Name: Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: חקור שיטות אובדן ורווח פונקציה לזיהוי קולטן Neogenin המשפיע על התמיינות תאי עובר עכבר בטרם השרשה. שיטה זו מאפשרת הבנת החלטות גורל תאי מוקדמות בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים גם רוצים להכיר החוקרים שיונג ורג &#39;יה למדעי הבריאות באוניברסיטת לייצור ושיתוף בונה עבור neogenin וקטורים cDNA ו shRNA. מחקר זה נתמך על ידי תרומות של תוכנית המחקר במדע בסיסי (2013R1A1A4A01012572) במימון קרן מחקר קוריאה על ידי מענק מחקר מן Sahmyook האוניברסיטה.

הערה: כל הנהלים לרבייה החי אכפת נערכו בהתאם לתקנות IACUC של Sahmyook אוניברסיטת סיאול, דרום קוריאה. 1. superovulation, גידול ובידוד oviduct <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על מולדת C57BL / 6 עכברים בתנאים הבאים: 22 ± 3 מעלות צלזיוס, ~ 60% לחות, 12 שעות אור / חושך מחזור, ו כרצונך מים ומזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות superovulation של עכברות בן שבוע 3-5 על ידי זריקה intraperitoneal של גונדוטרופין בסרום סוסה הרה 5 IU (PMSG) ב 0.1 מ&quot;ל / ראש וכעבור 48 שעות על ידי זריקה intraperitoneal של 5 גונדוטרופין כוריוני אנושי IU (hCG) ב 0.1 מ&quot;ל /רֹאשׁ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הזרקת hCG, להזדווג נקבות נגרם superovulation עם זכרים בוגרים מינית מאותו הזן ידי שמירה על אותם באותו הכלוב הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לאשר הזדווגות מוצלחת על ידי הנוכחות של תקע הזדווגות או תוסף נרתיק על בדרכי המין הנשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברות בהריוןשיכרון 2 על ידי ה- CO ואחריו hr 18-20 נקע בצוואר הרחם לאחר ההזרקה hCG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן על ידי חיתוך העור ולאחר מכן שכבת הצפק עם מספריים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את קרני הרחם עם מלקחיים בסדר למשוך את הרחם, השחלה, השחלה, ואת כרית שומן בעדינות מחלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את השטח שבין oviduct ואת השחלה עם מספריים בסדר. מיקום מחדש של מלקחיים ולחתוך הרחם ליד השחלה, משאיר לפחות 1 ס&quot;מ של החלק העליון של הרחם המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ampulla oviductal לצלחת פטרי 35 מ&quot;מ המכיל בינוני M16 בטמפרטורת החדר. לרכז את oviducts מכמה עכברים באותה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות מתחת סטראו לשליפה של עוברים. </li></ol> 2. אחזור והתרבות של 2-Pronuclear (2-PN) עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה של מחט המזרק G 30 או 32, לטחון אותו לתוך קצה קהה, ולהשתמש בו בתור מחט שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמשמלקחיים בסדר להחליק סוף oviduct על מחט שטיפה. לחץ בעדינות את קצה מחט השטיפה נגד התחתון של המנה כדי להחזיקו במקום. שטוף את oviduct עם ~ 0.1 מ&quot;ל של מדיום M16 לשחרר את העוברים 2-PN לתוך צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את עוברי 2-PN יחד עם סובבי המונים קומולוס ממדיום M16 הסמוק תחת סטראו בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק תאי קומולוס מן העוברים 2-PN ידי עיכול אנזימטי עם 1.0 מיליליטר של hyaluronidase 0.1-0.5% ב פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערטל העוברים על ידי pipetting בעדינות עם טפטפת זכוכית והסרה פיזית של תאי קומולוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברי ערומים שלוש פעמים עם 30-50 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגר פוספט טרי (PBS) לכל עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים בצלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ פטרי במדיה M16 בתוספת 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אלבומין בסרום שור (BSA, Fractיון V) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור humidified עד microinjection הוא עשה, שהיא בדרך כלל פחות מ 4 שעות מאוחר יותר. </li></ol> 3. העובר שעתוק לאחור (RT) ואת תגובת שרשרת פולימראז (PCR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף לפחות 10 עוברי של כל שלב עד שלב הבלסטוציסט ובריכת אותם 4.0 μl של 5x הפוכה פתרון transcriptase מראש תערובת המכילה transcriptase הפוכה, מעכב RNase, פריימר dT אוליגו, 6mers אקראי, תערובת dNTP, ואת חיץ התגובה בתוך צינור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מזוקקים RNase ללא H 2 O ל בהיקף כולל של 20 μl ו sonicate את העוברים ונקווה למשך 30 שניות ב 200 W. ליזום את התגובה RT מיד על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ואחריו הדגירה 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל 5.0 μl של פתרון cDNA שנוצר, לנהל הגברה PCR רגילה עם צבעי יסוד neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, או β-אקטין (רצפים פריימר מתפרסמים בלוח </stronז&gt; 1. PCR מורכב מ -40 מחזורי דגירה 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות בטמפרטורת חישול (שניתן לראות בטבלה 1), ו -30 שניות על 72 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוצרי ה- PCR נפרד על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל 2% agarose ולדמיין את הג&#39;ל תחת אור UV לאחר מכתים עם ברומיד ethidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל ביטוי גן המטרה נגד רמות β-אקטין. </li></ol> 4. Immunocytochemistry של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן עובר כל שלב עם paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר ואחריו כביסה קצרה 3 פעמים עם PBS המכיל 0.01% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום התא Permeabilize ידי דוגרים 10 עוברים 1.0 מ&quot;ל של PBS המכיל 0.1% Tween 20 ו -0.1% TritonX-100 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסום ספציפי מחייב דגירה עוברים permeabilized ב 1.0 מ&quot;ל של PBS השלימו עם 10% נסיוב עז נורמלי במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שנינות עוברת החסומותh ארנב נוגדנים נגד neogenin ב 1: 100 דילול ב PBS המכיל BSA 0.1% לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה שוטף במשך 30 שניות כל בטיפות של PBS, דגירה עוברים גם עם Alexa 488 מצומדות עז IgG נגד ארנב או אלקסה 568 מצומדות IgG נגד ארנב עז ב 1: 500 דילול בתמיסה PBS / BSA לילה ב 4 ° C . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש סיבי אקטין, דגירה עוברים 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​phalloidin ב PBS עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם גרעינים ידי הוספת 5 מ&quot;ל PBS המכיל 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עובר שלוש פעמים בקצרה עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עובר לשקופית זכוכית ומכסה אותם עם טיפה של שמן מינרלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות בהגדלה 1,000X עם מיקרוסקופ confocal עם עירור של אורך הגל המתאים. </li></ol> 5. הכנת Neogenin-RFP ו Neogenin-siRNA GFP פלסמידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תַתלשבט cDNA קידוד העכבר neogenin לתוך חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) המכילים וקטור, וכתוצאה מכך-RFP neogenin-דגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone RNA סיכת הראש הקטן מיקוד neogenin לתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק ברקת (EmGFP) המכיל וקטור, וכתוצאה מכך pcDNA-EmGFP מיר-neogenin (שמוצג באיור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר הן פלסמידים neogenin-דגל-RFP ו pcDNA-EmGFP מיר-neogenin ולטהר אותם עם שיטות קונבנציונליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ריכוזי הסופי של פלסמידים ~ 1.0 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב חיץ סטרילי טריס-EDTA (TE). </li></ol> 6. Microinjection של פלסמידים לתוך 2-PN עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את עוברי 2-PN הערום פעם בחטף, עם תקשורת M16 טריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עוברים 2-PN במשך 10 דקות XG ב 1000 בצנטריפוגה בטבלה העליונה כדי לאפשר תצפית של pronuclei. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברת בטיפת מייקרו של 20-30 μl של תקשורת M16 לכל עובר תחת שמן מינרלים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עבור additihr 1-2 onal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור טפטפות הזרקת טפטפות מחזיק ידי משיכת צינור נימי בורוסיליקט זכוכית (OD = 1.2 מ&quot;מ; ID = 0.94 מ&quot;מ) עם חולץ מכני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק טפטפות הזריק לקבל טיפים בוטים ופתחים מלוטשים באורך טיפ &lt;500 מיקרומטר ו 1-2 קוטר פנימי טיפ מיקרומטר באמצעות microgrinder וכן microforger. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק מחזיק טפטפות כאלה שיש להם טיפים בוטים ופתחים מלוטשים בקוטר פנימי של 20 מיקרומטר קוטר חיצוני של 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפטפות הזרקה טען עם כמות מספקת (&gt; 200 nl) של פתרון פלסמיד ב 1.0 מיקרוגרם / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microinject ~ 10 pl של פתרון פלסמיד עבור כל העובר 2-PN לאחת pronuclei באמצעות microinjector המצורפת micromanipulator ממונע; במהלך תהליך זה, לשמור עובר במצב על ידי הפעלת לחץ שלילי עם פיפטה מחזיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר microinjection, לשטוף את העוברים 2-PN 3 פעמים עם התקשורת M16 טרי lESS מ -1 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות עובר 2-PN בטיפת תקשורת M16 הטרי על צלחת פלסטיק תרבות המכוסית על ידי ירידת שמן מינרלים כדי למנוע אידוי תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העוברים על 24 מרווחי hr תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 200X. </li></ol>

<ol><li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li>
<li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li>
<li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li>
<li>Ovitt, C. E., Schöler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Oocyte+Microinjection%2C+Maturation+and+Ploidy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).</li>
<li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li>
<li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development%3A+Its+role+in+compaction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).</li>
<li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989(2014).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li>
</ol>

אין המחברים אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטות חדשניות של microinjection של חומרים גנטיים, או cDNA או shRNA, לתוך עוברי עכברים 2-PN כדי לחקור את תפקיד neogenin ב התמיינות תאים מוקדם במהלך העובר העכבר. הנדסה גנטית של עבר preimplantation היא טכניקה רבה עצמה בחשיפת מידע חשוב על מנגנונים מולקולריים שבבסיס עבור, למשל, קביעת שושלת התא הראשונה. הנדסה גנטית היא אחת השיטות הנפוצות ביותר עבור בירור תפקוד גן. עם receptibility גדול יחסית של עוברים 2-PN לחומרים גנטיים זרים ועל כדאיות של microinjection של...

ההתפתחות העוברית preimplantation ניתן לחלק מספר שלבים ברורים, החל משלב-תא אחד מורולה ואת הבלסטוציסט. עדויות רבות עולה כי הקוטביות רמזים מיקומית לשחק תפקיד בקביעת גורל התא מוקדם לתוך trophectoderm (TE) ואת מסת התאים הפנימית (ICM). עם זאת, האופי של הרמזים, איך הם transduced לאותות הסלולר, וההקשרים הפיסיולוגיים שבו אותות כאלה מסוגלים ליזום בידול שושלת תא אינם ידועות. תאים מובחנים אלה אז עוברים התמחות, החל לקחת על מבנים אופייניים ופונקציות הדרושים להיווצרות נכונה העובר וצמיחה של השליה 1-3. עוברי אדם במיוחד למניפולציה על ידי הזרקה ישירה של חומרים גנטיים שונים כמו siRNA או cDNA היעד ולכן יכולים להיות מנוצל כדי ללמוד מולקולות מטרה ספציפיות. יש הבנה גוברת כי גנטיניתוח של עוברי החולייתנים הוא קריטי לקידום הבנתנו התפתחות העוברית 4. מבוא מדויק של גן wild-type או צורת מוטציה לעובר בהקשר בזמן להשיג gain- או פסד של פונקציה של הגן מאוד קל בחקר גנים מוסדרים מבחינה התפתחותית. Loss- ולהשיג של פונקציה באמצעות microinjection של חומרים גנטיים לעוברי פרט מוקדמים שאינם יונקים יונקים הוא יחסית פשוט בגלל הגודל שלהם גדול פתיחות רבה 5. Microinjection טיפוסית מבוצעת וקטורים שאינם ויראלי. יתרון מסוים נלקח של קלות השימוש וקטורים שאינם נגיפי מעל וקטורים transgenes ויראלי. Loss- מהירה או רווח של פונקציה במערכת הביטוי עובר עכברים פותחה המאפשרת לנו לנתח ולהבין פונקציות גני אמבריולוגיה חוליות 6,7. תיוג פלורסנט של עוברי היה מאוד להקל על הבחירה של microinjected או מניפולציות גנטיות עוברים ובאותו זמן להעניק אמצעי לכמת את רמת הביטוי בעקיפין של microinjected siRNA או cDNA מבוסס על עוצמת פלורסנט 8. כדי להשיג תיוג זה, cDNA חלבון פלואורסצנטי, GFP או RFP, הם כמו שיתוף מוזרק או בונה היתוך או בנפרד. עוצמת הקרינה של ה- GFP או RFP החושף את מידת הביטוי של siRNA או דנ&quot;א זר על מנת להבטיח כי loss- או לזכות של פונקציה הושג. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיקרומניפולציה עבור טכניקה פונקציה loss- ורווח-של- שאפשרה לנו לזהות neogenin כמו קולטן המעביר אותות תאיים חשובים התמיינות תאים מוקדם עוברי עכברים preimplantation.

<table><tbody><tr><td>M16 בינוני,</td> <td>Gibco BRL (גרנד איילנד, ניו יורק)</td> <td>M7292 LOT # 11A832</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים, &nbsp;</td><td>Dako (גלוסטרופ, דנמרק)</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Folligon, Intervet, הולנד</td><td>G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td><td></td></tr><tr><td>גונדוטרופין כוריוני אנושי וגונדוטרופין בסרום סוסה בהריון&nbsp;</td><td>(Intervet, הולנד)</td> <td>(invitrogen , 15596-026)</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&reg; III Reverse Transcriptase</td><td>lifetechnologies</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>PCR pre mix</td><td>&nbsp;( ביוניר, דאג'ון, דרום קוריאה)</td><td>GenDEPOT , A0224-050</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז (דרגה מולקולרית)</td> <td>BioRad</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד, 4% ב-PBS</td><td>Affymetrix ארה"</td>ב <td>19943</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-ניאוגנין ארנב פוליקלונלי</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"</td>ב <td>SC-15337</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 תויג נוגדן נגד ארנב</td><td>בדיקות מולקולריות (Invitrogen, ארה"ב)</td><td>A-11094</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 555 עם תווית נוגדן נגד ארנב</td><td>בדיקות מולקולריות (Invitrogen, ארה"ב)</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 555 בדיקות מולקולריות של פלואידין</td><td>(Invitrogen, ארה"ב)</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי RGM-C/Hemojuvelin</td><td>R&;D מערכות</td><td>3720-RG</td><td></td></tr><tr><td>כל מבני הפלסמיד&nbsp;</td><td>פרופ' וון צ'נג שיונג מאוניברסיטת ג'ורג'יה למדעי הבריאות (אגוסטה, ג'ורג'יה).</td><td></td><td>למחקרים הנוכחיים סופקו באדיבות על ידי&nbsp;</td></tr><tr><td>ניאון&רג; &nbsp; מערכת טרנספקציה</td><td>lifetech</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>סטריאו מיקרוסקרופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקרו-mainpulation עם ניקון</td><td>ניקון</td><td>Narishige ONM-1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מזרק</td><td>ניקון Narishige</td><td>GASTIGHT #1750</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק</td><td>ניקון Narishige Narishige</td><td>IM 16</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופוגה</td><td>ניקון Narishige</td>מטחנת <td>Narishige MF-900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>EG400</td><td></td></tr><tr><td>חולץ</td><td>Sutter Instrumnet חברה</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממה</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>EW-39320-16</td><td></td></tr><tr><td>Veriti&reg; מחזור תרמי 384 בארות&nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>4388444</td><td></td></tr></tbody></table>

loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

טכניקות השתקת גנים וביטוי יתר הן חיוניות לזיהוי גנים המעורבים בהתפתחות העוברית. שינוי גן מטרה ישיר בעוברים טרום השרשה מספק אמצעי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של גנים המעורבים, למשל, בהתמיינות תאית לטרופקטודרם (TE) ולמסת התא הפנימית (ICM). כאן, אנו מתארים פרוטוקול הבוחן את תפקידו של ניאוגנין כקולטן אותנטי לקביעת גורל התא הראשוני בעוברי עכברים טרום השרשה. ראשית, אנו דנים במניפולציות הניסיוניות ששימשו לייצור רווח והפסד של תפקוד ניאוגנין על ידי הזרקת מיקרו-ניאוגנין cDNA ו-shRNA; היעילות של גישה זו אושרה על ידי מתאם חזק בין רמות הביטוי הזוגיות של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לבין הכימות האימונוציטוכימי של ביטוי ניאוגנין. שנית, ביטוי יתר של ניאוגנין בעוברי עכברים לפני השרשה מוביל להתפתחות תקינה של ICM בעוד שהפלת ניאוגנין גורמת ל-ICM להתפתח בצורה לא תקינה, מה שמרמז על כך שניאוגנין יכול להיות קולטן המעביר רמזים חוץ-תאיים כדי להניע בלסטומרים לגורל תאים מוקדם. בהתחשב בהצלחתו של פרוטוקול מפורט זה בחקירת תפקודו של קולטן ספציפי לשלב התפתחותי עוברי חדש, אנו מציעים שיש לו פוטנציאל לסייע בחקירה וזיהוי של גנים ספציפיים לשלב אחר במהלך האמבריוגנזה.

גילינו כי neogenin מתבטא זמני במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים של עוברי עכברים preimplantation, המופיע מוקדם ככל בשלב 2 תאים ומתמשך עד מורולה מוקדם אבל הופך לקוי בבית מורולה מאוחר ושלבי הבלסטוציסט (איור 2 א). בנוסף, הפריסה המרחבית של neogenin הוגבלה בעיקר לתאים בחוץ. תוצאות ניתוח RT-PCR היו תואמים את האופי המוקדם וחולפת ביטוי neogenin, לשיא בשלב 4 תאים אבל חסר לחלוטין בשלב 16 התאים או במאוחר (תרשים 2B). לעומת זאת, ה- F...

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש במניפולציות של אובדן ותגבּור תפקוד (loss-and gain-of-function) כדי לזהות מולקולות ספציפיות לשלב השולטות בדיפרנציאציה של מסת התאים הפנימית בעוברים של עכברים במהלך שלב טרום-ההשתרשות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה מרכזית בנוגע לשחרור גורל התאים המוקדם בביולוגיה התפתחותית בסיסית, כמו גם בביולוגיה של תאי גזע, במדעי החיות ובביוטכנולוגיה של רבייה, כגון שיבוט בעלי חיים. היעד העיקרי של טכניקה זו הוא שימוש ברצפטור ספציפי לשלב, ובליגנדים המשמשים להגברת הביטוי של גורם ספציפי לתאי גזע עובריים בלבד במהלך התפתחות העובר.פרוטוקול זה פותח בשיתוף פעולה עם מספר מעבדות. לכן, מי שידגים את התהליך יהיה השותף שלי, פרופסור Sang Jin Lee, וסטודנט הדוקטורט שלו, Yong Il Cho. 18 עד 20 שעות לאחר ההזרקה האחרונה, יש להקריב את הנקבות ההרות באמצעות הרעלה בבידוד הפחמימן (carbon dioxide) ולאחריה פריקה של עמוד השדרה הצווארי.לאחר מכן, פתחו את הצד האחורי וגזרו את השכבה הפנימית בעזרת מספריים עדינים. אתרו והרימו את קרני הרחם באמצעות פינצטה עדינה, ומשכו אותן בעדינות אל מחוץ לחלל הגוף, יחד עם הרחם, צינור הביצים, השחלה ורפידות השומן. לאחר מכן, גזרו את האזור שבין צינור הביצים לשחלה בעזרת מספריים עדינים.לאחר מכן, מקם מחדש את הפינצטה וגזור את הרחם סמוך לבית החבירה של חסום הביצה, באופן שישאיר לפחות סנטימטר אחד מהחלק העליון של הרחם מחובר. כעת, העבר את האמפולה של בית החבירה לתוך טיפת מצע M16 מכוסה בשמן מינרלי בצלחת פטרי של 35 מילימטרים בטמפרטורת החדר. רכז את בתי החבירה ממספר עכברים באותה צלחת.לאחר הכנת מחט המזרק בנפח 1 CC, כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להחזיק ולהחדיר את הקצה אל תוךו של הצינור המביא (oviduct). לאחר מכן, נקבו בעדינות וסחטו החוצה את מסת התאי העזריים (cumulus mass) בשלב טיפת התווך. תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, אספו את העוברים בשלב 2-PN יחד עם מסות התאי העזריים הסובבים אותם, באמצעות פיפטה מזכוכית סטרילית, והעבירו אותם לצלח פטרי חדש.לאחר מכן, יש להפריד את תאי הקומולוס על ידי ספיגת הרקמות ב-1 mL של תמיסת היאלורונידאז. כעת, דגרו את הצלחון בטמפרטורה של 37 °C למשך 5 עד 10 דקות. השלב הבא הוא עירום (denudation) של העוברים.בעזרת פיפטת זכוכית, זרימו את תמיסת האמבט בעדינות כדי לשחרר את תאי ה-cumulus מהעוברים שסביבם. לאחר מכן, שטפו את העוברים המנוקים עם 30 עד 50 milliliters של PBS טרי לכל עובר. בצעו שטיפה זו שלוש פעמים.כעת, העבירו את העוברים לצלחית פלסטיק של 35 מילימטר עם M16 פלוס BSA, ושמרו אותם באינקובטור לח עד ארבע שעות לפני המיקרו-הזרקה. לפני המיקרו-הזרקה, שטפו קצרה את עוברי ה-2-PN המקולפים ב-1 מיליליטר של M16 טרי. לאחר מכן, העבירו את העוברים בתוך התמיסה לנבובת צנטריפוגה, וסובבו אותם ב-1,000 Gs למשך 10 דקות.כעת, העבירו כל עובר לצ그러ת תרבית עם 20 עד 30 µL של מצע M16. פעולה זו תהפוך את הפרו-גרעינים (pronuclei) לנראים. כסו את המצע בשכבה דקה של שמן מינרלי, והדגירו את העוברים בטמפרטורה של 37 °C בריכוז של 5% carbon dioxide למשך שעה עד שעתיים.במקביל, בעזרת שובך מכני, הכין פיפטות הזרקה ופיפטות החזקה מצינורות נימיים של זכוכית בורוסיליקט. לאחר מכן, באמצעות מיקרו-גרינדר ומיקרו-פורג'ר, ייצר את פיפטות ההזרקה עם קצוות קהים, והלטש אותן עד לקבלת פתחים ברוחב 2 מיקרון. אורך הקצה צריך להיות פחות מ-500 מיקרון.באופן דומה, הכינו פיפטות אחזקה על ידי יצירת קצוות קהים והליטשת פתחיהן לקוטר פנימי של 20 microns, וקוטר חיצוני של 100 microns. כעת, טענו את פיפטות ההזרקה עם לפחות 200 nanoliters של תמיסת פלסמיד בריכוז של one microgram DNA ל-microliter. לאחר מכן, התקינו את פיפטת ההזרקה במיקרו-מניפולטור ממונע.לאחר מכן, הגדירו את המזרק להזרקת פולסים של כ-10 picoliters. עבור המיקרו-הזרקה, קבעו את העוברים באמצעות לחץ שלילי מפיפטת ההחזקה. לאחר מכן, הניעו ומקמו את קצה פיפטת ההזרקה בסמוך לממברנה של התא, ממש מעל לאחת הגרעינים הקדמיים (pronuclei).לאחר מכן, חרקו את ממברנת התא, דחפו את המחט הלאה אל תוך הפרו-גרעין (pronucleus), ובצעו הזרקה של 10 picoliter. לאחר ההזרקה המיקרוסקופית, אספו את העוברים המוזרקים ושטפו אותם שלוש פעמים במצע M16 טרי. כל שלב שטיפה יכול להימשך פחות מדקה.לאחר מכן, המשיכו בגידול העוברים על ידי כיסוי מצע M16 בטיפה של שמן מינרלי למניעת התאיידות, והנחת כל עובר על תבנית תרבית פלסטית על טיפה של מצע M16. מדי 24 שעות, בחנו את העוברים באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי עם אופטיקת DIC של 488 nanometer או 555 nanometer בהגדלה של 200x. Neogenin מובע באופן זמני במהלך שלבי הפיתוח המוקדמים של טרום השתבצות.הוא מופיע כבר בשלב ה-2-תאים, ונמשך עד לשלב המורולה המוקדם. ביטויו מוגבל מרחבית בעיקר לחלק החיצוני של התאים. רמות הביטוי של Neogenin שונו על ידי מיקרו-הזרקה של וקטורי cDNA של neogenin, או וקטורים הנושאים shRNA קצר נגד neogenin, לזיגוטות בשלב 2-PN.RFP ו-GFP בוטאו במשותף כמסמנים. רמת הביטוי של ה-neogenin שהתקבלה אוששה הן באמצעות אימונופלואורסצנציה והן באמצעות אימונובלוטינג. לא נצפו הבדלים מורפולוגיים גסים בעוברים שבהם חסר neogenin או בעוברים שבהם חלה עלייה ב-neogenin, וכן לא התפתחו באופן שונה עד לשלב הבלסטוציסט.עם זאת, התפתחות ה-ICM הייתה פחות בולטת בעובריים עם חסר ב-neogenin, כפי שנמדד על ידי תאי ICM חיוביים ל-Oct three ו-four. כמו כן, היו יותר תאי ICM חיוביים ל-Oct three ו-four לכל בלאסטוציסט בעובריים עם עודף ב-neogenin. תצפית זו אוששה בהמשך באמצעות אנליזת rtPCR.בעוברים עם ביטוי יתר של neogenin, הביטויים של Oct 3 ו-4, SOX2 ו-Nanog עלו באופן דרמטי, בניגוד לשינוי מזניח בביטוי של Cdx2 ו-Tead4. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים חלק זה של הפרוטוקול, הכולל מיקרו-הזרקה, בכשעה אחת. בעת ביצוע פרוטוקול זה, יש לזכור כי עוברי 2-PN מופשרים עברו אופטימיזציה לבידוד, מיקרו-הזרקה וטיפוח של עוברים כדי למזער את הנזק.כהשלמה לשיטה פרוצדורלית זו, ניתן לבצע ניסויים כגון מחקרי תרופות כדי לענות על שאלות רב-שניות בנוגע למסלול האיתות וכן הלאה.

loss-gain-function-approach-to-investigate-early-cell-fate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

גורלו של תא עוברי אדם יכול להיות מושפע על ידי מולקולות ירושה ו / או על ידי אותות מתאים שכנים. ניצול מפות גורלו של עובר Xenopus שלב המחשוף, לסטומרים בודדים ניתן לזהות לתרבות בבידוד כדי להעריך את התרומה של מולקולות ירושה לעומת אינטראקציות תא סלולרי.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

אנו מדגימים שיטה להשתלת תאים מתורבתים לאתרים מוגדרים של עוברי עכברים מוקדמים כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם in vivo. אנו מציגים גם שיטת אלקטרופורציה אופטימלית המשתמשת בנימי זכוכית בקוטר ידוע, המאפשרת העברה מדויקת של DNA אקסוגני לכמה תאים בעוברים.

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

פרוטוקולים ללמוד העורקים מאתר של הלידה באמצעות ויוו ניתוח המשובטים, מיפוי הגורל, אבי העורקים explants שריר חלק מבודד התאים מפורטים כאן. גישות מגוונות אלה לקדם את חקירת מורפוגנזה של אבי העורקים של הלידה בהתפתחות נורמלית, בפתוגנזה של המחלה.

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

אנו מתארים טכניקה לפרופיל microRNAs בעוברי עכבר מוקדם. פרוטוקול זה מתגבר על האתגר של קלט תאים נמוך והעשרת RNA קטנה. תוואי זה יכול לשמש כדי לנתח שינויים בביטוי miRNA לאורך זמן בנסיגות תאים שונים של עובר העכבר המוקדם.

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

מאמר זה נועד להדגים את השימוש בתאי גזע עובריים הפלואידיים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע לבניית עוברים משובטים למחצה.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

חקור שיטות אובדן ורווח פונקציה לזיהוי קולטן Neogenin המשפיע על התמיינות תאי עובר עכבר בטרם השרשה. שיטה זו מאפשרת הבנת החלטות גורל תאי מוקדמות בביולוגיה התפתחותית.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

גלה סרטונים נוספים