הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר

המטרה הכללית של טכניקה זו היא להכין תרביות מועשרות של אסטרוציטים מההיפוקמפוס, ספציפיות למין, מעכברים שנולדו, ככלי למחקר של התפקידים הספציפיים למין של אסטרוציטים לאחר מחסור בחמצן ובגלוקוז וחמצננות מחודשת, וזאת כדי לדמות בתוך סביבת תרבית תאים איסכמיה היפוקסית in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מכניסטיות וטרנסלציוניות מרכזיות הנוגעות לתפקיד הספציפי למין של אסטרוציטים בהיפוקמפוס בעקבות איסכמיה היפוקסית במוחות של זכרים ונקבות בשלבי התפתחות. הפריד את המוח מהראש של גור עכבר בן יומיו באמצעות מספריים קטנים ליצירת חתך בקו האמצע, מאחור לקדמה, דרך העור כדי לחשוף את הגולגולת.

חתכו את קו האמצע של הגולגולת בזהירות מהעורף ועד לאף. השתמשו בפינצטה סטרילית בעלת קצה שטוח כדי לקלף את השריון. הסירו את גזע המוח בעזרת פינצטה קמורה והניחו את שאר המוח בתוך צלחת ניתוח.

בעזרת פינצטה מעוקלת, הפכו את המוח כך שהשטח הוונטרלי (הבטני) פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן הפרידו בין ההמיספרים בעזרת להב ניתוח סטרילי וחד. בעזרת פינצטה מעוקלת ושטוחה, קלפו לאחור את חצאי המוח והסירו בזהירות את רקמת המוח האמצעי והתלמוס הבולטים כדי לחשוף את ההיפוקמפוס, מבנה קטן בצורת סוס ים באונה הטמפורלית המדיאלית. הסירו את שתי אוניות ההיפוקמפוס ונקו בזהירות את הקרומיות (meninges) והפיברובלסטים מפני השטח של האוניות על ידי משיכה עם פינצטה עדינה.

העבירו את שני האונות של ההיפוקמפוס מעכבר בודד לתוך כלי שני הממולא בכ-5 milliliters של HBSS והניחו על קרח. קצצו את האונות כ-4 פעמים באמצעות להב ניתוחי סטרילי וחד. השתמשו בפיפטה סטרילית של 1 milliliter כדי להעביר את ה-HBSS והרקמה לשפופרת קונית סטרילית של 50 milliliters, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה במהירות של 300 times G למשך 5 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, שאבו את הנוזל העליון (supernatant). הוסיפו 3 milliliters של 0.25 percent trypsin, ערבבו, והדגרימו את הרקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 20 דקות תוך כדי ניעור עדין. לאחר ההדגמה, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-300 times G למשך 5 דקות.

לאחר הצנטריפוגציה, השתמש בפיפטת זכוכית סטרילית כדי לשאוב בזהירות את העלייה, ולאחר מכן הוסף 10 milliliters של מצע זריעה לאסטרוציטים שחומם מראש. בצע טריטורציה (ערבוב על ידי פיפטור) 20 עד 30 פעמים באמצעות פיפטת זכוכית שעברה חישול באש. לאחר צנטריפוגציה נוספת של 5 דקות ב-300 times G, שאוב את העלייה והוסף 2 milliliters של מצע זריעה לאסטרוציטים.

העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן רשת של 70 מיקרון אל תוך מבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר. הוסיפו את כל תרחיף התאים לבקבוק תרבית T-25 סטרילי ומצופה המכיל 3 מיליליטר של מצע זריעה לאסטרוציטים. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% carbon dioxide.

ביום למחרת, עקוב אחר התקדמות ההתמזגות (confluence) של האסטרוציטים תחת מיקרוסקופ אור, שאב את המצע והחלפו ב-2 milliliters של מצע פריסה טרי לאסטרוציטים. בסביבות היום ה-11 in vitro, קצור את האסטרוציטים הממוזגים על ידי שאיבת המצע ולאחר מכן הוספה של 2 milliliters של 0.25%trypsin. סובב בעדינות את הבקבוק מספר פעמים ולאחר מכן שאב את ה-trypsin באמצעות פיפט זכוכית סטרילית.

הוסיפו 2 milliliters נוספים של 0.25% trypsin והשאירו את הבקריקה בטמפרטורת החדר למשך 4-5 דקות. לאחר הסרת ה-trypsin, הניחו את הבקריקה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור עם 5% CO2 למשך 10 דקות. לאחר האינקובציה, הוסיפו 5 milliliters של מצע זריעה לאסטרוציטים ושחררו את השכבה האסטרוציטית על ידי הקשה על הבקריקה 3 עד 4 פעמים.

בצעו טריטורציה עדינה של תרחיף התאים לאורך תחתית הבקורה כדי להשיג ניתוק מלא, ולאחר מכן אספו את האסטרוציטים למבחנה קונית של 15 מיליליטר. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך 5 דקות. שאבו את העילאי ולאחר מכן הוסיפו 1 מיליליטר של מצע זריעה רענן לאסטרוציטים.

הוסיפו 10 µL מת сусלול התאים להמוציטומטר והשתמשו במיקרוסקופ פאזה הפוך עם עדשה של 10x כדי לספור את התאים באזור הרשת המרכזי הגדול. דללו את התאים לריכוז של כ-1×10⁵ תאים ל-2 ml של מצע זריעה לאסטרוציטים. העבירו בעזרת פיפט 2 ml של ססלול התאים על גבי כיסוי זכוכית מצופה poly-d-lysine בתוך באר של צלח תרבית בעל 24 בארות.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide. כדי להתחיל את תהליך ההרעבה מחמצן וגלוקוז (OGD), שאבו את המצע מהזכוכית המכסה המכילה אסטרוציטים דבקים ושטפו פעם אחת עם 1 mL של תמיסת OGD איזוטונית. הוסיפו 0.2 mL של תמיסת OGD לבאר והניחו באינקובטור היפוקסי.

ערבבבב בעדינות באמצעות מנער אורביטלי המכוון ל-50 rpm במהלך 30 הדקות הראשונות של ההיפוקסיה. עבור חמצמון מחדש (reoxygenation), החלף את תמיסת ה-OGD ב-2 milliliters של מצע לזריעת אסטרוציטים והדגר ב-5% carbon dioxide ובאוויר אטמוספרירי בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 5 שעות. תמונת אימונופלורסצנציה זו מראה את טוהר התרבית הראשונית של אסטרוציטים מהיפוקמפוס של עכבר.

תרבית האסטרוציטים צבעה בשיטת אימונו-צביעה כדי להראות את הסמן לדנדריטים עצביים, MAP2, באדום, ואת הסמן למיקרוגליה, IBA1, בירוק. הגרעינים צבועים ב-DAPI המופיע בכחול. החץ מצביע על זיהום של מיקרוגליה.

תמונה זו, המהווה דוגמה לצביעה אימונופלואורסצנטית של אסטרוציטים מההיפוקמפוס שגודלו בתרבית תחת תנאי נורמוקסיה, מראה תגובה אימונו-היסטוכימית ל-GFAP באדום וסימון של HIF1-alpha בירוק. שוב, הגרעינים נצבעו ב-DAPI המופיע בכחול. החץ מצביע על ביטוי נמוך של HIF1-alpha.

לאחר שעתיים של מחסור בחמצן וגלוקוז ו-5 שעות של חמצון מחדש, נרשמה עלייה בביטוי של HIF1-alpha באסטרוציטים של ההיפוקמפוס שהובאו בתרבית, כפי שניתן לראות בחץ המצביע על ביטוי גרעיני מוגבר של HIF1-alpha. ביטוי של GFAP ו-S100b עלה בתרביות של אסטרוציטים מהיפוקמפוס של עכברים זכרים בעקבות מחסור בחמצן וגלוקוז וחמצון מחדש. עלייה בביטוי של S100b ו-GFAP נצפתה גם באסטרוציטים שהופקו מעכברים נקבות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון quantitative PCR, western blotting, siRNA וצביעות אימונוהיסטוכימיות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון שינויים תלויי-מין בביטויים של גנים וחלבונים מסוימים בעקבות איסכמיה in vitro. לאחר פיתוחה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לבחון את ההשפעות וההשלכות של שבץ בתוך ההיפוקמפוס באמצעות חקר אסטרוציטים בתרבית.