחד עבור תרכובות הפעילות במערכת העצבים המרכזית (CNS) המשפיעות על ערות או סדציה.
שילוב של תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לאופטימיזציה של מולקולות מובילות (lead optimization), ומספקת מדדים פיזיולוגיים המגשרים בין התערבות מולקולרית לבין תפוקה התנהגותית בפיתוח תרופות נוירו-פסיכיאטריות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת חקירה מונחית-השערה של מעגלים עצביים המווסתים עוררות ומעברים בין שינה לעירות, באמצעות מניפולציות ספציפיות לסוג התא בשילוב עם קריאה פיזיולוגית.
- סינון: מאפשר ניטור של מצב ערנות, הניתן לשחזור ומוכן לבדיקה, לצורך הערכת השפעות של תרכובות על ארכיטקטורת השינה במחזורים של 24 שעות.
- אנליטיקה: ניתוח ספקטרום כוח ודירוג תקופות (epochs) אוטומטי מספקים תוצאות כמותיות וניתנות להשוואה להערכת שינויים בהשראת תרופות במשך השינה ובפרגמנטציה שלה.
- מחקר תרגומי: תומך ברצף של תיקוף פרה-קליני באמצעות מידול של פנוטיפים של EEG בשינה אנושית וויסות צירקדי במערכת הניתנת למניפולציה גנטית.
- שימוש חוזר ארגוני: תשתית כירורגית ותשתית הקלטה הניתנות לשימוש חוזר תומכות במחקרי אורך על פני מספר פרויקטים, ובכך מפחיתות את נטל ההקמה לכל מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות בין השפעות מולקולריות לתוצאות תפקודיות של ערות ושינה.
- ערך תפעולי: זרימות עבודה סטנדרטיות להשתלה של אלקטרודות ורכישת אותות משפרות את השחזוריות בין מעבדות ובין סדרות ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר זיהוי מוקדם יותר של השפעות לא ספציפיות (off-target) על מערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שמשפר את היעילות ההונית ומפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב הפרעות שינה בלתי צפויות.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם-סיכון של תרכובות בהתבסס על פרופילי סיכון להפרעות שינה וערות, ובכך מתאימה את החלטות הפיתוח לשיקולי מדד טיפולי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטריאוטקסי, רכישת אותות EEG/EMG וניתוח ספקטרלי לצורך שלבי שינה.
- תלוי בתשתית הקלטה יציבה הכוללת טבעות החלקה (slip rings), מגברים ותוכנה המסוגלת לבצע ניתוח EEG מבוסס FFT וסיווג אוטומטי של מצבי שינה.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של מיקום האלקטרודות, פרמטרי סינון וקריטריונים לדירוג כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- שיקולי התאמה כוללים התאמות עבור זני עכברים שונים, גילאים או מודלים של תחלואה נלווית העשויים לשנות את ארכיטקטורת השינה הבסיסית או את איכות האות.
- מגבלות מעשיות כוללות זמן התאוששות מהניתוח, הגבלות התנהגותיות הקשורות לחיבור הכבלים (tether) והצורך בהרגלה לתאי ההקלטה כדי למזער פרגמנטציה של השינה המושרה על ידי סטרס.
