ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבדיל בין תאי אב אוטיים רב-פוטנטיים אימורטליים לסוגי תאי אוזן פנימיים. לכן שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בהתחדשות שמיעתית, כגון כיצד אבות אוזניים יכולים להפוך לתאי שיער שבלול או לנוירונים שמיעתיים. חשוב לציין, טכניקה זו מספקת מערכת תאית במבחנה שניתן להשתמש בה במקביל למערכות מודל של יונקים in vivo.

ידגימו את ההליך היום אזאדה ג'דאלי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי, כמו גם ז'יצ'או סונג, ואלחנדרה לוריאנו, שתי סטודנטיות לתארים מתקדמים במעבדה. לאחר הכנת מדיום התרבית כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השתמש בשלושה מיליליטר של נוזל זה לצלחת אחת כפול עשר עד האב המולטיפוטנטי השישי, או תאי IMOP, לתוך צלחת תרבית רקמה של 60 מילימטר. דגרו על התאים במשך חמישה עד שבעה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני.

כל יומיים, הכפילו את נפח הנוזל בתרבית על ידי הוספת מדיום טרי. כדי לעבור את התאים, העבירו אותם תחילה מצלחת התרבות לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. ואז הניחו את הצינור, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, למשך חמש עד עשר דקות.

במהלך תקופה זו, צפו לאוטוספירות היוצרות מושבה להצטבר בתחתית החרוט באמצעות משקעי כוח הכבידה. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט, היזהרו לא להפריע לפלטה. השעו מחדש את האוטוספירות על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת משופרת של EDTA שהוכנה מראש או HBSS, ולאחר מכן פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש.

כדי להקל על דיסוציאציה של אוטוספירות לתאים בודדים, הנח את החרוט בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. סובב מעת לעת את התמיסה וכאשר לא נצפו אוטוספירות כמשקעים בתחתית הצינור, העבר אותה לטמפרטורת החדר. המשך להוסיף שני מיליליטר של מדיום תרבית לתאים כדי לנטרל את ה- EDTA.

וצנטריפוגה אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בחום של 200 גרם. לאחר מכן שאפו את תמיסת ה-EDTA המדוללת ושטפו את התאים בחמישה מיליליטר של 1x PBS. לאחר סיבוב התאים באמצעות אותן הגדרות, שאפו את ה-1x PBS.

לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר מדיום תרבות לחרוט. ולהשעות מחדש את לוח התאים. לספירה, יש לדלל תאי IMOP אחד עד מאה במדיום תרבית.

לאחר מכן הוסף 75 מיקרוליטר של תמיסה זו לקלטת הממוקמת במונה חלקיקים מיקרופלואידי וקבע את מספר התא. לאחר מכן, צלחת אחת כפול עשרה עד שישית תאי IMOP בצלחת תרבית רקמה של 60 מילימטר כפי שתואר קודם לכן וחזור על הליך מעבר זה כל חמישה עד שבעה ימים. שלושה ימים לאחר הציפוי, השתמש בשקיעת הכבידה כדי לאסוף אוטוספירות כפי שהוצג קודם לכן.

המשך לשאוף את הסופרנטנט. ולהשעות בעדינות את התאים בשני מיליליטר של מדיום התמיינות אפיתל חושי. לאחר מכן השתמש בפיפטה נקבובית גדולה של עשרה מיליליטר כדי להעביר את האוטוספירות לצלחת חדשה של 60 מילימטר.

הבדיל בין האוטוספירות למשך עשרה ימים. הוספת שני מיליליטר של מדיום בידול טרי לתרבות כל יומיים. לאחר מכן, קצרו את האוטוספירות שוב באמצעות שקיעת כבידה.

ולשאוף את המדיום המושקע. לאחר מכן, תקן את האוטוספירות בארבעה אחוזים פרפורמלדהיד ב-1x PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את תמיסת הפורמלדהיד ושטוף את התאים ב-1x PBS המכיל 0.1 אחוז טריטון x100.

המשך על ידי חסימת האוטוספירות ב-1x PBS בתוספת עשרה אחוז סרום עיזים ו-0.1 אחוז טריטון x100. לאחר שעה, החלף את המאגר החוסם בזה המכיל את הדילול המתאים של נוגדן Cdkn1b או CDH1. לאחר מכן דגרו את התאים בנוגדנים ראשוניים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

ולמחרת המשיכו לצבוע חיסון באמצעות נוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית, פלואידין והוכסט, כפי שמתואר במקום אחר. כדי להתכונן להדמיה, הנח מדיום הרכבה על שקופית זכוכית. ואז הכניסו את האוטוספירות המוכתמות למדיום.

לאחר מכן, הניחו תלוש כיסוי על גבי המדגם. לאחר שנתנו למדיום ההרכבה להתייבש למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, הנח את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמת CCD של 16 סיביות. באמצעות מטרת האוויר 20x 0.75, רכוש תמונות אפיפלואורסצנטיות על ידי איסוף נתונים מהערוצים הכחולים, הירוקים, האדומים והאינפרא אדום.

ראשית, נקה את החלקות כיסוי הזכוכית העגולות על ידי הנחתן בצלחת סטרילית של 100 מילימטר וטבילתן ב-70 אחוז אתנול. ערבבו בעדינות את פתקי הכיסוי כדי לוודא שהם מכוסים והשאירו את התבשיל בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות. לאחר מכן, שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS סטרילי 1x ולאחר מכן פעם אחת במים סטריליים.

לאחר מכן הניחו לכיסוי להתייבש על ידי חשיפתם לאור UV בקולט אדים לתרבית רקמות למשך 15 דקות. לשימוש מיידי, הנח החלקת כיסוי סטרילית אחת לכל באר של צלחת 24 בארות. ונער בעדינות את הצלחת כדי להבטיח שכל החלקות הכיסוי מונחות שטוחות.

לאחר מכן מצפים את פתקי הכיסוי על ידי הוספת 0.25 מיליליטר של 1x PBS המכיל 10 מיקרוגמים למיליליטר פולי D ליזין לכל באר. לאחר שהצלחת דגרה במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הסר את תמיסת הפולי D ליזין ושטוף את הבארות שלוש פעמים עם PBS סטרילי 1x. לאחר שאיבת הנוזל מהכביסה האחרונה, הכניסו 0.25 מיליליטר של 1x PBS המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר למינין, לכל אחת מ-24 הבארות.

לאחר דגירה של הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, שאפו את תמיסת הלמינין, ואז שטפו כל באר עם מיליליטר אחד של 1x PBS שלוש פעמים, אך השאירו את ה-PBS מהכביסה האחרונה בבארות עד שהתאים מוכנים לציפוי. כדי להתחיל בהתמיינות עצבית, ספור את התאים מאוטוספירות מנותקות כפי שתואר קודם לכן. ואז השעו אותם מחדש במדיום התמיינות עצבי שחומם מראש.

המשך על ידי זריעה בין נקודה אחת לנקודה אחת חמש פעמים עשרה לתאי ה-IMOP החמישיים לכל באר של הצלחת המכילה את החלקות הכיסוי המצופה. דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס, עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני. החלפת מדיום ההתמיינות העצבי כל יומיים.

לאחר שבעה ימים, שאפו את המדיום, וקבעו את התאים, אותם יש לחבר להחלקות הכיסוי, על ידי הוספת ארבעה אחוז פורמלדהיד לכל באר. ומשאיר אותם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את הפורמלדהיד ושטוף את התאים פעם אחת ב-1x PBS המכיל 0.1 אחוז טריטון x100.

לאחר מכן, הסר את מאגר הכביסה. והוסף מאגר חוסם המורכב מ-1x PBS המכיל עשרה אחוז סרום עיזים רגיל, ו-0.1 אחוז טריטון x100 לכל באר. השאירו את התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר.

ולאחר מכן הסר את הנוזל והחלף אותו במאגר חוסם המכיל את הדילול המתאים של נוגדן Cdkn1b או Tubb3. לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS המכיל אחוז אחד טריטון x100. ואז המשך עם צביעה חיסונית כפי שתואר קודם לכן.

לאחר השלמת הצביעה, בצע שטיפה אחרונה על ידי הוספת 1x PBS לבארות. כדי להכין אותם לניתוח, הסר את החלקות הכיסוי אליהן מחוברים תאים מוכתמים מצלחת 24 הבארות. והנח אותם על מדיום הרכבה על מגלשת זכוכית.

לאחר שנתנו למדיום ההרכבה להתייבש למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, רכשו תמונות אפיפלואורסצנטיות כפי שתואר קודם לכן. אוטוספירות שגודלו במשך עשרה ימים במדיום התמיינות אפיתל מדגימות ביטוי מוגבר של Cdkn1b, מעכב קינאז תלוי מחזור, וסמן להתמיינות האוזן הפנימית, בהשוואה לתאים לא מובחנים. כאן צביעת הוכסט אכן ציינה גרעיני תאים.

תאים אלה מציגים גם שינויים מורפולוגיים בחוטי אקטין ובאזורים של הידבקות תא-תא האופייניים לאפיתליה. מסומן על ידי הופעת Phalloidin, ותיוג Cdh1 בשולי התא. ניתן גם לכוון אוטוספירות ליצירת נוירונים.

תמונת שדה בהירה זו מראה כי לאחר שבעה ימים בתווך התמיינות עצבית, תאי IMOP מציגים נויריטים. צביעה חיסונית של תאים אלה עם סמן עצבי Tubb3 מאשרת את התמיינותם. והם גם מבטאים בצורה חזקה את Cdkn1b.

זה מצביע על כך שאות כפול Tubb3, Cdkn1b יכול לשמש כאינדיקטור להתמיינות עצבית בתאי IMOP. תאים פלואורסצנטיים מובחנים ולא מובחנים של Cdkn1b נורמלו גם הם על ידי קביעת היחס שלו לאות הוכסט, ומספקים תוצאות כמותיות. היסטוגרמות של נתונים אלה מוצגות כאן.

האחוזים של תאי IMOP לא ממוינים ומובחנים מעל סף שנקבע מראש של Cdkn1b מנורמל מוצגים בגרפים אלה. שתי האוכלוסיות המובחנות מדגימות עלייה משמעותית באחוז התאים המבטאים Cdkn1b בהשוואה לבקרות לא ממויינות, מה שמאשר את ההתמיינות המוצעת על ידי אימונופלואורסצנטיות. לאחר השליטה, ניתן לבצע תרבית והתמיינות שגרתית של תאי IMOP תוך 30 דקות, אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליזום התמיינות של תאי IMOP. תודה שצפית בסרטון הזה. ובהצלחה בניסויים שלך.