Name: ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: למד שיטות לסימון חלבון בחרקים לחקר פיזור ונדידה באמצעות ELISA. טכניקות אלו מאפשרות זיהוי פשוט ויעיל בסביבה טבעית, ומסייעות למדענים לחקור דפוסי הגירה ותפוצת מינים פולשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון ניתן על ידי משרד החקלאות האמריקאי כריס 5347-22620-021-00D ו, בחלקו, על ידי החקלאות ומזון מענק המחקר תחרותי היוזמה לא. 2011-67009-30141 מהמכון הלאומי USDA של מזון וחקלאות. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית של יוהנה Nassif. אנו מודים גם פול בייקר, דוד הורטון, דייגו Nieto, ופרנסס Sivakoff למתן חלק מהתמונות השתמשו באיור 3.

1. הפנימי מארק, שמירה, וזיהוי נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך סימון פנימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרקים של עניין (n ≈ 100 אנשים) ממושבת מעבדה גדלה על דיאטה מלאכותית או מהשטח ולחלק לשתי מכולות גידול נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מנות רגילות 20 מיליליטר דיאטה (טיפול ביקורת שלילי לא מסומן) לאחת מהמכולות. להשלים מנה שנייה 20 מיליליטר מלאכותית דיאטה עם 1.0 מיליליטר של 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר IgG עוף / פתרון IgY, ומערבב היטב, ומניח אותו במכל האחר. הערה: אם החרק של עניין אין דיאטה מלאכותית, הסימן יכול להיות ממוקם באו בכל דיאטה שהם בדרך כלל נגרמו על (למשל, שעועית ירוקה, ביצי עש, מים, סוכר, דבש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר החרקים לחדש פעילות ההאכלה שלהם למשך 24 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך שימור סימן פנימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מנות דיאטה מכל מכולה ולספק את החרקים wה- i אחר מקור מזון כדי לקיים אותם על משך הניסוי (למשל, שעועית ירוקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוקבה (n = 20) של חרקים יומיים (או בכל פרק זמן רצוי) מכל טיפול ולהקפיא מייד ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך ELISA כריך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של נוגדן ארנב נגד עוף IgY העיקרי בדילול 1: 500 בטריס שנאגרו מלוח (TBS) היטב בכל microplate ELISA נקי ודגירה למינימום של שעה 1 ב RT (הערה: O microplates גם יכול להיות מודגרות / N ב 4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הנוגדן מהצלחת ולחסום כל טוב עם 300 μl של פתרון חלב יבש ללא שומן 1.0% למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה לצעדי דגירה הקודמים, למקם את החרקים קפוא בנפרד ב1.6 מיליליטר צינורות microcentrifuge עם 1.0 מיליליטר של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים כל חרקים עם העלי נקי עד הומוגני ביסודיות ולהוסיף של כל דגימה 100 μl ולבודד של ELISAצַלַחַת. אפשר הדגימות כדי לדגור על RT עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לשלילי (TBS בלבד) וחיוביים 100 μl (חלבוני ביצה בTBS) בקרות לבארות בעמודה הראשונה של כל צלחת ELISA. כמו כן, להוסיף בקרות חרקים שליליות (חרקים לא מסומנים) 100 μl לבארות 8 בטור האחרון של כל צלחת (איור 1). אפשר דגימות השליטה כדי לדגור על RT עבור שעה 1. שים לב שהתבנית הניתנת באיור 1 היא התבנית אנו משתמשים למבחנים הסטנדרטיים שלנו. המיקום של הדגימות בבארות הוא לשיקול דעתו של החוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם מי מלח פוספט (PBS) -tween ולאחר מכן להוסיף 50 μl של IgG אנטי-עוף ארנב / IgY מצומדות עם peroxidase חזרת דילול 1: פתרון חלב 10,000 ב 1% ודגירה עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולהוסיף 50 μl של tetramethylbenzidine מצע (TMB) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, לקרוא את הבארותעם ספקטרופוטומטר microplate להגדיר באורך גל של 650 ננומטר. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> איור 1. תרשים סכמטי המציג את הכינויים גם תקניים המשמשים ל96 טיפוסי גם microplate ELISA. כל צלחת מכילה 7 בארות מוקדשים לבקרה שלילית שנאגרו מלוחה-טריס (TBS), גם ייעודיות לשליטת חלבון חיובית (POS Ctrl), 80 בארות בודדות מוקדשת לחרקים כבשו מחדש (לדוגמא 1 ... 80), ו -8 בארות מוקדשים לבקרת חרקים לא מסומן (שלילית) (נג Ctrl 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2. החיצוני מארק, שמירה, וזיהוי נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך סימון חיצוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרקים של עניין (n ≈ 100יחידים) ממושבת מעבדה או מהשטח והמקום לשני מיכלי פלסטיק 1.0 L עם חור בקוטר 2.5 סנטימטר אגרוף מהצד השני של כל מכולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס החרקים במכל הראשון עם 1.0 מיליליטר של DH 2 O (טיפול בקרה שלילי) באמצעות nebulizer רפואי. ריסוס החרקים במכל השני עם 1.0 מיליליטר של פתרון 5.0% מחלבוני ביצת עוף באמצעות nebulizer רפואי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הצינור של nebulizer לשקע אוויר מעבדה סטנדרטי ולאחר מכן הכנס את הפה של nebulizer לתוך חור 2.5 סנטימטר של המכל. לאחר מכן, להפעיל את יציאת האוויר בהדרגה עד nebulizer מייצר אדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ריסוס (סימון) עד פתרון חלבוני ביצה כבר לוותר (כ. 2-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את nebulizer ולמקם את פקק לתוך החור של מיכל הפלסטיק. לאפשר החרקים לעמוד על RT עד הפתרון התייבש לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך שימור סימן חיצוני<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל טיפול בחרקים היבש לתוך מיכל נפרד גידול נקי, כדי למנוע חשיפה נוספת לסימן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מזון ומים למכל הנקי כדי לקיים את החרקים על משך המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוקבה (n = 20) של חרקים מכל טיפול היומי ולהקפיא מייד ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך ELISA עקיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החרקים הקפואים בנפרד לתוך 1.6 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולהוסיף 1.0 מיליליטר של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הדגימות עבור שעה 1 בסט ייקר מסלולית ב 120 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בקרות שליליות וחיוביות כמתואר בשלב 1.3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההשריה, פיפטה aliquot 100 μl מכל מדגם לאחד 80 בארות מדגם ייעודיות ובצלחת ELISA חדשה 96 כפי שמוצג באיור 1 אפשר הדגימות כדי לדגור במשך שעה 1 ב RT (הערה:. Microplates יכול להיות גם O מודגרות / N ב 4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות שלוש פעמים עםPBS-tween ולאחר מכן להוסיף 300 μl של נאגר מלוח פוספט המכיל 1% אלבומין בסרום שור (PBS-BSA) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות ב RT לשטוף פעמיים עם PBS-tween. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של נוגדן ארנב נגד ביצת אלבומין העיקרי בדילול 1: 8,000 ב PBS-BSA-Silwet (0.05%) לכל היטב דגירה עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולאחר מכן להוסיף 50 μl של IgG נגד הארנב העז מצומדות עם peroxidase חזרת דילול 1: 2,000 ב PBS-BSA-Silwet (0.05%) במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולהוסיף 50 μl של מצע TMB היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, לקרוא את הבארות עם ספקטרופוטומטר microplate להגדיר באורך גל של 650 ננומטר. </li></ol></li></ol> ניתוח 3. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הערך הממוצע של ספיגת 8 החרקים ביקורת השליליים על כל צלחת ELISA ולאחר מכן לחשב את סטיית התקן בהתבסס על הפקדים השליליים נקוו הלוך ושובכל צלחות ELISA של מחקר ניתנו 12 מ &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שש פעמים סטיית תקן ונקווה לממוצע המתקבל לכל צלחת ELISA להשיג ערך סף חיובי ELISA. כל מדגם חרקים מניב ערך הספיגה שווה או גדול מהערך הזה נחשב כחיובי לנוכחות של סימן החלבון. </li></ol>

אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות האמריקאי. משרד החקלאות האמריקאי הוא ספק הזדמנות שווה ומעביד.

הליך immunomarking חלבון פרוקי רגליים תואר לראשונה כמעט רבע מאה לפני 9. מאז, ההליך הותאם ללמוד את דפוסי הפיזור של מגוון רחב של פרוקי רגליים באמצעות IgG / IgYs מנוהל פנימי וחיצוני. חלבונים אלה הוכיחו סמנים איתנים למגוון הרחב של מיני חרקים נבדקו עד כה. עם זאת, כאמור לעיל, המגבלה העיקרית לשימוש בIgG / IgYs היא שהם יקרים מאוד. כתוצאה מכך, IgG / IgYs הם שימושי רק עבור MRR ומחקרי סוג סימון עצמי שבו קבוצות גדולות של חרקים יכולות להיות מסומנות בחלל קטן או יכולים להיות משולבות ה...

מעקב התנועה של מזיקי פרוקי רגליים, אויבים טבעיים (טפילים וטורפים), ומאביקים בטבע הוא חיוני להבנה טובה יותר כיצד לשפר את שירותי מערכת אקולוגית. המרכיב המרכזי במרבית הסוגים של מחקר הוא שיש פיזור שיטה אמינה כדי לתייג את פרוקי הרגליים (ים) של עניין. מגוון רחב של חומרים (לדוגמא, צבעים, צבעים, אבקות צבעוניות, תגים, אלמנטים נדירים, חלבונים) שימשו כדי לסמן פרוקי רגליים להעריך דינמיקת האוכלוסייה שלהם, יכולות פיזור, האכלת התנהגויות, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות 1,2. נאותות סמן המשמש לכל מחקר פיזור נתון תהיה תלויים בסוג של מחקר שנערך. ישנם שלושה סיווגים רחבים לסימון פרוקי רגליים: (1) סימן-שחרור-לכבוש מחדש (MRR), (2) סימן-ללכוד, ו- (3) סימן-לכידה עצמית. למחקר סימן-שחרור-לכבוש מחדש, החוקר בדרך כלל מסמן את פרוקי הרגליים קולקטיבי בlaboratoר&quot;י ומשחרר אותם בנקודה מרכזית בתחום. אז פרוקי רגליהם כבשו במרווחי מרחב ובזמן שונים באמצעות מכשירי אוסף שונים (בניכוי למשל, לטאטא, ואקום, מלכודת דביקה) 3,4,5. אז הדגימות כבשו נבחנות לסימן הספציפי להבחין שוחררו מאנשים מקומיים. למחקר סימן-ללכוד, החוקר בדרך כלל חל הסימן ישירות בציוד השדה באמצעות תרסיס (למשל, מרסס תרמיל, בום ומרסס זרבובית). הסמנים הטובים ביותר עבור מחקר סימן-לכידה זולים ובקלות להחיל בית הגידול של פרוקי הרגליים. למחקר-סימן-לכידה עצמית, החוקר בדרך כלל חל סימנים לכניסה פיתיון פרוקי רגליים 6,7 או 8 קן. בתורו, פרוקי הרגליים מסמנת את עצמו באופן פנימי על ידי טורף את הפיתיון המסומן או חיצוני על ידי &quot;צחצוח&quot; נגד סימן יציאתו לקן. כפי שצוין לעיל, סוגים רבים של סמנים היואד לתייג מגוון מיני פרוקי רגליים. עם זאת, מעט מאוד שימושיים לכל שלושת קטגוריות מחקר פיזור אלה. הפיתוח של הליך immunomarking החלבון היה פריצת דרך משמעותית עבור סימון חרקים. Immunomarking מעמיד תווית חלבון על פרוקי רגליים פנימיים או חיצוני אשר, בתורו, הוא זוהה על ידי assay נגד חלבון מסוים צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). סמני החלבון הראשונים מסוג המשמשים היו אימונוגלובולינים ארנב (IgG) וIgG עוף / IgY 9,10. הם הוכיחו להיות יעילים מאוד סימנים לMRR ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון). למרבה הצער, חלבוני IgG / IgY הם יקרים ולכן אינם מעשיים למחקר סימן-לכידה ורוב הסוגים של מחקר-סימן-לכידה עצמית. בהמשך לכך, ELISAs זיהוי חלבון הדור השני פותחו עבור חלבונים כלולים בחלבוני ביצת עוף (אלבומין), חלב פרה (קזאין) וחלב סויה (חלבון מעכב טריפסין). כל assay הוא רגיש מאוד, ספציפי, והכיחשוב מכך, משתמש בחלבונים שהם הרבה פחות יקרים מאשר חלבוני IgG / IgY 11. חלבונים אלה הוכחו כיעילים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון). במאמר זה, אנו מתארים ומדגימים כיצד לבצע מחקרי שימור המעבדה סימן חלבון. מחקרים כאלה הם השלב הראשון של המחקר הדרוש לכל סוג של מחקר פיזור שדה. באופן ספציפי, זה קריטי, כי חוקרים יודעים כמה זמן הסימן יישמר על מיני פרוקי רגליים הממוקדים לפני היציאה ללימודי פיזור שדה. כאן אנו מתארים ומדגימים כיצד פנימיים והן חיצוניים כדי לסמן חרקים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקרי שדה הסוג-סימן-לכידה עצמית. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד לזהות הנוכחות של הסימנים עם ELISAs העקיף וכריך.

<table><tbody><tr><td>מיכל אחסון מזון (לגידול חרקים)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>בגדלים שונים</td><td>יצרנים וספקים שונים. בד רשת מודבק בחלון</td></tr><tr><td>נבולייזר בנפח קטן (מיקרו ערפל)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>זמין באינטרנט ובחנויות לציוד רפואי. מותגים אחרים יעבדו גם כן.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.6 מ"ל עם פקק</td><td>מוצרי מעבדה קונטיננטל</td><td>4445.X</td><td>כל סוג דומה יעבוד. אנו מעדיפים מותגים שיש להם מכסים קלים לפתיחה.</td></tr><tr><td>קופסת אחסון קלקר לצינורות מיקרוצנטריפוגה (רשת 5x20)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>עיצוב זה נחמד מכיוון שהוא לא גודש את הצינורות.</td></tr><tr><td>מתקן, משחזר</td><td>אפנדורף</td><td>4982000322</td><td>כל דבר דומה יעזור להאיץ את החלוקה.</td></tr><tr><td>Pestles, מטחנות טישו חד פעמיות מפלסטיק, 1.5 מ"ל</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>זמין אצל ספקים שונים. ניתן לנקות עליים ולבצע חיטוי לשימוש חוזר.</td></tr><tr><td>צלחות BD Falcon ELISA, 96 בארות (תחתית שטוחה)</td> <td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation פיפטה, ידנית (20-200 ומיקרו; l)</td> <td>VistaLab</td><td>1057-0200 או 1070-0200</td><td>כל סוג דומה יעבוד. דגם זה ארגונומי.</td></tr><tr><td>מאגרים, מגיב סטרילי</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>כל דבר דומה יעבוד.</td></tr><tr><td>פיפטה אלקטרונית, 8 ערוצים (50-1,200 ומיקרו; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>אם היית צריך לבחור דגם אלקטרוני אחד, הגודל הזה הוא השימושי ביותר.</td></tr><tr><td>פיפטה אלקטרונית, 8 ערוצים (10-300 ומיקרו; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>כל דבר דומה יעבוד.</td></tr><tr><td>סעפת, מכונת כביסה מרובת צלחות (8 מצבים, ישר)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>כל דבר דומה יעבוד לשטיפת צלחות ידנית.</td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות עם זיהוי ספיגה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>SpectraMax 250</td><td>כל דבר דומה יעבוד.</td></tr><tr><td>עוף IgG / IgY</td><td>ארצות הברית ביולוגי</td><td>I1903-15R</td><td>זמין גם ממקורות אחרים</td></tr><tr><td>חנות מכולת חלבוני ביצה</td><td></td><td>" כל הלבנים", " מקצפי ביצים", etc.</td><td>מערבבים 5 מ"ל עם 95 מ"ל dH2O לתמיסה של 5%</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 גרם/ליטר להכנת TBS</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 גרם/ליטר להכנת TBS ו-8.0&nbsp; g&#8288;/&#8288; L עבור PBS</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 גרם/ליטר עבור PBS</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 גרם/ליטר עבור PBS</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 גרם/ליטר עבור PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, </td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1379</td> בדרגת EIA <td>הוסף 0.5 מ"ל לליטר ל-PBS לאחר המסת מלחים.</td></tr><tr><td>PBS עם 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>מערבבים שקיק 1 ב-1 ליטר dH2O</td></tr><tr><td>נוגדן נגד עוף IgY (IgG) (מולקולה שלמה) המיוצר בארנב (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>ערבוב 100 ומיקרו; l ב-50 מ"ל כף</td></tr><tr><td>חלב יבש, אבקת חלב או חלב טרי (1%)</td><td>מכולת</td><td></td><td>מערבבים 10 גרם עם 1 ליטר dH2O לתמיסה של 1%</td></tr><tr><td>נוגדן נגד עוף IgY (IgG) (מולקולה שלמה)-פרוקסידאז המיוצר בארנב (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 & l ב -1 ליטר של חלב 1%</td></tr><tr><td>נוגדן אלבומין ביצת עוף המיוצר בארנב (1: 8,000)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>מדולל 125 ומיקרו; l ב-1 ליטר PBS-BSA</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG Peroxidase מצומד (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>מדלל 0.5 מ"ל ב-1 ליטר PBS-BSA, ואז מוסיפים 1.3&nbsp; מ"ל Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) קופולימר סיליקון-פוליאתר</td><td>זרעי Lehle</td><td>VIS-01</td><td>הוסף כמרכיב אחרון</td></tr><tr><td>TMB Microwell רכיב אחד מצע פרוקסידאז</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

תנועת פרוקי רגלי ניטור נדרשה לעתים קרובות כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה הקשורים האוכלוסייה, דפוסי פיזור, העדפות צמח מארח, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות. פרוקי רגליים בדרך כלל במעקב בטבע על ידי תיוגם עם סימן ייחודי ולאחר מכן לאורך זמן ובמרחבם כדי לקבוע את יכולות פיזורם באיסוף מחדש. בנוסף לתגים פיזיים ממשיים, כגון אבק או צבע צבעוניים, סוגים שונים של חלבונים הוכחו כיעילות מאוד לסימון פרוקי רגליים למחקר אקולוגי. יכולים להינתן חלבונים פנימיים ו / או חיצוני. אז יכולים להיות שזוהו החלבונים על פרוקי רגליים וכבשו עם assay חלבון ספציפי צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). כאן אנו מתארים פרוטוקולים לחוץ וכלפי פן תיוג פרוקי רגליים עם חלבון. שתי דוגמאות ניסיוניות פשוטות הם הפגינו: (1) סימן חלבון פנימי הציג לחרקים על ידי מתן תזונה מועשר בחלבון ו- (2) סימן חלבון חיצוני topicallypplied לחרקים באמצעות nebulizer רפואי. לאחר מכן, אנו מתייחסים מדריך צעד-אחר-צעד של הכריך ושיטות ELISA עקיפים משמשות לאיתור סימני חלבון בחרקים. בהפגנה זו, היבטים שונים של הרכישה והגילוי של סמני חלבון על פרוקי רגליים לסימן-שחרור-לכבוש מחדש, סימן-ללכוד, וסוגים-סימן-לכידה העצמית של מחקר הם דנו, יחד עם הדרכים השונות כי הליך immunomarking היה מותאם כך שיתאים למגוון רחב של מטרות מחקר.

פנימי לציון: תוצאות בדיקת שימור סימן הפנימית מוצגות באיור 2 א. ערך הסף המחושב ELISA הקריטי היה 0.054. בסך הכל (כל ארבעת תאריכי המדגם משולבים), החרקים טופלו ללא חלבון הניבו ערכים נמוכים באופן עקבי ELISA (x = 0.038 ± 0.002, n = 80). לעומת זאת, כל החרקים האכילו את הדיאטה העשירה החלבון הניבה ערכים חזקים באופן ...

חלבונים משמשים לעתים קרובות לסימון פרוקי רגליים למחקר פיזור. מודגמות שיטות למתן סימני חלבון פנימיים וחיצוניים על פרוקי רגליים. טכניקות זיהוי סימני חלבון, באמצעות בדיקות אימונוסורבנט עקיפות או סנדוויץ' מקושרות לאנזים (ELISAs), מומחשות גם כן.

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

המטרה הכוללת של הדגמה זו היא לתאר כיצד לסמן חרקים עם חלבון למחקר פיזור או נדידה. בהדגמה זו כלולות שיטות כיצד לזהות את הסימנים על ידי כריך או בדיקת אימונוסורבנט עקיפה הקשורה לאנזים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחקר פיזור חרקים.ניתן להשתמש בו כדי לחקור דפוסי נדידת חרקים, העדפות צמחים מארחים של חרקים והתפשטות של מינים פולשים. היתרונות של טכניקה זו הם ששיטת הזיהוי פשוטה וזולה. מתאים לתפוקה גבוהה, וניתן לסמן בקלות את בעלי החיים ישירות בסביבתם הטבעית.בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה הזו יתקשו, מאחר שהיא נראית קשה יותר ממה שהיא באמת, מאחר שלרוב חוקרי השטח אין את הניסיון בשיטה הפשוטה הזו. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה בשנת 1989. גידלנו טורפי חרקים בעלי עיניים גדולות בתזונה מלאכותית.דאגנו שהחרקים האלה לא יהיו טורפים יעילים על מזיק חרקים ליגוס לאחר שגודלו בשבי במשך זמן רב בתזונה לא טבעית. במילים אחרות, הם היו מבויתים. היינו זקוקים לשיטה בטוחה, יעילה וזולה כדי להבדיל אותם לאחר שחרורם לשטח מעמיתיהם המקומיים.אף אחת משיטות הסימון הנוכחיות אינה עומדת בקריטריונים אלה. ניסיון קודם שהיה לי בשימוש בהליך ELISA לביצוע ניתוחי תכולת מעיים של טורפים עבור שרידי חלבון ספציפיים לליגוס, נתן לי את הרעיון להחיל סימן חלבון זר על הטורף שגדל במעבדה. בתורו, יכולנו לנתח את השדה שנאסף חרקים בעלי עיניים גדולות עבור שרידי ליגוס ועבור שרידי החלבון הזר.כדי להתחיל, אספו כ-100 חרקים מעניינים ממושבת מעבדה או מהשדה, וחלקו אותם לשני מיכלי גידול נקיים. טען מיכל אחד עם חבילת דיאטה רגילה של 20 מיליליטר, כדי לשמש כבקרה שלילית. עבור השני, שרוך חבילת דיאטה עם מיליגרם עוף IgG-IgY.מוסיפים מיליליטר תמיסה ומערבבים היטב. במידת הצורך, השתמש בכל מה שהחרקים מוזנים בדרך כלל במקום החבילה. לאחר 24 שעות של גידול על חבילות התזונה הללו, ספקו לשתי קבוצות החרקים מזון רגיל ולא מסומן.במרווחי הזמן הרצויים, אספו 20 חרקים בודדים מכל קבוצה. הקפיאו אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס, עד לאיסוף כל הקבוצות הנדרשות לניסוי. להכנת צלחת של 96 בארות ל-ELISA, לכל באר יש להוסיף 50 מיקרוליטר של נוגדן IgY ראשוני נגד עוף ארנב מדולל אחד מכל 500 במי מלח Tris-Buffered, או TBS.תנו לצלחת העמוסה לדגור לפחות שעה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, רוקנו את הבארות והוסיפו 300 מיקרוליטר תמיסת בלוקים לכל באר. זוהי תמיסת חלב יבש ללא שומן באחוז אחד.תנו לצלחת לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה של הבלוק, העבירו חרקים קפואים בודדים לצינורות מיקרו צנטריפוגות עמוסים במיליליטר אחד של TBS. לאחר מכן, הומוגניזציה יסודית של כל חרק עם עלי נקי.כאשר הצלחת מוכנה, טען כל באר ב -100 מיקרוליטר של דגימת חרקים הומוגנית אחת. כל צלחת של 96 בארות מכילה 80 דגימות. השאר את העמודה הראשונה והאחרונה של הלוח ריקות עבור פקדים.בעמודה הראשונה, טען שבעה 100 מיקרוליטר של TBS בלבד, וטען באר אחת עם 100 מיקרוליטר TBS עם בקרה חיובית של חלבון ביצה. בעמודה האחרונה, טען 100 מיקרוליטר של שמונה תכשירי חרקים בודדים לא מסומנים. אפשר לדגימות לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.לאחר הדגירה יש לשטוף בזהירות את הבארות שלוש פעמים עם Phosphate Buffered Saline Tween, או PBS-Tween. מניסיוננו למדנו שרוב השגיאות מתרחשות בשלבי הכביסה. התזה עלולה להוביל להתרחשות גבוהה של תגובות חיוביות כוזבות, לכן היזהר.לאחר השטיפה, הוסיפו 50 מיקרוליטר של IgG-IgY נגד עוף ארנב מצומד לחזרת פרוקסידאז, ודיללו אחד עד 10,000 בתמיסת חלב של אחוז אחד. אפשר לתמיסה לדגור בבארות לפחות שעה בטמפרטורת החדר. מאוחר יותר, שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם PBS-Tween כמו קודם.לאחר מכן, טען את הבארות ב -50 מיקרוליטר של מצע TMB. ייתכן שתתחיל לראות שינוי צבע מיד. תן לצלחת לדגור במשך 10 דקות לפני שתקרא אותה עם ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטה.קרא את הצלחת ב-650 ננומטר ורשום את הערכים. כדי לסמן חרקים חיצוניים, הכינו בקבוקי פלסטיק של ליטר אחד עם חורי גישה, וחלקו 100 חרקים לשני בקבוקים. לאחר מכן, יש לרסס את החרקים במיכל אחד עם מיליליטר מים מזוקקים, המשמשים כבקרה שלילית.לאחר מכן, חבר נבולייזר רפואי לשקע אוויר, והתאם את זרימת האוויר כך שהנבולייזר יפיק אדים. מרססים את החרקים האחרים במיליליטר אחד של חמישה אחוז תמיסת חלבון ביצת עוף. תהליך הריסוס אמור להימשך בין שתיים לחמש דקות.לאחר מכן, פקק את החורים ותן לתמיסה להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש, העבירו את החרקים בחזרה למיכלי הגידול הרגילים שלהם, עם התזונה הסטנדרטית שלהם ושמרו עליהם כרגיל. מאוחר יותר, אספו את החרקים במרווחי זמן קבועים מראש לבדיקה.כדי לבדוק את שימור הסימן החיצוני, השתמש בהליך זהה לבדיקת בדיקת שימור הסימן הפנימי, עם שינויים קלים. לאחר העברת החרקים לצינורות מיקרו צנטריפוגות עם TBS, תנו להם להשרות על שייקר אורביטלי במהירות של 120 סל"ד למשך שעה, במקום להפוך אותם להומוגניזציה. לאחר השריית החרקים, פיפטה 100 מיקרוליטר מהתמיסה לבארות הצלחת, ותנו לצלחת לדגור לפחות שעה.לאחר שטיפת דגימות החרקים, הוסף 300 מיקרוליטר PBS עם אחוז BSA אחד לכל באר. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר יש לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS-Tween. לאחר מכן, לכל באר, הוסיפו 50 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני נגד אלבומין ביצים של ארנב, מדולל אחד לשמונת אלפים בצללית PBS-BSA.דגרו את הצלחת למשך שעה לפחות, ושטפו את הבארות כמו קודם. לאחר מכן, לכל באר, הוסיפו 50 מיקרוליטר של IgG נגד ארנב עזים מצומד לחזרת פרוקסידאז, ודולל אחד לאלפיים, בצללית PBS-BSA. הניחו לצלחת לדגור לפחות שעה, בטמפרטורת החדר ואז המשיכו בפרוטוקול כפי שתואר קודם לכן.שמירת הסימן הפנימי נבדקה בארבע נקודות זמן. בסך הכל, החרקים שטופלו ללא חלבון הניבו ערכי ELISA נמוכים באופן עקבי. ואילו כל החרקים שהוזנו בתזונה מועשרת בחלבון הניבו ערכי ELISA חזקים באופן עקבי.ציונים חיצוניים נבדקו גם בארבע נקודות זמן. החרקים שסומנו באופן מקומי בחלבוני ביצה הניבו ערכים חזקים באופן עקבי. כצפוי, הבקרות השליליות שרוססו במים רשמו ערכי ELISA נמוכים מאוד.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסמן חרקים, ולנתח אותם לנוכחות הסימן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות ו -30 דקות אם היא מבוצעת כראוי. במהלך היום, ניתן לעבד 16 לוחות בדיקה עם הרבה יותר מ-1000 דגימות.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהבדיקה רגישה ביותר. ככזה, הכרחי שכל המשטחים, המיכלים והציוד יהיו נקיים מזיהום חלבון. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור דפוסי פיזור מקומיים ורחבים של חרקים בבתי גידול חקלאיים, עירוניים, יערות וטבעיים אחרים.הדגמנו כאן דוגמה בקנה מידה קטן, אולם הטכניקה שימשה בקנה מידה גדול בהרבה כדי לתייג את החרקים ישירות בסביבתם הטבעית באמצעות ציוד ריסוס מסחרי. נדהמנו מהיישומים היצירתיים של משתפי הפעולה שלנו.

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

פרוטוקול זה מספק הוראות לבחירת המשובטים תאים קו פליטת אור סידן assay כדי לנתח את מבנה פעילות יחסי נוירופפטידים arthropod מסונתז על GPCRs מאותו מקור שלהם. Assay זה יכול לשמש עבור deorphanization קולטן מבנה פעילות מחקרים היחסים לעיצוב אנלוגי פפטיד סינתטי / סמים להוביל לגילוי.

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

השיטה במהירות המארחות נדיפים מסך צמחים ידי מדידת התגובה של אלקטרו orangeworm הטבור מבוגר...

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

סרטון זה מדגים את ההדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון בצומת העצבי-שרירי Drosophila (NMJ) באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA). לאחר בידוד דפנות הגוף, חלבונים המקיימים אינטראקציה נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים מצומדים PLA. הקרבה של החלבונים האינטראקטיביים מקלה על קשירת בדיקות עם אוליגונוקלאוטידים מחברים, ויוצרים DNA מעגלי, אשר מוגבר לאחר מכן על ידי הגברת מעגל מתגלגל. בדיקות פלואורסצנטיות נקשרות ל-DNA המוגבר, ומאפשרות הדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון ב-NMJ.

איתור אינטראקציות חלבון-חלבון בזחלי דרוזופילה באמצעות בדיקת קשירת קרבה

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

פרוטוקול זה מתאר את השלבים עבור שימוש בתוכנה הרומן, SwarmSight, עבור מסגרת מעקב של עמדות אנטנה, חוטם חרקים מן האינטרנט המקובלת מצלמת וידאו באמצעות מחשבים קונבנציונלי. התוכנה בחינם, קוד פתוח מעבד מסגרות כ 120 פעמים מהר יותר מאשר בני אדם, מבצעת יותר דיוק אנושי.

SwarmSight: מעקב בזמן אמת של האנטנה חרקים תנועות רפלקס הרחבת חוטם באמצעות הכנה משותפת חומרה קונבנציונלי

אנו מתארים כיצד לכמת את מגורים העלה פרוקי רגליים על ידי איטום העלים והסוף של סניפים בשק, לגזור ולהקפיא את החומר הארוז, ושטיפה את החומר קפוא בעבר מים כדי להפריד פרוקי רגליים מן המצע עבור כימות.

שיטה לכימות עלווה-מגורים פרוקי רגליים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לאיסוף מספיק רוק מחרקים יונקים באמצעות מדיום מלאכותי. זוהי שיטה נוחה לאיסוף רוק חרקים וחקר תפקוד הרוק על התנהגות האכלת חרקים והעברת וירוסים המועברים בווקטורים.

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

מתוארים נהלים לחקר התנהגויות החיטוט והבליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם באמצעות אלקטרו-חדירה AC-DC.

אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

למד שיטות לסימון חלבון בחרקים לחקר פיזור ונדידה באמצעות ELISA. טכניקות אלו מאפשרות זיהוי פשוט ויעיל בסביבה טבעית, ומסייעות למדענים לחקור דפוסי הגירה ותפוצת מינים פולשים.

ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור

גלה סרטונים נוספים