Name: בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: למדו לבודד פיברובלסטים ומיופיברובלסטים CD90+ מרקמות במערכת העיכול קפואות. הפרוטוקול מאפשר עיכוב בעיבוד דגימות ותומך במחקר תיקון רקמות ופיברוזה ביולוגיית תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) והמכון למדעי התרגום בשלוחה הרפואית של אוניברסיטת טקסס, ופרס מדע קליני ותרגומי (8UL1TR000071).

הפרוטוקול לקבלת רקמה אנושית שהושלכה מחולים כירורגי והקמת התרבויות העיקריות אושר על ידי אוניברסיטת טקסס רפואית הסניף ואוניברסיטת ניו מקסיקו לוחות סקירה מוסדית. הדרישות הכלליות לרכש של דגימות רקמה אנושיות מתוארת להלן. שים לב כי מאז MFS עשוי להיות מבודד מהרקמה קפוא, biobanks וספקים מסחריים גם אפשרויות קיימא. 1. השג רקמה אנושית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס פרוטוקול להשיג רקמת מעי גס אנושית למועצה לביקורת המוסדית לאישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסס שיתופי פעולה עם מנתחים כלליים ו / או מנתחי מעי גס על מנת לקבל רקמות אנושיות למחקר. שיתוף פעולה עם המחלקה לפתולוגיה היא גם חובה כפי שהם יהיו קביעת הרקמה שאינו נדרשת לאבחון ויכול להיות מיועדת למחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעץ פתולוג לספק רקמה מneoplasm ולאחר מכן grosslרירית נורמלית y לפחות 5 סנטימטרים מהגידול. מייד למקם את הדגימות בתקשורת לשטוף קר כקרח ומניח על קרח. פתולוג יקבע את כמות הרקמה שיכול להינתן בבטחה למחקר. הרקמה המינימלית הנדרשת לבידוד MF היא 1.5 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברקמות שהושגו או מייד להקים תרבויות העיקריות או הקפאה והמקום ב -80 ° C עבור בידוד עתיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקפאה לבידוד מאוחר יותר, לחתוך את הרקמה לתוך כ 1 - 2 מ&quot;מ 2 חתיכות, מקום לתוך צינור קירור עם 1 מיליליטר של תקשורת הקפאה (ראה להלן), וחנות ב -80 ° C. הערה: ניצול פרוטוקול זה, בידוד מוצלח של MFS מהרקמה קפואה במשך 4 שנים נצפה. </li></ol></li></ol> 2. הכן ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון Collagenase: הכן 100 U collagenase מיליליטר / I, II ו- IV בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) עם Ca 2 + / 2 + Mg (ראה לוח חומרים </stronז&gt;). זהירות: ריכוז יחידה פעיל Collagenase וטוהר רשאי משתנים מהספק כדי ספק, שעלולה לעכב את היעילות של מערכת עיכול הרקמה ו / או שימור epitope על פני השטח של תאי רירית. כדי למנוע בעיות פוטנציאליות אלה, להשתמש collagenase עם התואר הגבוה ביותר של טוהר (≥95%) ולהכין את פתרון המניות המבוסס על ריכוז יחידות הפעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות DNase על בסיס מים ב 10 מיליליטר / מ&quot;ג (3.55 UA / מ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת לשטוף: (ממ: 89 מיליליטר, אנטיביוטיקת antimycotic, 100x: 1 מיליליטר; FCS מומת חום: 10 מיליליטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פיברובלסטים צמיחת מדיה: ממ: 500 מיליליטר בקבוק; L- גלוטמין (200 מ&quot;מ): 5 מיליליטר; חומצות ממ שאינה חיונית אמינו, 100x פתרון: 5 מיליליטר; ציפרופלוקסצין HCl (10 מ&quot;ג / מיליליטר): 570 μl; אנטיביוטיקה antimycotic, פתרון 100x: 10 מיליליטר; פירובט נתרן (100 מ&quot;מ): 5 מיליליטר; FCS מומת חום: 50 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת הקפאה: תקשורת צמיחת פיברובלסטים (מגיב 2.4) עם התוספת של 10% דימתיל sulfoxide (DMSO), ואז לסנן-sterilize עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li></ol> רקמות 3. אנזימים Digest אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הרקמה הוקפאה בתקשורת הקפאה, cryovial מקום ב( ~ 37 מעלות צלזיוס) מים חמים עד רקמה ותקשורת מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל4 - 5 של 2 מ&quot;מ 2 חתיכות של רקמות, רקמות לשטוף פעמיים עם 10 מיליליטר של HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהרקמה יש התיישבה על ידי כוח הכבידה, להשליך בזהירות supernatant מבלי מסתובב מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של תמיסת collagenase לדוגמא ולהעביר את תערובת רקמות פתרון ל, צינור DNase / RNase ללא סטרילי עם המובנה הרוטורים לניתוק מדגם. השתמש collagenase לנתק את מטריקס המקיף את ההיבט הבסיסי של תאי האפיתל ומהווה את החלק בלתי תאי של propria lamina הרירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוזקה קרוב צינור ולצרף אותו במהופך על השרוול של Dissociator (למשל, gentleMACS). אם אין לו את המעבדה הגישה לtהוא האמור לעיל ציוד, להגדיל את הזמן של כל שלב עיכול כדי להשיג תוצאות דומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את h_tumor_01 התכנית, פרופיל שנקבע מראש כלול עם המכשיר (משך הזמן הכולל של 36 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 268 כדורים לריצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיומה של התכנית, לנתק את הצינור מDissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לדוגמה עבור 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף על שייקר ב 140 סל&quot;ד. הערה: כמויות משתנות של דגימות רקמה, זמן של עיכול יכול להיות מופחת או מוגבר באופן יחסי (כלומר, כמויות גדולות יותר של רקמה עשויות לדרוש זמן נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור הפוך על השרוול של Dissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהפעיל את התכנית h_tumor_02 (משך זמן כולל של 37 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 235 כדורים לריצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיומה של התכנית, לנתק את הצינור מDissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון מניות DNase. השתמש DNAse לנתק / להסיר תאים מתים וחלק DNA של פסולת הסלולר שמוביל לתא בצעדים כבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף על שייקר ב 60 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור הפוך על השרוול של Dissociator שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהפעיל את התכנית h_tumor_03 (משך זמן כולל של 37 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 168 כדורים לריצה). הערה: אם הרקמה אינה מתעכל לגמרי, צנטריפוגות ב × גרם 250 עבור 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, להשליך supernatant, resuspend ב 2 מיליליטר של תמיסת תא דיסוציאציה ולדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה ב g × 250 במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה לשטוף תא פעמיים עם 25 מיליליטר של HBSS ללא Ca 2 + / 2 + Mg וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שעבר היהh, לספור את המספר הסלולרי באמצעות מערכת ספירת תאים אוטומטית זמינה במעבדה או באמצעות hemocytometer ידני. עבור דור התרבות העיקרית MF להמשיך לצעד 3.19.1, לניתוח או מיון של MFS באמצעות cytometry זרימה להמשיך לצעד 3.19.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבידוד וצמיחה של תרבות MF הטהורה (איור 1), לבטל את supernatant מצנטריפוגה האחרונה, תא גלולה גלול בכמות המתאימה של תקשורת בידוד פיברובלסטים צריך זרע עד 4 x 10 6 תאים ב 3 מיליליטר של התקשורת לכל גם ב 6 צלחות גם, שטופלה תרבית תאים. המשך לשלב 3.20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח או מיון של MFS באמצעות cytometry זרימה, למקם עד 2 x 10 6 ב 2 מיליליטר של תקשורת בידוד פיברובלסטים ב 24 גם, צלחת נמוכה מחייבת ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. זה הוא להחזיר את epitopes פני תא שעשוי להיות מושפע מההליך האנזימטית. לאחר מכן לאסוף השעיה תא ולספור תאים התאוששו ולהמשיךלimmunostaining וניתוח תזרים cytometry 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים עד היווצרות ~ monolayer MF מחוברות 80% (איור 1D-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר בצלוחיות T25 עם מ 6 צלחת גם ביחס 1: 1 ולגדול ל~ 10 - 14 ימים בתקשורת צמיחה פיברובלסטים להשיג 80 - confluency 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב תרבות על ידי passaging תאים מT25 לתאי T75 ביחס 1: 2. ברגע שתאים מגיעים confluency, להשתמש בקבוק אחד לניתוח של טוהר MF המבודד באמצעות ידי cytometry זרימה כפי שתואר לעיל 5. להקפיא או מעבר אחר בקבוק T75 תרבות MF ביחס 1: 3. הערה: כאשר נותחו על ידי cytometry זרימה, צפוי כי במערכת העיכול רירית סטרומה MF ממוצא mesenchymal כאשר גדלו בתרבות יהיה פנוטיפ הבא: EpCAM-, CD31-, CD45-, + vimentin, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

<ol><li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Fibroblasts+Mediate+Extracellular+Matrix+Remodeling+and+Invasion+of+Scirrhous+Gastric+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells.</a> PLoS ONE. 9, e85485(2014).</li>
<li>Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Colonic+Myofibroblasts+Are+Resistant+to+Clostridium+difficile+Toxin+A-Induced%2C+but+Not+Toxin+B-Induced%2C+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death.</a> Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).</li>
<li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Cells+of+the+Intestinal+Lamina+Propria.+Annu+Rev+Physiol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol+%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol.</a> Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).</li>
<li>Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+prevent%2C+reduce+or+reverse+intestinal+fibrosis+in+IBD%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Rev+Med+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD?</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).</li>
<li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li>
<li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li>
<li>Roncoroni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+fibroblasts+from+endoscopic+duodenal+biopsies+of+celiac+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients.</a> J Transl Med. 7 (40), (2009).</li>
<li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cells+Induce+Th17+during+Helicobacter+pylori+Infection+and+in+the+Gastric+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment.</a> PLoS ONE. 8, e53798(2013).</li>
<li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+chemoattractant+protein-1+production+by+intestinal+myofibroblasts+in+response+to+staphylococcal+enterotoxin+a%3A+relevance+to+staphylococcal+enterotoxigenic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease.</a> J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).</li>
<li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li>
<li>Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+carcinoma-associated+fibroblast-derived+proteins+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology.</a> J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).</li>
<li>Minonzio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+maintain+high+capability+to+grow+and+differentiate%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate.</a> Cryobiology. 69, 211-216 (2014).</li>
<li>Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Myofibroblasts+from+Mouse+and+Human+Esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus.</a> J. Vis. Exp. (95), e52215(2015).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> J. Vis. Exp. (80), e50611(2013).</li>
<li>Schiller, J. H., Bittner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Tumorigenic+Phenotype+with+in+Vitro%2C+but+not+in+Vivo%2C+Passaging+of+a+Novel+Series+of+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Lines%3A+Possible+Role+of+an+%CE%B15%2F%CE%B21-Integrin-Fibronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction.</a> Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).</li>
<li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li>
<li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li>
<li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בעוד פרוטוקול זה פותח ליישום המחקר בלבד, לאור גדל חשיבות קריטית של תאי סטרומה כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים סרטן פרוגנוסטיים ויעד טיפולי, היכולת להקפיא biospecimens &quot;פונקציונלי&quot; לשימוש מאוחר יותר מציעה יתרון משמעותי. זה מייצג יתרון ייחודי ליצירת biorepository הקליני, העשויים לשמש כלים נוספים כמו משרת כדי לקדם את הפיתוח של רפואה אישית 10, 11. בדומה לממצאים שדווחו בעבר לתאי גזע שמקורם בשומן mesenchymal המבודדים מחלק של כלי דם סטרומה הקפואה, שעשינו לא נצפה שינויים...

Myofibroblasts / fibroblasts (MFS) מייצג אוכלוסיית שפע של תאים במערכת עיכול רירית (GI). תאי סטרומה אלה ממוקמים ממש מתחת האפיתל ויוצרים רשת ביניהם בתוך propria lamina הרירי במעיים. MFS הוא לא רק אחראי על התצהיר של מטריקס, אבל באמצעות רגולציה אוטוקריני עשויים להשפיע תחבורת אלקטרוליט, השבת, ותפקוד מחסום של האפיתל הסמוך 1, 2. יתר על כן, MFS הוכח לשחק תפקיד מפתח בדלקת ורקמה שיפוץ 3, 4. myofibroblasts הוא חלק קריטי של מייקרו-הסביבה של הגידול, שבו הם ידועים גם בשם fibroblasts הסרטן הקשורים, ולתרום לצמיחת התאים הסרטני ולשמש כנישה לתאי גזע סרטני 3. נתונים חדשים מצביעים על כך שMFS יכול גם לשמש תאי הצגת אנטיגן מקומיים. בנוסף, פונקצית MFS רגולטורים חשובים של תגובה חיסונית מולדת ובעלי כושר הסתגלות, producing מגוון של ציטוקינים וגורמי גדילה 5. באנשים בריאים, הם האמינו תאי MFS להבדיל מתאי גזע mesenchymal ולהביע על פני השטח שלהם התא, סמן mesenchymal, 3 CD90, 5. תאים אלה הם גם חיוביים עבור vimentin, אבל שלילי לאפיתל וסמן תא דם, EpCAM וCD45 , בהתאמה. Myofibroblasts הם הציעו להיות צורה פעילה של fibroblasts וניתן להבחין בין fibroblasts מופעל לא על ידי הביטוי של α-SMA 5. במהלך העשור האחרון, גישות רבות לבידוד של myofibroblasts מרירית מעי הגס אנושית פורסמו-מבוססת בעיקר על השיטה המתוארת במקור על ידי et al Mahida. 5-8. בעוד שמחקרים בודדים לדווח נהלי בידוד מרירית מעי שונים, אין פרוטוקול אוניוורסלי לבידוד של MFS מאזורים מרובים של מערכת העיכול (כלומר, קיבה, קטן וlרירית מעי arge) כבר פורסמה. הפרוטוקול שהוצג במסמך זה נבדק ומשמש בהצלחה לכל שלושת הסוג של רקמה שהוזכר לעיל. . יתר על כן, נהלים לבידוד MFS מרירית מערכת העיכול קפוא לא דווחו. כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת, המבוססת על עיכול אנזימטי, ובמקביל מאפשר לבידודה של רירית מעי אדם MFS לתרבות וcytometry זרימת הניתוח בתא בודד, הכנות טריות מתעכלים, רירית. טכניקה זו באופן מהימן מניבה תרבויות עיקריות עם פנוטיפ MF. יתר על כן, ניתן להשתמש באותן השיטות כדי לבודד MFS מדגימות קפואות של רקמות מעי קיבה וקטנות גם כן. בידוד של myofibroblasts מרקמת GI טרי כבר תואר לעיל; עם זאת, השימוש בדגימות קפואות מציג יתרונות רבים. כלומר, חוקרים יוכלו לאסוף ורקמות חנות מכל מספר של משתפי פעולה ברחבי העולם שיש להם capability ספינה דגימות רקמה קפוא. יתר על כן, חוקרים עשויים למצוא את האוסף של רקמות שהושלכו מחדר הניתוח ו / או צמוד אנדוסקופיה והמיידי עיבוד הרקמות לבידוד לסכסוך עם לוח הזמנים של הניסויים הנוכחיים שלהם. כמו כן, בשל האופי הבלתי צפוי של ניתוח, רכש רקמה עלול להתרחש מאוחר מאוד ביום, אשר יגביל את הזמן שנותר לרקמת עיבוד. הקפאת רקמה לעיבוד מאוחר יותר יהיה לשפר באתגרים אלה. לבסוף, שיטות אלה כבר נוצלו בהצלחה בבידוד של myofibroblasts מעי הגס, קיבה וקטנה במצבי מחלה כגון קרצינומה של המעי הגס ומחלות מעי דלקתיות.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין, 100x</td><td>קורנינג</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>קורנינג</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ' EDTA, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מ-&nbsp; Clostridium histolyticum, סוג I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מ&nbsp; Clostridium histolyticum, סוג II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מ- Clostridium histolyticum, סוג IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת דיסוציאציה של תאים Accumax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr> מסננת תאים <tr><td>אוטומטית של Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>(70 ומיקרו; מ)</td> <td>קורנינג</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE עכבר אנטי אנושי וימנטין</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>שיבוט RV202</td></tr><tr><td>FITC מונוקלונלי אנטי אקטין, &alpha;-שריר חלק</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F3777</td><td>שיבוט 1A4</td></tr><tr><td>APC עכבר אנטי אנושי CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>שיבוט 5E10</td></tr></tbody></table>

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + cd מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts / myofibroblasts (MFS) כבר צובר תשומת לב הולכת וגובר לתפקידם בפתוגנזה ותרומתם לשני ריפוי הפצע והקידום של מייקרו-הסביבה של הגידול. אמנם יש כיום טכניקות רבות לבידוד של MFS מרקמות של מערכת העיכול (GI), פרוטוקול זה מציג אלמנט רומן של בידוד של תאי סטרומה אלה מהרקמה קפוא. הקפאת דגימות רקמה במערכת העיכול לא רק מאפשרת לחוקר לרכוש דגימות ממשתפי פעולה ברחבי העולם, biobanks, וספקים מסחריים, זה גם מאפשר עיבוד המאוחר של דגימות טריות. הפרוטוקול המתואר באופן עקבי יניב תאים דמויי כישור אופייניים עם פנוטיפ MF המבטא את הסמנים CD90, α-SMA וvimentin. כאשר התאים אלה נגזרים מדגימות מטופל, השימוש בתאים ראשוניים גם מקנים היתרון של MFS מחקה באופן הדוק ממדינות-כלומר מחלה סרטן ומחלות מעי דלקתיות. טכניקה זו יש דבורהn תוקף בקיבה, מעי דק, ודור התרבות העיקרית הגס MF. תרבויות MF עיקריות ניתן להשתמש במגוון רחב של ניסויים על פני מספר המעבר וטוהר שלהם הוערכו על ידי שני immunocytochemistry וcytometry זרימת הניתוח.

השימוש בפרוטוקול עיכול אנזימטי זה, יש לנו כבר הצליח לבודד ולגדל תאי סטרומה בטן אוכלוסיית MF CD90 + רירית מדגימות כירורגית במערכת העיכול וביופסיות (איור 1) באופן עקבי. התפשטות המושבה MF גלויה יכולה להיבחן ביום 2 - 5 לאחר זריעת השעיות תא mononuclear לתוך 6 צלחות היטב (איור 1 א-ב). התרבויות העיקריות MF להגיע ~ 50 - מפגש 70% ביום 7 - 11 (איור 1 ג-ד). <p class="jove_content" fo:keep-toget...

כאן, מוצג פרוטוקול לבידוד והקמת תרביות פיברובלסטים/מיופיברובלסטים ראשוניים (MF) מתאי קיבה, מעי דק ורקמות מעי גס קפואים עם פנוטיפ MF. תאים אלה מבטאים CD90, α-SMA ווימנטין. MFs יכולים לשמש למגוון בדיקות פונקציונליות כולל פעילות אנזימטית וייצור ציטוקינים.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד מיופיברובלסטים ריריים ופיברובלסטים ברי קיימא מדגימות רקמת מערכת העיכול קפואות, שהתקבלו במקור מביופסיות או דגימות כירורגיות. הבידוד של מיופיברובלסטים ופיברובלסטים מרקמת מערכת העיכול הקפואה כראוי מאפשר לעכב את עיבוד הדגימות הטריות. זה מקל על השימוש בדגימות ממקורות שונים ברחבי העולם.אם הרקמה נשמרה במדיום הקפאה, הנח את הקריוביאל באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרת הרקמה והמדיום. עבור ארבעה עד חמישה שברי רקמות של שני מילימטרים רבועים, הוסיפו 10 מיליליטר HBSS ללא סידן ומגנזיום, סגרו היטב את המכסה ושטפו את הטישו על ידי היפוך עדין של הצינור פעם אחת. לאחר שהרקמה התייצבה על ידי כוח הכבידה, השליכו בזהירות את הסופרנטנט ושטפו שוב את הטישו.לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטים של תמיסת קולגנאז לצינור, והעביר את תרחיף הרקמה לצינור נטול DNase/RNase סטרילי עם רוטורים מובנים. סגור היטב את צינור הרוטור והצמד אותו הפוך לשרוול של דיסוציאטור. לאחר מכן, הפעל את התוכנית המוגדרת מראש של גידול H אפס אחד.בסיום התוכנית, דגרו את תמיסת הרקמות למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, תחת סיבוב רציף של 140 סל"ד על שייקר. לאחר מכן, החזר את הצינור לדיסוציאטור, והפעל את תוכנית H-tumor zero two. לאחר הדיסוציאציה השנייה, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DNA לתמיסת התא למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, תחת סיבוב רציף של 60 סל"ד על השייקר.בתום הדגירה השנייה, הפעל את תוכנית H-tumor zero three. כעת, סנן את המתלה דרך מסננת תאים סטרילית של 70 מיקרון, לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר לצנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את כדור התא ב -25 מיליליטר HBSS ללא סידן ומגנזיום פעמיים, וספרו את התאים לאחר הכביסה הראשונה.ליצירת תרבית ראשונית של מיופיברובלסטים, השעו מחדש את הגלולה עד 4 x 10 לתאים השישיים לכל שלושה מיליליטר מדיום, וזרעו אותם ב-6 צלחות שטופלו בתרבית תאים באר. גדל את התאים ב-37 מעלות צלזיוס, וחמישה אחוז פחמן דו חמצני, והחלף את המדיום כל יומיים-שלושה עד להיווצרות חד-שכבת מיופיברובלסטים משולבת של 80 אחוז. לאחר מכן התאים מוכנים למעבר בצלוחיות תרבית T25.כדי לנתח או למיין את המיופיברובלסטים המבודדים על ידי ציטומטריית זרימה, צלחת עד 2 x 10 לתאים השישיים לכל שני מיליליטר של מדיום בידוד פיברובלסטים, בצלחת קשירה נמוכה של 24 באר לדגירה לילה ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. באמצעות פרוטוקול עיכול אנזימטי זה, מיופיברובלסטים ופיברובלסטים קיבלו אוכלוסיות תאי סטרומה ריריות חיוביות CD-90, ניתן לבודד באופן עקבי ולגדל אותם מדגימות כירורגיות וביופסיות במערכת העיכול. אמנם יש ירידה קלה בכדאיות הכנת התא הבודד הרירית לאחר הקפאת הדגימות הניתוחיות, אך חלה עלייה ביעילות יצירת תרבית המיופיברובלסטים והפיברובלסטים עקב ירידה נלווית בריכוז החיידקים והפטריות.לאחר שני מעברים, המיופיברובלסטים והפיברובלסטים חיוביים ל-CD90, סמן שושלת הסמן המזנכימלי, וימנטין, ואקטין שריר חלק, סמן של תאים מזנכימליים מובחנים, כפי שנקבע הן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית והן על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי. לאחר שליטה, אם מבוצעת כראוי, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשעתיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאפשר את הזמן הדרוש לעיכול אנזימטי מלא של הרקמה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו ציטומטריית זרימה, אימונוציטוכימיה ובדיקות תפקודיות שונות. הם עשויים לשמש לקביעת התרומה של מיופיברובלסטים ופיברובלסטים להומאוסטזיס ברירית המעי וכן לפתולוגיה של מחלות דלקתיות חריפות וכרוניות במערכת העיכול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיופיברובלסטים ופיברובלסטים מרקמת מערכת העיכול הקפואה.אל תשכח, רקמה אנושית לא מקובעת עלולה להיות מזוהמת על ידי מיקרואורגניזמים פתוגניים. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות אוניברסליים בעת עבודה עם דגימות ביולוגיות אנושיות בעת ביצוע הליך זה.

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Myofibroblast הוא תא סטרומה השפעה של מערכת העיכול המווסת את התהליכים פיסיולוגיים חשובים במדינות שניהם נורמליות ומחלה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת בידוד של myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית, אשר יכול להיות מנוצל לניסויים במבחנה.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות ראשוניות של תאי סטרומה בוושט עכבריים ואנושיים עם פנוטיפ מיופיברובלסטים. לתאים מתורבתים יש מורפולוגיה בצורת ציר, מבטאים α-SMA ווימנטין, וחסרים סמני פני תא אפיתל, המטופויאטי ואנדותל. ניתן להשתמש בתאי סטרומה מאופיינים במחקרים פונקציונליים של אינטראקציות אפיתל-סטרומליות.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד תאים חיים ותרבית ראשונית של קווי תאים מיוגניים ופיברובלסטים מרקמת שריר או עור.  מתוארת גם טכניקה לאמורטליזציה של קווי תאים אלה.  בסך הכל, פרוטוקולים אלה מספקים כלי אמין ליצירה ושימור של תאים שמקורם בחולה עבור יישומים במורד הזרם.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

התנהגות פיברובלסטים עומדת בבסיס ספקטרום של ישויות קליניות, אך הן נשארות מאופיינות בצורה גרועה, בעיקר בשל ההטרוגניות הטבועה בהן. מחקר פיברובלסטים מסורתי מסתמך על מניפולציה במבחנה, המסווה התנהגות פיברובלסטים in vivo. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד פיברובלסטים של עור עכבר שאינו דורש תרבית תאים.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מבוסס-FACS לבידוד של העור האנושי ושרירי הלסת. זה חוסם בתרבות מבחנה אשר היה בלתי נמנע עם פרוטוקול הבידוד הנפוץ ביותר דרך תרבויות ההסבר. ערכות המשנה שמקורם הפיצוץ הם ברורים מבחינה פונקציונלית ולהציג ביטוי גנים דיפרנציאלי ולוקליזציה בתוך dermis.

הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית

אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את הפיברוטים הראשוניים העיקריים באופן קל, מהיר ואמין, performable על ידי למתחילים (למשל, סטודנטים). הליך זה משלב את העיכול ברקמה אנזימטית ועצבנות מכנית עם גלי אולטרה סאונד כדי להשיג פיברוהטיות ראשונית. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לדרישות נסיוניות ספציפיות (לדוגמה, רקמת אדם).

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לביסוס פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

למדו לבודד פיברובלסטים ומיופיברובלסטים CD90+ מרקמות במערכת העיכול קפואות. הפרוטוקול מאפשר עיכוב בעיבוד דגימות ותומך במחקר תיקון רקמות ופיברוזה ביולוגיית תאים.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא

גלה סרטונים נוספים