כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

המטרה הכוללת של כימות זה של Actin Punta חוטי בנוירונים מתורבתים, היא להציג שיטה שימושית לחקר השלמות והקוגניטיביות של מבנים סינפטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח לגבי ספינוגנזיס, פלסטיות סינפטית ויציבות סינפטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת פרוטוקול מפורט לתרבית עצבית ראשונית, לאחר זיהוי וכימות של F-actin puncta.

כאשר יעד ההישג אינו ידוע, יש צורך להעריך את השלמות הכללית של מבני היסוד של רטיה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר חקרנו את הנזק לתאי העצב שנגרם על ידי סמים כמו קוקאין, וחלבונים רעילים ל-HIV כמו tat ו-JP 120 יומיים לפני הקמת שכבת התרבית 12, 35 מילימטר תחתית זכוכית, עם שני מיליליטר של תמיסת פולי-L ליזין. ואחסן את הכלים במכסה המנוע למשך הלילה כדי לשמור על סטריליותם.

למחרת, השליכו את חומר הציפוי ושטפו את הכלים במים מזוקקים כפולים. הניחו לכלים להתייבש במשך שעה מתחת למכסה המנוע. לאחר מכן העבירו שני מיליליטר מדיום ציפוי לכל מנה.

ודגרו את המנות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. יום אחד של התרבות, הניחו את המוח שנקצר בצלחת פטרי המכילה HBSS קר. לאחר מכן, אבטחו את המוח בפינצטה, השתמשו במלקחיים המעוקלים כדי להפריד בין ההמיספרות ולהסיר את קרומי המוח.

בודדו את קליפות המוח הקדמיות, והעבירו את החלקים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר. הוסיפו שני מיליליטר של HBSS טרי ו-20 מיקרוליטר של טריפסין EDTA לשפופרת, ודגרו על הרקמות העצביות למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. עם מערבולת עדינה כל כמה דקות.

בסוף הדגירה, השתמש בפיפטת זכוכית כדי לשאוב את כל ה-HBSS הישן. ושוטפים את קליפת המוח פעמיים עם HBSS טרי. לאחר הכביסה השנייה, טבלו את הרקמה במעכב טריפסין.

מערבבים היטב, ונותנים לדגימה לשבת חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את הטישו פעמיים עם HBSS טרי. כעת השתמשו בפיפטה מזכוכית עם נורת גומי כדי לשבש לאט מאוד את חלקי המוח 10 עד 15 פעמים.

לאחר מכן, בעזרת פיפטה מכוילת המצוידת בקצה סטרילי בקוטר מופחת, יש לשלול לאט לאט את תמיסת הרקמות שוב. כאשר התמיסה הומוגנית, צלחו את התאים בצפיפות המתאימה בכלי התרבית המצופים מראש לדגירה של לילה בחממת תרבית התאים. לאחר 24 שעות, החלף את מדיום הציפוי במדיום בסיסי צר ללא סרום גידול טרי.

ולהחזיר את התאים לחממת תרבית התאים למשך 12 עד 14 יום לפחות. ציפוי בצפיפות נמוכה חשוב להמחשת הנוירונים הבודדים. והמדיום הבסיסי של הנוירון הוא קריטי במזעור הנקב של אסטרוסיז בתוך תרביות התאים.

כדי לתייג את התאים לאימונוציטוכימיה, יש לשטוף תחילה את צלחת תרבית התאים התחתונה מזכוכית פעמיים עם PBS. לאחר מכן תקן את התאים עם ארבעה אחוז פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואחריו שתי שטיפות PBS.

לאחר מכן, חלחלו לתאים עם 0.1 אחוז טריטון X 100 ב-PBS למשך חמש דקות, ותייגו אותם עם כתם ספציפי ל-F-actin בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות, שטפו את התאים פעמיים עם PBS וחסמו כל צביעה לא ספציפית על פני התא עם סרום עזים רגיל של 10%. בתום הדגירה, סמנו את תאי הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן רב-שבטי נגד מפה 2 של עוף.

למחרת בבוקר, שטפו את התאים פעמיים עם PBS וסמנו אותם בנוגדנים משניים מתאימים. לאחר שעתיים בטמפרטורת החדר, שטפו שוב את התאים עם PBS, וסמנו אותם ב-10 מיקרוליטר של האקס למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים אחרונות עם PBS ושמרו אותם עם 100 מיקרוליטר של חומר חוזר נגד דהייה.

תוך שלושה ימים מהצביעה הזו, הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ובחר את המטרה 20X. לאחר מכן, בתוכנת המיקרוסקופ, הגדר את גודל תמונת הפיקסלים ל-1600 על 1200 ואת רזולוציית התמונה של 0.17 מיקרון לפיקסל ל-1 X זום. העבירו את צלחת התאים לשלב המיקרוסקופ.

ולרכוש תמונות של תאי העצב F-actin המסומנים במשותף במפת 2 מתחת לתעלות הפלואורסצנטיות הירוקות והאדומות. לאחר שכל התמונות התקבלו בחר חמש תמונות של נוירונים בודדים בערוצים הירוקים, האדומים והכחולים עם סוכות דנדריטיות מוגדרות בבירור. והשתמש במפה רציפה של אימונופלואורסצנציה שנייה כדי לזהות את המבנים העשירים ב-F-actin במקטעים הדנדריטיים המסודרים השני.

סובבו את האזור שנבחר בתמונות בצורה אופקית. והעתק והדבק את האזור כתמונה חדשה. לאחר מכן הפחיתו את הקרינה של רקע התמונה והשתמשו בתוכנה כדי לספור את מספר פונקטות ה-F-actin הירוקות הבוהקות.

השתמש בצופים עצמאיים מאומנים כדי למדוד את אורך המקטעים הדנדריטיים שנבחרו. ולאחר מכן ייצא את מספרי הפונקטה, ונתוני אורך המקטע הדנדריטי לקובץ גיליון אלקטרוני. ודא שהמשקיפים כוללים פונקטה של יציבת F-actin עם עוצמת פלואורסצנטיות ורודה של לפחות 50% מעל עוצמת הצביעה הממוצעת בפיר הדנדריטי בכל קטע שנבחר.

לבסוף, חשב את הצפיפות על פי הנוסחה, המבטאת את הנתונים כמספר הפונקטה של F-actin לכל עשרה מיקרון של דנדריט. כאן, תמונות ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות מדגימות את השינויים המורפולוגיים שנצפו בהתפתחות נוירונים בקליפת המוח של חולדה עוברית בימים 4 עד 27 במבחנה. שימו לב לעלייה באורך ובמספר הדנדריטים ככל שתאי העצב הראשוניים של החולדה המתורבתת מתבגרים.

מכיוון שתיוג הפלואידין של F-actin הוא מהיר מאוד, ניתן להעריך חזותית את שלמות הרשת הסינפטו-דנדריטית לפני שתמשיך בתיוג הנוגדנים האימונוציטוכימיים. Map2 מכתים את הדנדריטים השלמים, ומאשר שהפונקטה F-actin ממוקמת על הדנדריטים העצביים, ואינה ממוקמת בתאים אחרים, כגון אסטרוציטים. בתמונות ברזולוציה גבוהה ניתן להבחין במבנים עשירים ב-F-actin המכילים פי פילופודיה, בליטות עמוד שדרה וכתמי F-actin.

בניסוי זה להערכת HIV 1 tat גורם לפגיעה סינפטו-דנדריטית, צביעת Map2 חשפה פחות ענפים דנדריטיים ו-F-actin מופחת בתאי עצב בקליפת המוח של חולדות לאחר הטיפול ב-HIV 1 tat. ואכן, F-actin puncta עולה או יורדת בתגובה לטיפול הניסיוני. לדוגמה, בניסוי זה כאשר הנוירונים המתורבתים טופלו בממנטין אנטגוניסט לקולטן NMDA לא תחרותי, הפונקטה החיובית של F-actin חוותה עלייה משמעותית בצפיפות.

לעומת זאת, טיפול בשילוב של מתאמפטמין בתוספת HIV1 tat הביא לאובדן משמעותי של F-actin puncta. לאחר רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה של נוירוני הפחם המסומנים F-actin Map2, זכור ששני צופים מיומנים יבחרו מקטעים של הדנדריטים המסודר השני לניתוח צפיפות הפונקטה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחקר במדעי המוח.

לא רק לניטור סינפטופתיה חריפה, אלא גם לחקר התאוששות סינפטית ותהליכי שיקום עצבים ניסיוניים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח שיטה אמינה המודדת את השלמות הסינפטית של הרשת הדנדריטית העצבית.