Name: הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר In-Vitro איסכמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: חקור את ההבדלים המגדריים בתגובת אסטרוציטים מהיפוקמפוס לפגיעה איסכמית באמצעות מודל תרבית תאים מנתחי עכברים ניאונטליים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מנגנונים תאיים הקשורים לחומרת הפגיעה המשתנה בין זכרים לנקבות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תוכנית פרס המדע הקליני והתרגומי של NCATS UL1 TR0000427 ו-KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 ל-UW ICTR מ-NIH/NCATS וכספים ממרכז Waisman (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 מ-NINDS (Cengiz P) ו-NIH P30 HD03352 (מרכז Waisman), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). ברצוננו להודות לאלבי מסינג, דוקטורט, על שסיפק לנו את עכברי הנוקאאוט של GFAP.

הערה: המחקר נערך בהתאם להמלצת המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. פרוטוקול בבעלי חיים אושרה על ידי אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש. פרוטוקול תרבות astrocyte ראשי המוצג כאן היא אמץ הפרוטוקולים שהוצגו על ידי ג&#39;אנג Y 19 et al. ו ג&#39;נגיס P 20 et al. עם כמה שינויים. 1. בהיפוקמפוס Dissection ו astrocyte תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להכין את כל ריאגנטים החומרים הדרושים כולל מספריים כירורגיות, מלקחיים בסדר חלקה, מלקחיים קצה שטוח, מגבות נייר, שקית פסולת, אתנול 70% ו -2 מנות לנתח (קוטר 3.5 ס&quot;מ) על קרח מלא עם 2 תמיסת מלח מאוזן של מ&quot;ל האנק (HBSS) כל . ודא של ציוד הכירורגים הם סטריליים (חיטוי) לפני ההליך ולהשתמש בכל חומר אחר (astrocyte ציפוי בינוני: DMEM + 5% סוס סרום +1% פניצילין, סטרפטומיצין, סוס בסרום, HBSS, 0.25% טריפסין, coverslips זכוכית, צלחות פטרי, 15/50 צינורות מ&quot;ל, צלוחיות T25, וכו &#39;) כמו מראש סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד בעדינות ולרסס את הראש והצוואר של גור עכבר עם אתנול 70% ו לערוף באמצעות מספרי סטרילי חד [איור 1 (1)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך קו אמצע מן אחורי אל קדמי גולגולת עם מספריים קטנים לאורך הקרקפת כדי לחשוף את המוח [איור 1 (2-3)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הגולגולת בקפידה מהצוואר אל האף עם מספריים קטנים. ואז לחתוך קדמי גולגולת כדי נורה חוש הריח ונחות המוחון לנתק את הגולגולת מבסיס הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך לאורך קו האמצע. שימוש במלקחיים שטוח טיפ סטרילי לקלף את הגולגולת. סור גזע המוח בעזרת מלקחיים מעוקלים. סר המוח של הגולגולת ומקום לתוך צלחת לנתח הראשונה [איור 1 (4-9)] 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים מעוקל, להעיף את המוח כך את פני השטח הגחון של המוח הוא פונה כלפי מעלה ולאחר מכן נפרד בשתי ההמיספרות עם להב כירורגי סטרילי חד [איור 1 (10,11)] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף בחזרה את אונות מוח ובזהירות להסיר את רקמת המוח תיכונה ו התלמוס הבולטת עם מלקחיים שטוחים מעוקלים סטרילי לחשוף את ההיפוקמפוס, מבנה קטן, סוסון ים בצורה באונת הרקתית המדיאלי [איור 1 (12-14)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שתי האונות בהיפוקמפוס [איור 1 (15,16)] ובזהירות לנתח את קרומי המוח מן האונות ידי משיכת עם מלקחיים בסדר. צעד זה ימנע זיהום של התרבות astrocyte הסופית על ידי תאי קרום המוח ו פיברובלסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את האונות בהיפוקמפוס המוכנות לתוך התבשיל השני מלא HBSS ולהחזיר אותו על קרח [איור 1 (17,18)]. ברכה בשתי אונות בהיפוקמפוס מתוך עכבר אחת (P0 - P2) להכנת היפופוטםתרבויות astrocyte campal. זה נותן את הצפיפות הנכונה astrocyte. לרכך אונות בהיפוקמפוס באמצעות סכין כירורגית סטרילית חד (כ 4 פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב HBSS מצלחת באמצעות קצה סטרילי מחוברת פיפטה 1 מ&quot;ל ולהוסיף 3 מ&quot;ל של טריפסין 0.25%, לערבב, להעביר צינור חרוטי 15 מ&quot;ל סטרילי דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant בזהירות בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית מצורפת קו ריק. הוסף 10 מ&quot;ל astrocyte ציפוי בינוני ו triturate (20 - 30 פעמים) באמצעות פיפטה מזכוכית אש מלוטש עד פיסות הרקמה homogenize. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי astrocyte prewarmed הטריה. Pass תאים דרך מסנן רשת 70 מיקרומטר (מסננת תא) לתוך צינור 50 מיליליטר חרוטים חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט ההשעיה התא כולו על בקבוקון Poly-D- ליזין / Laminin מצופה תרבות T25 סטרילי המכיל 3 מ&quot;ל שלastrocyte ציפוי התקשורת, ואז דגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת כולה דיי אני n-גופית (DIV) 1, DIV 3 ו DIV 7, ולהחליף עם 2 מ&quot;ל של התקשורת ציפוי astrocyte טריים. שים את התקדמות מפגש astrocytic תחת מיקרוסקופ אור בכל פעם תוך החלפת מדיה ציפוי astrocyte. הערה: בשלב DIV 1, כל האסטרוציטים קיימא מחוברים אל פני השטח של הבקבוק התרבות תאים מתים או גוססים הכוללים נוירונים מרחפים supernatant. בשעה DIV 3, תאים המצורפת להתחיל לחלק ליצירת שכבת התאים astrocytic. בהעדר התנאים התומכים, התרבות היא כמעט נטולה כל צמיחה עצבית. בשעת DIV 7, שכבת astrocyte הם כ -80 - 90% ומחוברים וכמה microglia וכן תאי מבשר oligodendrocyte נמצאת על גבי שכבת astrocytic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום ציפוי מהבקבוק, להוסיף 2 מ&quot;ל של מדיום ציפוי astrocyte prewarmed טריים, ולשטוףnd להסיר שוב ב -11 DIV, כאשר האסטרוציטים הם ומחובר ומוכנים תת culturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של טריפסין 0.25%, בעדינות לסובב את הבקבוק כמה פעמים טריפסין לשאוב באמצעות pipet זכוכית סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של טריפסין 0.25% ולתת את הבקבוק לשבת למכסה המנוע בתרבית רקמה עבור 4 - 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את טריפסין ולשמור את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2 למשך 10 דקות. הוסף 5 מ&quot;ל prewarmed astrocyte ציפוי בינוני ולנתק את שכבת astrocytic ידי הקשה על הבקבוק על כף היד שלך (3 - 4 פעמים) ואחריו טחינה דקה ועדינה להשיג ניתוק מוחלט לאסוף את האסטרוציטים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, ולהוסיף 1 בינוני astrocyte ציפוי טרי מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של השעית תא hemocytometer ולספור את התאים באזור gridded המרכזי הגדול (1 מ&quot;מ 2) באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך (אובייקטיבי 10X). מולtiply ידי 10 4 להעריך את מספר התאים לכל מ&quot;ל. בקבוק T25 אחת יניב ~ 1 x 10 תאים 6 סך ניתק. זרע ~ 1 x 10 5 תאים 2 astrocyte מ&quot;ל בינוני ציפוי על coverslip זכוכית 12 מ&quot;מ קוטר Poly-D- ליזין precoated בבאר של תרבות צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. בצע OGD / REOX ב DIV 12 - 14 (סעיף 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את תרבויות astrocyte ב DIV 3 עם 5 המ&quot;מ L- לאוצין מהתיל אסתר (LME) hydrochloride עד DIV 11 אם תרבויות בהיפוקמפוס נטולות microglia הן רצויות. לאחר דגירת LME, תרבויות בכפופות רועד (300 סל&quot;ד עבור 1 ח) כדי להסיר זיהום microglia. הערה: LME הוא סוכן ציטוטוקסי microglial כי כבר נעשה שימוש נרחב כשיטה לחסל מתרבים microglia 22. </li></ol> 2. OGD / REOX טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב coverslip המכילה תרבות astrocyte חסידה (DIV 12 - 14) ולשטוף 3 פעמיםעל ידי בעדינות לסובב את המנה תרבות 24 גם מחזיק את coverslip כמה פעמים עם 1 מ&quot;ל איזוטוני OGD פתרון (pH 7.4) המכיל (מ&quot;מ): 0 גלוקוז, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5.36 KCl, 0.33 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 CaCl 2, ו- 0.81 MgSO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 מ&quot;ל פתרון OGD כדי גם כדי לכסות את coverslip ו דגירה עבור 2 שעות באינקובטור היפוקסי המכיל 94% N 2, 1% O 2, ו 5% CO 2. לערבב בעדינות עם שייקר מסלולית (50 סל&quot;ד) עבור היפוקסיה 30 דקות של הראשון כדי להקל חילוף הגזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לתאי קבוצת normoxic עבור 2 שעות ב 5% CO 2 ו אוויר אטמוספרי חיץ זהה הפתרון OGD למעט תוספת של גלוקוז 5.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת REOX, פתרון OGD לשאוב ולהוסיף 2 מ&quot;ל של astrocyte ציפוי בינוני. מדגירים 5% CO 2 ו אוויר אטמוספרי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות. </li></ol> 3. Immunocytochemical מכתים &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת והתרבות בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית המצורפת קו ואקום ובמהירות לשטוף coverslip פעם על ידי הוספת 1mL של 0.1 M טריס בופר (TBS) (154 mM NaCl, 16 Base מ&quot;מ Trizma, 84 mM Tris-HCl, pH 7.4) אל הבאר. לשאוב ולהוסיף 2 מ&quot;ל של paraformaldehyde 4% (PFA) ב 1x בופר פוספט (PBS). דגירה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולהוסיף 1 מ&quot;ל של 0.1 M TBS, ואז למקם על שייקר נדנדה למשך 2 דקות. חזור 3 פעמים. הוסף 1 מ&quot;ל פתרון לחסימת (סרום עיזים 10%, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA, 0.025% Triton X-100 ב 0.1 M TBS) דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פתרון חסימת ולהוסיף נוגדנים נגד GFAP חד שבטיים העכבר העיקרי (0.2 מ&quot;ל של דילול 1: 500 בחסימת פתרון) ארנב polyclonal אנטי-S100B (1: 500) או ארנבת polyclonal אנטי HIF1α (1: 200) למשך 60 דקות ב 37 ° C על שייקר נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחילופין, האסטרוציטים כמה מודגרת עם אנטי IBA1 polyclonal ארנב (1: 200) ועכבר monאנטי MAP2 oclonal לגשת טוהר התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב העיקרי נוגדן ולשטוף coverslip על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 0.1 M TBS והצבת על שייקר נדנדה למשך 2 דקות ואז לשאוב. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 מ&quot;ל של דילול 1: 200 של נוגדנים משני עז נגד ארנב 488 מצומדות ואנטי עכבר 568 מצומדות בחסימת פתרון עבור 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב משני נוגדן ולשטוף coverslip על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 0.1 M TBS ומניחים על שייקר נדנדה למשך 2 דקות ואז לשאוב. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר coverslip מבאר ויבש ידי הצבת בשקופית ניצב על יבש שקופיות. coverslip הר בשקופית חדשה על ידי היפוך על טיפה אחת של Vectashield hardset הרכבה בינונית עם DAPI (1.5 ng / μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips תמונה על מיקרוסקופ confocal או באמצעות 20X אובייקטיבי שמן יבש או 60X. לרכוש תמונות (512 x 512) עבור DAPI (לשעבר ננומטר 405/450 ננומטר em) ו fluorochrome 488 מתויג נוגדן GFAP (לשעבר ננומטר 488/515 ננומטרem). שמור פרמטרי רכישה קבועים בתוך 20X ו 60X קבוצות. </li></ol> 4. קביעת מין באמצעות PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבוהן הגור חום או קטעי האצבע על 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות ב 50 מ&quot;מ NaOH ולנטרל עם נפח שווה של 1 M טריס, pH 6.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μL של פתרון ה- DNA חילוץ 19 μL של התערובת הבאה: 5 pmoles של פריימרים עבור הגנים Myog ו Sry, מאגר התגובה 1x, 0.2 מ&quot;מ כל deoxynucleotide ו -8 פולימראז תקי U. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רצפים פריימרים; Sry 5&#39;TCATGAGACTGCCAACCACAG3 &#39;, 5&#39;CATGACCACCACCACCACCAA3&#39; ו Myog 5&#39;TTACGTCCATCGTGGACAGC3 &#39;, 5&#39;TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3&#39; 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את פרוטוקול ה- PCR הבא: 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ולאחר מכן 30 מחזורים של denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב 58 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ואת ההתארכות ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. בעקבות 30 זה מחזורי, התגובה מסכמת עם התארכות C סופית 72 מעלות במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PC הנפרדמוצרי R electrophoretically על ג&#39;ל agarose ethidium ברומיד-המכיל 2% ולדמיין תחת תאורת UV. (איור 2 א). זהירות! Ethidium ברומיד הוא קרצינוגן פוטנציאליים חייב להיות מטופל בזהירות מסולק כראוי על פי התקנות של המוסד. </li></ol>

<ol><li>Powell, E. M., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+astrocyte-mediated+cues+in+neuronal+guidance+and+process+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension.</a> Glia. 26, 73-83 (1999).</li>
<li>Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+the+regulation+of+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow.</a> Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).</li>
<li>Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+a+molecular+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).</li>
<li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%3A+an+overview%3A+structure%2C+regulation%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).</li>
<li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).</li>
<li>Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+reactive+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of reactive astrocytes.</a> Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).</li>
<li>Cengiz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform+1+is+neuroprotective+in+neonatal+hypoxic+ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+redox+signaling%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury.</a> Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).</li>
<li>Ferriero, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Neonatal brain injury.</a> The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).</li>
<li>Hill, C. A., Fitch, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+mechanisms+and+outcome+of+neonatal+hypoxia-ischemia+in+rodent+models%3A+implications+for+sex-specific+neuroprotection+in+clinical+neonatal+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice.</a> Neurol Res Int. , 1-9 (2012).</li>
<li>Cikla, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERalpha+Signaling+Is+Required+for+TrkB-Mediated+Hippocampal+Neuroprotection+in+Female+Neonatal+Mice+after+Hypoxic+Ischemic+Encephalopathy%281%2C2%2C3%29%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3).</a> eNeuro. 3, (2016).</li>
<li>Uluc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+receptor+agonist+7%2C+8+dihydroxyflavone+triggers+profound+gender-+dependent+neuroprotection+in+mice+after+perinatal+hypoxia+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).</li>
<li>Cikla, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+microglia+activation+after+hypoxia-ischemia+results+in+age-dependent+improvements+in+neurologic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury.</a> J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).</li>
<li>McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+in+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability in the developing central nervous system.</a> Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).</li>
<li>Morken, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+astrocyte-neuronal+interactions+after+hypoxia-ischemia+in+the+neonatal+brain+in+female+and+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).</li>
<li>Chisholm, N. C., Sohrabji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+response+to+cerebral+ischemia+is+influenced+by+sex+differences+and+impaired+by+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging.</a> Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).</li>
<li>Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+assessing+sex-specific+and+genotype-specific+response+to+injury+in+astrocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture.</a> Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).</li>
<li>Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Journal+of+women%27s+health+%26+gender-based%22">Journal of women's health & gender-based</a>. 10, 433-439 (2001).</li>
<li>Collins, F. S., Tabak, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Policy%3A+NIH+plans+to+enhance+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Policy: NIH plans to enhance reproducibility.</a> Nature. 505, 612-613 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78, 785-798 (2013).</li>
<li>Cengiz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Na%2B%2FH%2B+exchanger+activation+promotes+gliotransmitter+release+from+reactive+hippocampal+astrocytes+following+oxygen-glucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation.</a> PloS one. 9, e84294(2014).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).</li>
<li>McClive, P. J., Sinclair, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+DNA+extraction+and+PCR-sexing+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+reproduction+and+development%22%5BJournal%5D)">Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos.</a> Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).</li>
<li>Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+gender+determination+in+newborn+dark+pigmented+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for gender determination in newborn dark pigmented mice.</a> Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).</li>
<li>Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+primary+astrocyte+cultures+devoid+of+contaminating+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia.</a> Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).</li>
<li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55, 165-177 (2007).</li>
<li>Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+rat+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult rat astrocyte cultures.</a> PloS one. 8, e60282(2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+differences+in+reactivity+of+mouse+and+rat+astrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Signals%22%5BJournal%5D)">Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro.</a> Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).</li>
</ol>

אף אחד מהמחברים יש מתחרים או אינטרסים מנוגדים.

על מנת ללמוד את ההבדלים בין המינים במאפייני ותפקוד של האסטרוציטים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, הכנת האסטרוציטים העיקרי חרמנית תרבית תאים הוא כלי חשוב לנצל. במחקר הנוכחי אנו מדווחים יעילים שיטה לשחזור לתרבות אוכלוסיה הומוגנית מועשר של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית מן היילוד (P0-P2) C57Bl / 6 (סוג בר) או K19F (null GFAP) גורים העכבר חוץ גופית. הקמת מתודולוגיה זו מסייעת לחוקרים להבין את פונקציות פיזיולוגיים ופתולוגיים של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית לאחר איסכמיה חוץ ג...

האסטרוציטים הם אחד משחקני המפתח החשובים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS). הגוף של ראיות הולכות ומצטברות עולה כי התפקידים של האסטרוציטים הם יותר מאשר לספק תמיכה העצבית. למעשה, את התפקידים של האסטרוציטים בתנאים פיסיולוגיים יכול להיות מאוד מורכב, כמו הדרכת הגירה של אקסונים פיתוח 1, ויסות זרימת הדם CNS 2, שמירה על הומאוסטזיס pH של נוזל ביניים הסינפטי 3, והשתתפות מחסום דם מוח 4 ו -5 בשידור סינפטי. בתנאים פתולוגיים, האסטרוציטים להגיב על פשע עם תהליך הנקרא astrogliosis תגובתי שבו מורפולוגיה, מספר, מיקום, טופוגרפיה (ביחס המרחק בין עלבון) ותפקוד של האסטרוציטים עשויה להשתנות בצורה הטרוגנית 6,7. Astrogliosis לראות הבאים אנצפלופתיה איסכמית בילוד היפוקסי אולי תורם תחלואה ותמותה של ילודים <sעד&gt; 8. מחקרים קליניים וניסויים שנערכו לאחרונה מראים כי חומרת פגיעה מוחית שנראית מין תלוי וכי התינוקות ממין הזכר רגישים יותר להשפעות של היפוקסיה / איסכמיה (HI) פגיעה המוחית -related, וכתוצאה מכך הם מסוגלים נוירולוגים חמורים יותר לעומת נקבות עם נזק מוחי דומה 9-11. למרות הלוקליזציה של הפגיעה תלוי גיל ההריון ואת המשך וחומרת העלבון, ההיפוקמפוס הוא אחד האזורים שיבוצעו הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית לאחר תקופת הכהונה בילוד HI, וגדילת astrogliosis בהיפוקמפוס אושר על ידי עד-רגולציה של חלבון חומציים גליה fibrillary (GFAP) 3 ד לאחר HI בילוד 7,10,12,13. הבדלים בין מינים בתפקוד astrocyte הוצגו בשני בילודים ומכרסמים מבוגרים לאחר איסכמיה מוחית 14,15. בנוסף, הרגישות astrocytic זכר לאיסכמיה חוץ גופית הוצגה על ידי cel גדלl למוות בהשוואה האסטרוציטים קליפת המוח הנשי בתרבות 16. ההבדלים בין המינים להתחיל ב-ברחם ולהמשיך עד מוות 17. בעשור האחרון, את החשיבות של כולל המינים בתנאי ניסוי בתרבות התא ב- vivo מחקרים כבר הדגש של המכון לרפואה NIH לחפש ידע בסיסי ב ההבדלים בין המינים לראות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים 17,18 . פיתוח שיטות אמינות לבודדים ולשמור אוכלוסיות של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית חיוני להבין את הבסיס התאי של הבדלים בין מיני ההשלכות פתולוגית של HI בילוד. המחקר הנוכחי נועד לספק את הטכניקות להכין תרבויות astrocyte מועשר מין ספציפי בהיפוקמפוס מעכברים היילוד על מנת להעריך את התפקידים של האסטרוציטים GFAP-immunoreactive הבאים חמצן / מניעת גלוקוז (OGD) ו reoxygenation (REOX), גרימתHI בסביבת תרבית תאים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבחון כל שערה נוגע האסטרוציטים בהיפוקמפוס אצל זכרים ונקבות בילוד בתנאי normoxic ו איסכמי.

<table><tbody><tr><td>Astrocyte Culture media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High glucose</td><td>cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Horse</td><td>Serum Gibco</td><td>26050-070</td><td>ריכוז סופי: 10%</td></tr> <tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>30-002-CI</td><td>ריכוז סופי: 1%</td></tr> <tr><td>L-לאוצין מתיל אסטר הידרוכלוריד</td><td>Aldrich</td><td>L1002-25G</td><td>ריכוז סופי: 5 מ"מ</td></tr><tr><td><חזק>תמיסה לעיכול רקמת מוח </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סלגרו</td><td>25-050-CI</td><td>ריכוז סופי: 0.25% </td></tr><tr><td>אחר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% (נפח/נפח) אתנול</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL) כיסוי עגול 12 מ"מ&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>PBS</td></tr><tr><td></td><td>cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>דרגת תרבית תאים</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m מסננת תאים סטריליים&nbsp;</td><td>פישר</td><td>22363548</td><td></td>מדעי</tr><tr><td>3.5 ס"מ צלחת פטרי</td><td>BD פלקון</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל שפופרת בז BD</td><td>פלקון</td><td></td> 352096 <td></td></tr><tr><td>50 מ"ל שפופרת בז</td><td>BD פלקון</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים, עדין&nbsp;</td><td>Dumont</td><td>2-1032; 2-1033</td><td># 3c; # 5</td></tr><tr><td>מלקחיים, קצה שטוח</td><td>KLS Martin</td><td>12-120-11</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים 13 ס"מ</td><td>Aesculap</td><td>BC-140-R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>A1RSi&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5805000.017</td><td>5804R</td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE 4450-1CE</td><td>MaxQ 4450&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>ארנב חד שבטי</td></tr><tr><td>אנטי-MAP2</td><td>Sigma</td><td>M2320</td><td>עכבר חד שבטי</td></tr><tr><td>אנטי-HIF1alpha</td><td>abcam</td><td>ab179483</td><td>ארנב חד שבטי</td></tr><tr><td>אנטי-S100B</td><td>סיגמא</td><td>HPA015768</td><td>ארנב פוליקלונלי</td></tr><tr><td>אנטי-GFAP (קוקטייל)</td><td>Biolegend</td><td>837602</td><td></td></tr><tr><td>ערכת VECTASTAIN עלית ABC (ארנב IgG)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6101</td><td>מכיל 4 ריאגנטים&nbsp;</td></tr><tr><td>עז אנטי ארנב Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר Alexa-Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr></tbody></table>

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר<em&gt; in-vitro</em&gt; איסכמיה

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis הבא היפוקסיה / איסכמיה (HI) פגיעה מוחית -related ממלא תפקיד בתחלואה ותמותה מוגברות בילודים. מחקרים קליניים שנערכו לאחרונה מראים כי חומרת פגיעה מוחית להיראות מין תלותי, וכי התינוקות ממין הזכר רגישים יותר להשפעות של פגיעה מוחית הקשורה HI, וכתוצאה מכך הם מסוגלים נוירולוגים חמורים יותר לעומת נשים עם ניזק מוחי דומה. פיתוח שיטות אמינות לבודד ולשמור אוכלוסיות מועשרות של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית חיוני להבין את הבסיס התאי של הבדלים בין מיני ההשלכות פתולוגית של HI בילוד. במחקר זה, אנו מתארים שיטה ליצירת תרבויות astrocyte מסוימת בהיפוקמפוס מין כי הם נתון מודל של איסכמיה חוץ גופית, מניעת גלוקוז חמצן, ואחריו reoxygenation. astrogliosis תגובתי לאחר נבדק על ידי immunostaiנינג עבור חלבון חומציים גליה fibrillary (GFAP) ו S100B. שיטה זו מספקת כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של זכר האסטרוציטים בהיפוקמפוס הנקבה הבא HI בילוד, בנפרד.

הבנת התפקידים של פונקציות astrocyte חרמנית בתנאים פיסיולוגיים או pathophysiological כבר הובהר מאוד על ידי culturing תאים אלה בתנאים במבחנה. ההיבט החשוב של ביצוע culturing חרמנית הוא לקבוע את מינו של גור העכבר לפני השימוש בו. אנחנו נקבע את מינו של העכבר גנטי על ידי PCR ועל ידי הערכה חזותית (איור 2) 16. המתודולוגיה של קביעת מין באמצעות PCR אומצה עם שינויים מן McClive ו סינקלייר, הוא מהיר, פשוט, מאוד לשחזור שיטה <s...

האסטרוציטים הם אחד משחקני המפתח החשובים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מדווחים על שיטה מעשית של פרוטוקול תרבות astrocyte בהיפוקמפוס חרמנית על מנת ללמוד את המנגנונים העומדים בבסיס תפקוד astrocyte גורים הילוד זכר ונקבה לאחר חוץ גופית איסכמיה.

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר<em&gt; In-Vitro</em&gt; איסכמיה

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

המטרה הכללית של טכניקה זו היא להכין תרביות מועשרות של אסטרוציטים מההיפוקמפוס, ספציפיות למין, מעכברים שנולדו, ככלי למחקר של התפקידים הספציפיים למין של אסטרוציטים לאחר מחסור בחמצן ובגלוקוז וחמצננות מחודשת, וזאת כדי לדמות בתוך סביבת תרבית תאים איסכמיה היפוקסית in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מכניסטיות וטרנסלציוניות מרכזיות הנוגעות לתפקיד הספציפי למין של אסטרוציטים בהיפוקמפוס בעקבות איסכמיה היפוקסית במוחות של זכרים ונקבות בשלבי התפתחות. הפריד את המוח מהראש של גור עכבר בן יומיו באמצעות מספריים קטנים ליצירת חתך בקו האמצע, מאחור לקדמה, דרך העור כדי לחשוף את הגולגולת.חתכו את קו האמצע של הגולגולת בזהירות מהעורף ועד לאף. השתמשו בפינצטה סטרילית בעלת קצה שטוח כדי לקלף את השריון. הסירו את גזע המוח בעזרת פינצטה קמורה והניחו את שאר המוח בתוך צלחת ניתוח.בעזרת פינצטה מעוקלת, הפכו את המוח כך שהשטח הוונטרלי (הבטני) פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן הפרידו בין ההמיספרים בעזרת להב ניתוח סטרילי וחד. בעזרת פינצטה מעוקלת ושטוחה, קלפו לאחור את חצאי המוח והסירו בזהירות את רקמת המוח האמצעי והתלמוס הבולטים כדי לחשוף את ההיפוקמפוס, מבנה קטן בצורת סוס ים באונה הטמפורלית המדיאלית. הסירו את שתי אוניות ההיפוקמפוס ונקו בזהירות את הקרומיות (meninges) והפיברובלסטים מפני השטח של האוניות על ידי משיכה עם פינצטה עדינה.העבירו את שני האונות של ההיפוקמפוס מעכבר בודד לתוך כלי שני הממולא בכ-5 milliliters של HBSS והניחו על קרח. קצצו את האונות כ-4 פעמים באמצעות להב ניתוחי סטרילי וחד. השתמשו בפיפטה סטרילית של 1 milliliter כדי להעביר את ה-HBSS והרקמה לשפופרת קונית סטרילית של 50 milliliters, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה במהירות של 300 times G למשך 5 דקות.לאחר הצנטריפוגה, שאבו את הנוזל העליון (supernatant). הוסיפו 3 milliliters של 0.25 percent trypsin, ערבבו, והדגרימו את הרקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 20 דקות תוך כדי ניעור עדין. לאחר ההדגמה, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-300 times G למשך 5 דקות.לאחר הצנטריפוגציה, השתמש בפיפטת זכוכית סטרילית כדי לשאוב בזהירות את העלייה, ולאחר מכן הוסף 10 milliliters של מצע זריעה לאסטרוציטים שחומם מראש. בצע טריטורציה (ערבוב על ידי פיפטור) 20 עד 30 פעמים באמצעות פיפטת זכוכית שעברה חישול באש. לאחר צנטריפוגציה נוספת של 5 דקות ב-300 times G, שאוב את העלייה והוסף 2 milliliters של מצע זריעה לאסטרוציטים.העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן רשת של 70 מיקרון אל תוך מבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר. הוסיפו את כל תרחיף התאים לבקבוק תרבית T-25 סטרילי ומצופה המכיל 3 מיליליטר של מצע זריעה לאסטרוציטים. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% carbon dioxide.ביום למחרת, עקוב אחר התקדמות ההתמזגות (confluence) של האסטרוציטים תחת מיקרוסקופ אור, שאב את המצע והחלפו ב-2 milliliters של מצע פריסה טרי לאסטרוציטים. בסביבות היום ה-11 in vitro, קצור את האסטרוציטים הממוזגים על ידי שאיבת המצע ולאחר מכן הוספה של 2 milliliters של 0.25%trypsin. סובב בעדינות את הבקבוק מספר פעמים ולאחר מכן שאב את ה-trypsin באמצעות פיפט זכוכית סטרילית.הוסיפו 2 milliliters נוספים של 0.25% trypsin והשאירו את הבקריקה בטמפרטורת החדר למשך 4-5 דקות. לאחר הסרת ה-trypsin, הניחו את הבקריקה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור עם 5% CO2 למשך 10 דקות. לאחר האינקובציה, הוסיפו 5 milliliters של מצע זריעה לאסטרוציטים ושחררו את השכבה האסטרוציטית על ידי הקשה על הבקריקה 3 עד 4 פעמים.בצעו טריטורציה עדינה של תרחיף התאים לאורך תחתית הבקורה כדי להשיג ניתוק מלא, ולאחר מכן אספו את האסטרוציטים למבחנה קונית של 15 מיליליטר. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך 5 דקות. שאבו את העילאי ולאחר מכן הוסיפו 1 מיליליטר של מצע זריעה רענן לאסטרוציטים.הוסיפו 10 µL מת сусלול התאים להמוציטומטר והשתמשו במיקרוסקופ פאזה הפוך עם עדשה של 10x כדי לספור את התאים באזור הרשת המרכזי הגדול. דללו את התאים לריכוז של כ-1×10⁵ תאים ל-2 ml של מצע זריעה לאסטרוציטים. העבירו בעזרת פיפט 2 ml של ססלול התאים על גבי כיסוי זכוכית מצופה poly-d-lysine בתוך באר של צלח תרבית בעל 24 בארות.דגרו בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide. כדי להתחיל את תהליך ההרעבה מחמצן וגלוקוז (OGD), שאבו את המצע מהזכוכית המכסה המכילה אסטרוציטים דבקים ושטפו פעם אחת עם 1 mL של תמיסת OGD איזוטונית. הוסיפו 0.2 mL של תמיסת OGD לבאר והניחו באינקובטור היפוקסי.ערבבבב בעדינות באמצעות מנער אורביטלי המכוון ל-50 rpm במהלך 30 הדקות הראשונות של ההיפוקסיה. עבור חמצמון מחדש (reoxygenation), החלף את תמיסת ה-OGD ב-2 milliliters של מצע לזריעת אסטרוציטים והדגר ב-5% carbon dioxide ובאוויר אטמוספרירי בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 5 שעות. תמונת אימונופלורסצנציה זו מראה את טוהר התרבית הראשונית של אסטרוציטים מהיפוקמפוס של עכבר.תרבית האסטרוציטים צבעה בשיטת אימונו-צביעה כדי להראות את הסמן לדנדריטים עצביים, MAP2, באדום, ואת הסמן למיקרוגליה, IBA1, בירוק. הגרעינים צבועים ב-DAPI המופיע בכחול. החץ מצביע על זיהום של מיקרוגליה.תמונה זו, המהווה דוגמה לצביעה אימונופלואורסצנטית של אסטרוציטים מההיפוקמפוס שגודלו בתרבית תחת תנאי נורמוקסיה, מראה תגובה אימונו-היסטוכימית ל-GFAP באדום וסימון של HIF1-alpha בירוק. שוב, הגרעינים נצבעו ב-DAPI המופיע בכחול. החץ מצביע על ביטוי נמוך של HIF1-alpha.לאחר שעתיים של מחסור בחמצן וגלוקוז ו-5 שעות של חמצון מחדש, נרשמה עלייה בביטוי של HIF1-alpha באסטרוציטים של ההיפוקמפוס שהובאו בתרבית, כפי שניתן לראות בחץ המצביע על ביטוי גרעיני מוגבר של HIF1-alpha. ביטוי של GFAP ו-S100b עלה בתרביות של אסטרוציטים מהיפוקמפוס של עכברים זכרים בעקבות מחסור בחמצן וגלוקוז וחמצון מחדש. עלייה בביטוי של S100b ו-GFAP נצפתה גם באסטרוציטים שהופקו מעכברים נקבות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון quantitative PCR, western blotting, siRNA וצביעות אימונוהיסטוכימיות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון שינויים תלויי-מין בביטויים של גנים וחלבונים מסוימים בעקבות איסכמיה in vitro. לאחר פיתוחה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לבחון את ההשפעות וההשלכות של שבץ בתוך ההיפוקמפוס באמצעות חקר אסטרוציטים בתרבית.

sex-differences-mouse-hippocampal-astrocytes-after-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Moye, S. L., et.al.  ויזואליזציה של מורפולוגיה של אסטרוציטים באמצעות יונטופורזיס צהוב של לוציפר. J. Vis. exp. (2019).  סרטון זה מדגים את השימוש ביונטופורזיס בצבע פלואורסצנטי כדי לחקור מורפולוגיה של אסטרוציטים בפרוסות מוח קבועות. הוא מפרט את הניקוב של סומה האסטרוציטים עם אלקטרודה כדי להעביר צבע אניוני, הידרופילי לתוך הציטופלזמה תחת זרם מתח נמוך, מה שמאפשר לצבע לפזר ולתייג את הסומה והענפים. לאחר מכן משתמשים במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש את האסטרוציטים המסומנים ולספק תובנות מורפולוגיות.

הדמיה של מורפולוגיה של אסטרוציטים באמצעות יונטופורזה של צבע פלואורסצנטי בפרוסת מוח קבועה של עכבר

תרביות עצביות עובריות מנותקות ראשוניות בהיפוקמפוס שימושיות לחקירת מנגנוני האיתות המעורבים במוות נוירונים. מין העוברים לפני הבידוד והדיסוציאציה של ההיפוקמפוס מאפשר הכנה של תרביות זכר ונקבה נפרדות, מה שמאפשר לחוקר לזהות ולחקור איתות תאים ספציפיים למין.

תרביות עצביות מרובדות מין לחקר מסלולי מוות של תאים איסכמיים

טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי

ביצענו חד-צדדית העורק הראשי סגר ביום כמחנכת CD 7-10-1 עכבר הגורים כדי ליצור מודל neonatal לפציעה hypoxic-איסכמי (איץ ' אי), חקר את ההשפעות של פגיעה מוחית HI. למדנו neurobehavioral פונקציות אלו עכברים לעומת עכברים רגילים שאינם המופעלים.

Neurobehavioral הערכות במודל של עכברים של פגיעה מוחית לפציעה Hypoxic-איסכמי Neonatal

כתב היד הנוכחי מפרט כיצד לבודד היפובין ונימים ממוח העכבר וכיצד ללחוץ אותם על מיגרפיה ללחץ, immunofluorescence ביוכימיה, מחקרים מולקולריים.

Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי

פרוטוקול זה מתאר שיטות לחתך, צביעה והדמיה של מקטעי רקמה צפים בחופשיות במוח העכבר, ולאחר מכן תיאור מפורט של ניתוח נפח טריטוריית האסטרוציטים וחפיפת שטח האסטרוציטים או הריצוף.

ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות

הפרוטוקול מתאר פגיעה מוחית טראומטית קלה במודל עכבר. בפרט, פרוטוקול שלב אחר שלב לגרימת פגיעת ראש סגורה קלה בקו האמצע ואפיון מודל בעלי החיים מוסבר במלואו.

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

פרוטוקול זה מתאר את הביטוי החוץ רחמי בתיווך ויראלי של Neurod1 לאחר שבץ איסכמי קליפת המוח. Neurod1 מועבר (1) באמצעות מערכת Cre-Flex AAV בעכברים מסוג בר במהלך השלב התת-חריף לאחר שבץ מוחי (7 ימים) ו-(2) באמצעות וקטור AAV יחיד בעכברים מדווחים מותנים במהלך השלב הכרוני שלאחר השבץ (21 ימים).

מערכות AAV ומודלים של עכברים לחקירת ביטוי חוץ רחמי של Neurod1 בתאים שעברו התמרה בזמנים תת-חריפים וכרוניים לאחר שבץ איסכמי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת היפוקסיה בעכברים יילודים על ידי מסירתם בסביבות מבוקרות עם ריכוזי חמצן משתנים. מודלים של עכברים שנחשפו לשינויי חמצן בלידה שינו לאורך זמן את הביטוי של miRNAs המעורבים באינדוקציה של שינויים פנוטיפיים התנהגותיים כגון אוטיזם.

היפוקסיה משנה את רמות ה-miRNAs המעורבים בתורשה לא מנדלית של הפרעת הספקטרום האוטיסטי בעכברים

חקור את ההבדלים המגדריים בתגובת אסטרוציטים מהיפוקמפוס לפגיעה איסכמית באמצעות מודל תרבית תאים מנתחי עכברים ניאונטליים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מנגנונים תאיים הקשורים לחומרת הפגיעה המשתנה בין זכרים לנקבות.

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר

גלה סרטונים נוספים