Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר
6 ביוני 2016
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש במניפולציות של אובדן ורווח תפקוד כדי לזהות מולקולות ספציפיות לשלב השולטות בהתמיינות מסת התא הפנימית של עוברי עכברים במהלך טרום ההשתלה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת המפתח לגבי שחרור גורל התא המוקדם בביולוגיה ההתפתחותית הבסיסית, כמו גם בביולוגיה של תאי גזע, מדעי בעלי חיים וביוטכנולוגיה של רבייה, כגון שיבוט בעלי חיים. המטרה העיקרית של טכניקה זו היא שהקולטן הספציפי לשלב, ויש ליגנדים של שימוש כדי לשפר את הביטוי של גורם ספציפי לתאי גזע עובריים בלבד במהלך התפתחות העובר.
פרוטוקול זה פותח בשיתוף פעולה עם מספר מעבדות. אז הדגמת התהליך תהיה שיתוף הפעולה שלי, פרופסור סאנג ג'ין לי, ותלמיד התואר השני שלו, יונג איל צ'ו. 18 עד 20 שעות לאחר הזריקה האחרונה, הקריבו את הנקבות ההרות על ידי הרעלת פחמן דו חמצני ואחריה פריקת צוואר הרחם.
לאחר מכן, פתח את הצד האחורי וחתוך את השכבה הפנימית במספריים עדינים. מצא והרם את קרני הרחם באמצעות מלקחיים עדינים, ומשוך אותן בעדינות החוצה מחלל הגוף, יחד עם הרחם, צינור הביצית, השחלה וכריות השומן. לאחר מכן, חותכים את האזור שבין צינור הביצית לשחלה בעזרת מספריים עדינים.
לאחר מכן, מקם מחדש את המלקחיים וחתוך את הרחם ליד צינור הביצית, והשאיר לפחות סנטימטר אחד מהחלק העליון של הרחם מחובר. כעת, העבירו את האמפולה הביצית לתוך טיפת המדיה M16 המכוסה בשמן מינרלי על צלחת פטרי 35 מילימטר בטמפרטורת החדר. אסוף את הביציות מכמה עכברים באותה צלחת.
לאחר הכנת מחט מזרק CC אחת, כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט, השתמש במלקחיים עדינים כדי להחזיק ולהיכנס לקצה צינור הביצית. לאחר מכן יש לנקב בעדינות ולסחוט החוצה את מסת הקומולוס בשלב ירידת המדיה. תחת סטריאומיקרוסקופ, שחזר את העוברים 2-PN יחד עם מסות הקומולוס שמסביב, באמצעות פיפטת זכוכית סטרילית, והעביר אותם לצלחת פטרי חדשה.
לאחר מכן, נתק את תאי הקומולוס על ידי רחיצת הרקמות במיליליטר אחד של תמיסת היאלורונידאז. כעת, דגרו את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. השלב הבא הוא לשלול את העוברים.
בעזרת פיפטת הזכוכית, הזרימו בעדינות את תמיסת האמבטיה כדי לשחרר את תאי הקומולוס מהעוברים שמסביב. לאחר מכן, שטפו את העוברים המופשטים עם 30 עד 50 מיליליטר PBS טרי לעובר. בצע שטיפה זו שלוש פעמים.
כעת, העבירו את העוברים לצלחת פלסטיק בגודל 35 מילימטר עם M16 בתוספת BSA, ושמרו אותם באינקובטור לח עד ארבע שעות לפני ההזרקה. לפני המיקרו-הזרקה יש לשטוף בקצרה את עוברי ה-2-PN המרוקנים עם מיליליטר אחד של M16 טרי. לאחר מכן, העבירו את העוברים בתמיסה לצינור צנטריפוגה, וסובבו אותם בטמפרטורה של 1,000 גרם למשך 10 דקות.
כעת, העבירו כל עובר לצלחת תרבית עם 20 עד 30 מיקרוליטר של מדיה M16. זה יהפוך את הפרו-גרעינים לגלויים. מכסים את המדיה בשכבה דקה של שמן מינרלי, ודוגרים על העוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך שעה עד שעתיים.
בינתיים, בעזרת מושך מכני, הכינו את פיפטות ההזרקה והחזקת פיפטות מצינורות נימי זכוכית בורוסיליקה. לאחר מכן, בעזרת מטחנת מיקרו ומיקרו-פורגר, מייצרים את פיפטות ההזרקה עם קצות קהים, ומלטשים אותן לשני פתחים ברוחב מיקרון. אורך הקצה צריך להיות פחות מ -500 מיקרון.
באופן דומה, לייצר פיפטות אחיזה על ידי יצירת קצוות קהים וליטוש פתחיהם לקוטר פנימי של 20 מיקרון, וקוטר חיצוני של 100 מיקרון. כעת, טען את פיפטות ההזרקה עם לפחות 200 ננוליטר של תמיסת פלסמיד בריכוז של מיקרוגרם DNA אחד למיקרוליטר. לאחר מכן, הרכיב את פיפטת ההזרקה במיקרומניפולטור ממונע.
לאחר מכן, הגדר את המזרק לדופק bul-ih-ses של כ-10 פיקוליטר. עבור המיקרו-הזרקה, אבטח את העוברים באמצעות לחץ שלילי מהפיפטה המחזיקה. לאחר מכן, התקדמו והניחו את קצה פיפטת ההזרקה בסמוך לקרום התא ממש מעל אחד הפרו-גרעינים.
לאחר מכן, חנית את קרום התא, דחף הלאה לתוך הפרונוקלאוס ובצע את הזרקת 10 פיקוליטר. לאחר המיקרו-הזרקה, אספו את העוברים שהוזרקו ושטפו אותם שלוש פעמים במדיה M16 טרייה. כל שטיפה יכולה להימשך פחות מדקה.
לאחר מכן, המשיכו בתרבית העוברים על ידי כיסוי מדיה M16 בטיפת שמן מינרלי כדי למנוע את התאדותו, והנחת כל עובר על צלחת תרבית פלסטית על טיפה של מדיה M16. כל 24 שעות, התבונן בעוברים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי עם אופטיקה DIC של 488 ננומטר או 555 ננומטר בהגדלה של פי 200. ניאוגנין מתבטא באופן זמני בשלבי ההתפתחות המוקדמים של טרום ההשתלה.
הוא מופיע כבר בשלב 2 התאים, ונמשך עד לשלב המורולה המוקדם. הביטוי שלו מוגבל בעיקר מרחבית לחלק החיצוני של התאים. רמות הביטוי של ניאוגנין עברו מניפולציה על ידי מיקרו-הזרקת זיגוטות 2-PN עם וקטורי cDNA של ניאוגנין, או וקטורים המכילים RNA סיכת ראש קצרה כנגד ניאוגנין.
RFP ו-GFP באו לידי ביטוי כאינדיקטורים. רמת ביטוי הניאוגנין שהתקבלה אושרה הן על ידי אימונופלואורסצנציה והן על ידי אימונובלוטינג. לא היו הבדלים מורפולוגיים גסים באובדן הניאוגנין או בעוברי הרווח של הניאוגנין, והם גם לא התפתחו באופן שונה עד לשלב הבלסטוציסט.
עם זאת, התפתחות ICM הייתה פחות בולטת בעוברים עם אובדן ניאוגנין, כפי שנמדד על ידי שלושה וארבעה תאי ICM חיוביים. כמו כן, היו יותר תאי ICM חיוביים לשלושה וארבעה באוקטובר לכל בלסטוציסט בעוברים של רווח ניאוגנין. תצפית זו אושרה עוד יותר על ידי ניתוח rtPCR.
בעוברי רווח ניאוגנין, הביטויים של אוקטובר 3 ו-4, SOX2 ו-Nanog גדלו באופן דרמטי, בניגוד לשינוי ביטוי זניח ב-Cdx2 ו-Tead4. לאחר השליטה, ניתן להשלים את חלק המיקרו-הזרקה הזה של פרוטוקול זה תוך כשעה. בזמן ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי עובר 2-PN הם מקפיאים מיקרו-הזרקת בידוד אופטימלית הם תרבית של עובר כדי למזער את הנזק.
ניתן לבצע השלמה לשיטה פרוצדורלית זו, כגון מחקרי תרופות, כדי לענות על שאלות עתיקות יומין לגבי מסלול האיתות וכן הלאה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה של הפסד ותוספת תפקוד (loss- and gain-of-function) לזיהוי neogenin כקולטן ספציפי לשלב המשפיע על התמיינות ה-trophectoderm וה-inner cell mass בעוברים של עכברים בשלב טרום-השתבצות. הטכניקה נועדה להשיר את קבלת ההחלטות המוקדמת בנוגע לגורל התאים בביולוגיה של התפתחות ותאי גזע.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של תאי גזע
- ביוטכנולוגיה של רבייה
רקע
- הבנת ההחלטות המוקדמות לגבי גורל התא היא קריטית בביולוגיה התפתחותית.
- Neogenin מוצע כקולטן מפתח בדיפרנציאציה שלו של העובר.
- למחקר זה יש השלכות על שיבוט בעלי חיים וטכנולוגיות רבייה.
- הפרוטוקול פותח בשיתוף פעולה עם מעבדות מרובות.
מטרת המחקר
- לזיהוי מולקולות ספציפיות לשלב השולטות בהבדלה של מסת התאים הפנימית.
- להגברת הביטוי של גורמים הספציפיים לתאי גזע עובריים במהלך ההתפתחות.
- לתרומה להבנת ההתפתחות העוברית המוקדמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מניפולציות של אובדן ותפקוד מוגבר (Loss- and gain-of-function).
- הזרקת ליגנדים ספציפיים להגברת ביטוי הקולטן.
- שיתוף פעולה עם מומחים בתחום לפיתוח הפרוטוקול.
- שימוש בהרעלת פחמן דו-חמצני להריגה הומנית של הנבדקים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי neogenin כקולטן משמעותי בדיפרנציאציה של עובריו.
- הדגמת יעילותה של השיטה במניפולציה של גורל התא.
- תובנות לגבי תפקידם של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.
- השיתוף גרר פרוטוקול חסון למחקרים עתידיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי בעל ערך לחקר דיפרנציאציה עוברית מוקדמת.
- ממצאים עשויים לשפר את ההבנה של ביולוגיה של תאי גזע וטכנולוגיות רבייה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטות אלו כדי לבחון רצפטורים וגורמים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מניפולציה ישירה של אובדן תפקוד (loss-of-function) והעשרת תפקוד (gain-of-function) בעוברים של עכברים לפני השתבצות מאפשרת בחינה מדויקת של גורמים קובעי גורל תאי מוקדם, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בביולוגיה של תאי גזע והתפתחות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזיוי בתיקוף יעדים עבור גנים המעורבים בקביעת שושלת תאית (lineage specification), ומספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכונים בממשק שבין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים. השחזוריות של הפרוטוקול ותוצאותיו הכמותיות ממצבים אותו כיכולת ניתנת לשימוש חוזר להערכה של ווסתי התפתחות ספציפיים לשלב ברחבי פורטפוליו מחקרי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של גנים מועמדים המעורבים בהחלטת שורש (lineage commitment) עוברית מוקדמת.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד ההשפעה של הפרעות גנטיות ספציפיות על תוצאות גורל התא.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מטרות עבור תוכניות של רפואה התפתחותית ורפואה רגנרטיבית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מבסס מערכות עובריות מתוקפות לסריקה המשכית של תפקוד גנים וסיגנל של מסלולים ביולוגיים.
- מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור באמצעות אימונופלואורסצנציה ובדיקות מולקולריות.
- מכין פלטפורמות חסונות להערכת גנים או מודולטורים נוספים הספציפיים לשלב התפתחותי מוקדם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים הרלוונטיים למחלות לצורך הבנת הפרעות התפתחותיות ודיפרנציאציה של תאי גזע.
- מספק רצף משלב חקירת תפקוד גנים בשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של יעדים התפתחותיים.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים של גנים מועמדים עם תפקידים מוכחים בקביעת השושלת התאית (lineage specification).
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול זה משלב בין שלב הגילוי המוקדם למחקר פרה-קליני, ותומך בתיקוף מטרות מונחה-היפותזה ובמחקרים מכניסטיים בהתפתחות עוברית.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייע בבדיקת השערת האפס עבור תפקוד גנים בקביעת גורל התא.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וסטנדרטיים לצורך ניתוח השוואתי של הפרעות גנטיות.
- אנליטיקה: מאפשרת ביצוע אימונופלואורסצנציה, אימונובלוטינג וכבישור כמותי של סמני שושלת באמצעות RT-PCR.
- מחקר תרגומי: מגשר בין תובנות מכניסטיות מוקדמות למודלים פרה-קליניים של בקרה התפתחותית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה הניתנת להרחבה ולשחזור לצורך הערכת גנים מועמדים מרובים על פני תוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות בתיקוף מטרות עבור רגולטורים התפתחותיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה להפרעת גנים וכמותיות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ותיעדוף של מטרות בעלות תפקידים מכניסטיים מתוקפים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכון ובמיון של גנים מועמדים בקווי פיתוח מוקדמים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-הזרקה לעוברים ובבדיקות מולקולריות כמותיות.
- נדרשת גישה למכשור ייעודי, כולל מיקרו-מניפולטורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- נדרש תיקנון חוצב-צוותים של פרוטוקולי ההזרקה, הטיפוח והניתוח.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור אורגניזמי מודל שונים או שלבי התפתחות שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות דרישות למיומנות טכנית ואת חיוניות העוברים לאחר המניפולציה.
