כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

המטרה הכוללת של כימות נקודות אקטין פילמנטוסי (Filamentous Actin Punta) בנוירונים בתרבית, היא להציג שיטה שימושית לבחינת השלמות וה인지טיביות של מבנים סינפטיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח בנוגע לספינוגנזה (spinogenisis), פלסטיות סינפטית ויציבות סינפטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת פרוטוקול מפורט לתרבית נוירונים ראשונית, בעקבות זיהוי וכימות של נקודות F-actin.

כאשר יעד ההישג אינו ידוע, יש להעריך את השלמות הכללית של מבני ratia fundantric. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה בעת שחקרנו נזק נוירונלי המושרה על ידי סמימי התמכרות כמו קוקאין, וחלבונים רעילים של HIV כגון tat ו-JP 120. יומיים לפני הקמת התרבית, יש לצפות 12 צלחות עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר, בשני מיליליטר של תמיסת עבודה של Poly-L lysine. את הצלחות יש לשמור במנדף למשך הלילה כדי לשמור על סטריליותן.

למחרת, יש להסיר את חומר הציפוי ולשטוף את הצלחות במים מזוקקים פעמיים. יש להניח לצלחות להתייבש במשך שעה אחת תחת המנדף. לאחר מכן, העבירו 2 mL של מדיום זריעה לכל צלחת.

יש להדגיר את הצלחות הגידול למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. ביום תרבית התאים, יש להניח את המוח שנאסף בצלחת פטרי המכילה HBSS קר. לאחר מכן, תוך כדי קיבוע המוח באמצעות פינצטה, יש להשתמש בפינצטה מעוקלת כדי להפריד בין ההמיספרים ולהסיר את קרומי המוח (meninges).

בודד את קליפת המוח הפרונטלית (frontal cortices), והעבר את החלקים לשפופרת צנטריפוגה סטרילית של 15 milliliter. הוסף לשפופרת שני milliliters של HBSS טרי ו-20 microliters של trypsin EDTA, והדגר את רקמות העצב למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב עדין (swirling) מדי כמה דקות.

בסיום הדגירה, השתמש בפ pipette זכוכית כדי לשאוב את כל ה-HBSS הישן. שטוף את הקורטקס פעמיים ב-HBSS טרי. לאחר השטיפה השנייה, טבול את הרקמה במעכב טריפסין.

ערבבו היטב, והניחו לדגימה למנוחה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הרקמות פעמיים ב-HBSS טרי. כעת, השתמשו בפיפטת זכוכית עם נורית גומי כדי לבצע טריטורציה (trituration) איטית מאוד של חתיכות המוח, 10 עד 15 פעמים.

לאחר מכן, באמצעות פיפט מכויל המצויד בטיפ סטרילי בעל קוטר מצומצם, בצעו שוב טריטורציה (trituration) איטית מאוד של תסמיך הרקמה. כאשר התמיסה תהיה הומוגנית, זרעו את התאים בצפיפות המתאימה בצלחות תרבית מצופות מראש לדגירה לילה במדגרה לתרביות תאים. לאחר 24 שעות, החליפו את מצע הזריעה במצע בסיסי צר (narrow basal medium) נטול סרום להגדילה, שהוכן טרי.

החזירו את התאים לדגירה באינקובטור לתרביות תאים למשך 12 עד 14 ימים לפחות. זריעה בצפיפות נמוכה היא חשובה לצורך ויזואליזציה של נוירונים בודדים. כמו כן, שימוש במצע בסיסי לנוירונים הוא קריטי לצמצום הפרספורציה של אסטרוציטים בתוך תרביות התאים.

כדי לסמן את התאים עבור אימונוציטוכימיה, שטפו תחילה את צלחת תרבית התאים בעלת התחתית הזכוכית פעמיים עם PBS. לאחר מכן, קבעו את התאים עם פאראפורמאלדהיד בריכוז 4% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן בצעו שתי שטיפות PBS.

בשלב הבא, בצעו חדירה לממברנת התאים (permeabilization) באמצעות 0.1% Triton X 100 ב-PBS למשך חמש דקות, וסמנו אותם בצבע ספציפי ל-F-actin בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS וחסמו כל צביעה לא ספציפית של פני השטח של התאים באמצעות 10% normal goat serum. בתום הדגירה, סמנו את התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 degrees celcius באמצעות chicken polyclonal anti-map two antibody.

למחרת בבוקר, שטפו את התאים פעמיים עם PBS וסמנו אותם עם נוגדן שני מתאים. לאחר שעתיים בטמפרטורת החדר, שטפו את התאים שוב עם PBS, וסמנו אותם עם 10 microliters של huxs למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים אחרונות עם PBS ושמרו אותם עם 100 microliters של anti-fade re-agent.

בתוך שלושה ימים מהצביעה הזו, הפעילו את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ובחרו בעדשה אובייקטיבית של 20 X. לאחר מכן, בתוכנת המיקרוסקופ, הגדירו את גודל תמונת הפיקסלים ל-1600 על 1200 ואת רזולוציית התמונה של 0.17 micron per pixel ל-1 X zoom. העבירו את צלחת התאים אלבמת המיקרוסקופ.

רכשו תמונות של נוירונים של map 2 המסומנים בסימון כפול ל-F-actin תחת הערוצים הפלואורסצנטיים הירוק והאדום. כאשר כל התמונות התקבלו, בחרו חמש תמונות של נוירונים בודדים בערוצים הירוק, האדום והכחול עם עצי דנדריטים מוגדרים בבירור. השתמשו באימונופלואורסצנציה רציפה של map 2 כדי לזהות את המבנים העשירים ב-F-actin במקטעים הדנדריטיים מסדר שני.

סובב את האזור הנבחר בתמונות באופן אופקי. העתק והדבק את האזור כתמונה חדשה. לאחר מכן, החסר את הפלואורסצנציית הרקע של התמונה והשתמש בתוכנה כדי לספור את מספר נקודות ה-F-actin הירוקות והבהירות.

השתמשו בבודקים בלתי תלויים שעברו הכשרה כדי למדוד את אורכם של מקטעי הדנדריטים שנבחרו. לאחר מכן, ייצאו את מספר ה-puncta ואת נתוני אורך מקטעי הדנדריטים לקובץ גיליון אלקטרוני. ודאו כי הבודקים כוללים puncta של F-actin בעצימות פלואורסצנציה ורודה הגבוהה ב-50% לפחות מהעצימות הממוצעת של הצביעה בגזע הדנדריטי בכל מקטע שנבחר.

לבסוף, חשבו את הצפיפות לפי הנוסחה, והציגו את הנתונים כמספר נקודות (puncta) של F-actin לכל עשרה מיקרונים של דנדריט. כאן, תמונות של מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) מדגימות את השינויים המורפולוגיים שנצפו בנוירונים קורטיקליים של עוברי חולדה בשלבי התפתחותם ביום 4 עד 27 in vitro. שימו לב לעלייה באורך ובמספר הדנדריטים ככל שהנוירונים הראשוניים של החולדה בתרבית מבשילים.

מכיוון שסימון של F-actin באמצעות פאלוידין (phalloidin) הוא מהיר מאוד, ניתן להעריך באופן חזותי את תקינות הרשת הסינפטו-דנדריטית לפני השלב של סימון בנוגדנים אימונוציטוכימיים. Map2 צובע דנדריטים שלמים, ובכך מאשר שהנקודות (puncta) של F-actin ממוקמות על הדנדריטים העצביים, ולא ממוקמות בתאים אחרים, כגון אסטרוציטים. בתמונות ברזולוציה גבוהה, ניתן להבחין במבנים עשירים ב-F-actin הכוללים פילופודיה (filopodia), בליטות של קוצים (spine protrusions) וכתמי F-actin.

בניסוי זה להערכת פגיעה סינפטו-דנדריטית המושרית על ידי HIV 1 tat, צביעת Map2 חשפה פחות ענפים דנדריטיים ומיעוט של F-actin בנוירונים קורטיקליים של חולדה בעקבות הטיפול ב-HIV 1 tat. ואכן, מספר נקודות ה-F-actin עולה או יורד בתגובה לטיפול הניסויי. לדוגמה, בניסוי זה, כאשר הנוירונים בתרבית טופלו ב-memantine, אנטגוניסט לא תחרותי של קולטן NMDA, חלה עלייה משמעותית בצפיפות של נקודות חיוביות ל-F-actin.

בניגוד לכך, טיפול בשילוב של מתאמפטמין ו-HIV1 tat גרם לאובדן משמעותי של נקודות ה-F-actin. לאחר השגת תמונות ברזולוציה גבוהה של נוירוני Map2 עם F-actin מסומן ב-coal, יש להנחות שני משקיפים מיומנים לבחור מקטעים של דנדריטים מסדר שני לצורך ניתוח צפיפות הנקודות. לאחר פיתחו, סלל טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקרי מדעי המוח.

לא רק לצורך ניטור סינפטופתיה חריפה, אלא גם למחקר של התאוששות סינפטית ותהליכי שיקום עצבי ניסוייים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי הדרך לפיתוח שיטה מהימנה למדידת השלמות הסינפטית של הרשת הדנדריטית העצבית.