בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin
8 בינואר 2016
כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.
המטרה הכוללת של הדמיה ביולומינסנט היא לדמות סידן חולף תפקודי in vivo, פרוקסי לפעילות, לתקופות ארוכות יותר ובמבנים עמוקים במוח. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כמו למשל כיצד נראית הפעילות הבסיסית של מוח הזבוב במהלך השינה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת עירור באמצעות הלייזר שלך.
זה מאפשר לדמות סידן חולף עמוק יותר לתוך הרקמה, ולפרק זמן ארוך יותר ללא ההלבנה והרעילות, לעומת הדמיית סידן קלאסית. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפעילות המוחית הבסיסית בדרוזופילה, וניתן להשתמש בה גם עם אורגניזמים מודלים אחרים, כמו למשל העכבר. כדי להתחיל, הכינו את קו העניין של drosophila melanogaster, ואת הפתרונות הניסיוניים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
לאחר מכן, הרדימו קרח דרוזופילה בודדת על ידי העברתה לבקבוקון זכוכית על קרח למשך שתי דקות. לאחר מכן, העבירו את הזבוב לצלחת פטרי צוננת, והשתמשו בזוג מלקחיים כדי להניח בעדינות את הזבוב בתוך קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר, גזוז כך שהקצה יהיה בזווית של כ-35 מעלות. בעזרת מברשת, דחפו בעדינות ויישרו כל זבוב כך שהראש יהיה לגמרי מעבר לקצה הקצה, ואזור הגב חשוף חלקית.
לאחר מכן, מרחו דבק דנטלי מוכן מהראש לקצה קצה הפיפטה. היזהר במיוחד כדי להימנע מכתר הראש. הדבקת הראש היא קריטית מכיוון שאבטחתו במצב הנכון חיונית לדיסקציה והדמיה מוצלחת.
בנוסף, הדבקה לקויה תוביל לדליפה של תמיסת הצלצול ולמוות של הדגימה לפני ההדמיה. לאחר מכן, הנח את קצה הפיפטה, עם הזבוב המצורף, דרך החור בתא ההקלטה, ולחץ בעדינות כדי להדק אותו למקומו. לאחר מכן השתמש בדבק סיליקון מוכן כדי לאבטח את הצד השטוח של החדר שבו הוא פוגש את קצה הפיפטה על מנת למנוע דליפות.
הדביקו חתיכת ברז מעל תעלת השפע, הקצה הקצר והמשיכו לחלק האחורי של החדר. לאחר מכן, הניחו את החדר עם הזבוב מתחת למיקרוסקופ והדליקו את מנורת הפלורסנט. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת צלצול לתוך החדר.
בעזרת סכין כירורגית עדינה, בצע חתכים מקבילים מהחלק האחורי של ראש הזבוב לאזור האנטנלי משני הצדדים. לאחר מכן, חותכים לאורך קצה העין, ומבצעים חתך מאונך מעל האנטנה המחברת את החתכים הקודמים. בצע חתך אחרון בחלק האחורי של הראש, ולאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים עדינים וחדים כדי להסיר את הציפורן.
אחוז בעדינות ונקה כל רקמת נשימה חשופה עד שהמוח וגוף הפטרייה הפלואורסצנטי נראים בבירור. לאחר מכן, השתמש במלקחיים חדים במיוחד כדי לתפוס בזהירות ולצבוט את רקמת האפיתל העצבי המכסה את המוח כדי להסיר אותה ולאפשר חדירה של הקולנטרזין. בעזרת פיפטה, שטפו את הרקמה פעמיים עם מיליליטר אחד של תמיסת צלצול כדי להסיר את כל הפסולת שנותרה מהדיסקציה, ולאחר מכן הניחו את הדגימה בקופסה חשוכה.
לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת רינגר, המכילה חמישה מיקרו-מולרי בנזיל-קולנטרזין לתוך החדר. סגור את הקופסה ודגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות. התחל בהפעלת המיקרוסקופ במחשב.
כמו כן, יש לקרר את המצלמה לשלילי 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הגדר את מערכת הניקוז והתאם את הבקרות הסביבתיות ל -20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פתח את מצלמת הפוטון, צור תיקיה חדשה ותן שם להקלטה הראשונה.
לאחר מכן, הגדר את מערכת השפע על ידי הוספת תמיסת האשלגן-כלוריד, הניקוטין והרינגר למאגרים שלהם. כוונן את הזרימה כך שכל תמיסה תתפרק בשני מיליליטר לדקה. לאחר מכן, הנח את הדגימה על התושבת מתחת למיקרוסקופ, והתאם את ההגדלה ל-5X.
לאחר מכן, הכנס את צינור השפע לתעלה דרך הפנצ'ר. כוונו את המיקרוסקופ למצב פלואורסצנטי, ואז מרכזו והביאו את גופי הפטריות למיקוד. ברגע שגופי הפטריות נמצאים בפוקוס, שנה את ההגדלה ל-20X.
מרכז מחדש את התמונה והתאם את המיקוד. לאחר מכן, מקם את מנגנון הניקוז מעל בריכת הניקוז והתאם את גובה שאנט הניקוז, כך שהקצה יהיה ממש מעל בריכת הניקוז. לאחר מכן, שטפו את הדגימה בתמיסת צלצול למשך 30 שניות כדי לבדוק ניקוז מתאים.
לבסוף, משוך את המגן כלפי מטה כדי לאטום את המכשיר מכל אור חיצוני. באמצעות המערכת האוטומטית בתוכנית הדמיית הפוטונים, בצע התאמות עדינות למיקוד, וצלם תמונת פלואורסצנט ייחוס של גופי הפטריות. התאם את מהירות הפוטון למהירות ההקלטה הרצויה, שאמורה להיות בכל מקום מתמונה אחת כל 50 אלפיות השנייה ועד תמונה אחת בכל שנייה, או יותר.
לאחר מכן, בחר במצב פוטון ופתח את הצמצם. לאחר מכן, הזן את הגנוטיפ, המין, הגיל ומספר המדגם ברשומות היומן. התאם את המיקום של תיבות אזור העניין מעל הגביע, גופי התאים והאונות האמצעיות, על ידי לחיצה על התיבות וגרירתן למקומן תוך החזקת שליטה.
כעת, רשום ערכי תוכנית בסיסית למשך כחמש עד 10 דקות. לאחר מכן, הפעל את המתג כדי להתחיל בזרימת הניקוטין. במקביל, לחץ על Enter והוסף הערה כדי לציין שזרימת הניקוטין החלה.
לאחר דקה אחת, עצרו את הזרימה, ורשמו הערה נוספת ביומן המציינת שהזרימה נעצרה. לאחר מכן, שטפו את הדגימה בתמיסת רינגר למשך חמש דקות. בזמן שהדגימה מתאוששת, כבה את הכביסה, הגדר את הטיימר לחמש דקות נוספות והתכונן להתחיל בזרימת האשלגן-כלורי.
כאשר אתה מוכן להתחיל, התחל את זרימת האשלגן-כלוריד, והזן התחלת אשלגן-כלוריד של 100 מילי-מולרית ליומן הדגימה. לאחר דקה אחת, עצור את הזרימה והזן כיבוי אשלגן-כלורי "ליומן הדגימה. לאחר מכן, שטפו את הדגימה בתמיסת צלצול למשך דקה אחת והעבירו את המיקרוסקופ למצב פלורסנט.
צלם תמונה פלואורסצנטית סופית ולאחר מכן כבה את תמיסת הצלצול והסר את הדגימה. בתוכנית הניתוח, פתח את הקובץ הראשון, בחר בכרטיסייה בקרת תצוגה ולחץ על ROI. לאחר מכן, החזק את השליטה ובחר אזור עניין.
לאחר מכן, התאם את הגודל, הכיוון והצורה של החזר ה-ROI כך שיקיף את הגביע המואר GFP וגופי התאים, ואת האונות המדיאליות. לאחר הוספת כל אזורי העניין, בחר בכרטיסייה סרט כדי להפעיל את סרטון הפוטון. התאם את הרוחב השני ואת השלבים השניים כרצונך.
לאחר מכן התאם מחדש את מיקום ההחזר על ההשקעה לפי הצורך, כך שהוא יישאר בתוך האזורים הפעילים בסרטון. בחר כמה צילומי מסך מייצגים של הקרינה של GFP, תגובת הניקוטין ותגובת האשלגן-כלוריד. לאחר מכן חתוך את צילומי המסך והדבק את התמונות המייצגות בשקופית מצגת לניתוח והשוואה מאוחרים.
התאם גם את הרוחב השני וגם את השלב השני למהירות ההקלטה תוך שניות. כמו כן, בחר את אורך הניתוח על ידי הזזת הסמנים האפורים בפאנל העליון לאזור הסוגריים, לפני התחלת הגירוי ומיד לאחר סיום התגובה. לאחר מכן, בחר השהה תצוגות"בזמן המשחק, ולאחר מכן לחץ על כפתור ההרצה לאחור כדי לאפס את הפעלת הווידאו להתחלה, ואחריו כפתור ההפעלה.
לאחר מכן, בחר את תרשים קצב ספירת הכרטיסיות"על מנת להתאים את היחידות וגם להתאים את צבע אזורי העניין, כמו גם את צבעי הקווים כרצונך. בסיום הניתוח, בחר נתוני קצב ספירת ייצוא. לאחר מכן, בחר את ההקלטות המשולבות של הגביע וגופי התאים, כמו גם את אלה מאזורי האונה האמצעית בכל צד והדבק את התמונות הללו בשקופית עם תמונות התגובה.
אחת הדרכים הפשוטות ביותר לעורר את גופי הפטריות היא באמצעות הפעלת קולטני אצטילכולין ניקוטיניים יונוטרופיים. התגובה האופיינית לניקוטין 25 מיקרו-מולרי, המוצגת כאן, מתחילה בהפעלה מהירה של הגביע וגופי התאים, והאונות המדיאליות, ומשתמשת במבנה GFP-aequorin הממוזג, שנקשר לסידן ופולט אור. בדרך כלל, התגובה בגביע ובגוף התא נמשכת זמן רב יותר, ומציגה תגובה ביולוגית גדולה יותר מאשר האונות, כפי שמוצג בפאנלים העוקבים של התגובה.
תיעוד מדגם של התגובה הביו-לומינסנט להפעלה ניקוטינית לאורך זמן מתואר על ידי גרף זה, כאשר מספר הפוטונים באזור העניין המכיל את הגביע וגופי התאים מתואר בגרף בשחור, ומספר הפוטונים באזור האונה המדיאלית מוצג באדום. מגרף זה ניתן לקבוע את אורך התגובה, ערך שיא הפוטון במהלך התגובה והשטח הכולל מתחת לכל עקומה. לאחר השליטה, שלב ההכנה אמור להימשך שעתיים בלבד לפני הדגירה, תלוי במספר הזבובים.
בנוסף, ניתן להשלים כל הקלטה תוך עשרים דקות בלבד, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להזדקן כראוי ולשמור על מלאי זבובים כדי להבטיח שחזור בין הדגימות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות התנהגות נוספות על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו איזו השפעה יש לפעילות המבנה על התנהגות ספציפית.
פיתוח טכניקה זו סלל את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור פעילות עצבית ארוכת טווח במוח הדרוזופילה. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין דגימות להדמיה ביולוגית במוח הזבוב. אל תשכח שניקוטין יכול להיות מסוכן לבריאותך.
יש לנקוט באמצעי זהירות כגון כפפות בעת הכנת פתרונות או ניקוי מהליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקת דימוי ביו-לומנסנטית חדשנית לדימוי פונקציונלי של תנודות סידן in vivo. השיטה עושה שימוש במבנה GFP-aequorin הנקשר ל-Ca2+ ופולט אור, מה שמאפשר דימוי לטווח ארוך במבני מוח עמוקים ללא צורך בעירור באמצעות לייזר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירוביולוגיה
- דימוי סידן
- דימוי ביולומינסנטי
רקע
- שינויים חולפים בריכוז הסידן (Calcium transients) משמשים כמדדים לפעילות נוירונלית.
- טכניקות מסורתיות של דימות סידן עלולות לגרום לפוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) ורעילות.
- דימוי של מבני מוח עמוקים מהווה אתגר בשימוש בשיטות קונבנציונליות.
- הבנת הפעילות הבסיסית של המוח היא קריטית למחקר נוירוביולוגי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לדימוי ארוך-טווח של תנודות סידן (calcium transients).
- מתן אפשרות לדימוי באזורים עמוקים של המוח.
- אספקת תובנות לגבי הפעילות הבסיסית של מוח הזבוב במהלך שינה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בבנאי מאוחד של GFP-aequorin.
- הכנת קווי Drosophila melanogaster עבור דימות.
- תמיסות ניסוייות כפי שמתואר בפרוטוקול.
- דימות in vivo ללא עירור לייזר.
תוצאות עיקריות
- דימוי ארוך טווח מוצלח של תנודות סידן ב-Drosophila.
- יכולת גישה למבני מוח עמוקים ללא פוטובליץ' (photobleaching).
- תובנות לגבי הפעילות הבסיסית של מוח הזבוב.
- פוטנציאל ליישום באורגניזמי מודל אחרים, כגון עכברים.
מסקנות
- טכניקת הדימות הביולומינסנטי מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות קלאסיות.
- שיטה זו יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי תהליכים נוירוביולוגיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו עבור אורגניזמי מודל שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי סידן בביולומינסנציה באמצעות GFP-aequorin מאפשר דימוי תפקודי לטווח ארוך ברקמות עמוקות in vivo ללא עירור בלייזר, ובכך נותן מענה למגבלות מרכזיות של דהיית צבע (photobleaching) ורעילות המאפיינות דימוי סידן מסורתי. גישה זו תומכת בניטור מתמשך של פעילות נוירונלית במעגלים עצביים מורכבים, ומספקת מדד למצבי מוח בסיסיים ומעוררים הרלוונטיים לנוירופרמקולוגיה ותיקוף מטרות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי מתן קריאות כמותיות הניתנות לשחזור של דינמיקת סידן לאורך תקופות ממושכות, ובכך מקלה על הפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מדידת תנודות סידן כמדד ישיר להפעלה עצבית בתגובה לגירויים פרמקולוגים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות דימוי ברזולוציה זמנית גבוהה ומתמשכת של זרימת סידן תוך-תאית באוכלוסיות עצביות המוגדרות גנטית.
- ערך ניבוי: משפר את הביטחון במעורבות המטרה ובמודולציה של המסלול על ידי לכידה של תנודות סידן פנימה ושל אותות סידן המשתחררים ממאגרים לאורך זמן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: יוצר מערכות ביולוגיות טרנסגניות יציבות (למשל, Drosophila, עכבר) עם ביטוי ממוקד של GFP-aequorin למדידות עקביות וניתנות לשחזור של שטף סידן.
- פלט כמותי: מספק קריאות המבוססות על ספירת פוטונים המאפשרות ניתוח קינטי של תגובות המושרות על ידי אגוניסטים, כגון ניקוטין או פוטשום כלוריד, ובכך תומך בקביעת עקומות מנה-תגובה וערכי EC50.
- סקילביליות: תואם למערכות פירפוזיה ולפלטפורמות אוטומטיות של דימוי פוטוני, מה שמאפשר סריקת תרכובות סטנדרטית על פני גנוטיפים ותנאים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקל על חקר מעגלי למידה וזיכרון (למשל, גופי הפטרייה ב-Drosophila) שבהם איתות סידן מעורב בתפקוד קוגניטיבי ובהפרעות נוירופסיכיאטריות.
- המשכיות תרגומית: מאפשר דימוי אורך לאורך זמן, החל מהפעילות הבסיסית, דרך גירוי פרמקולוגי ועד להתאוששות, ובכך תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון במסלולי פיתוח פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מפחית עמימות במנגנון המטרה על ידי קישור חשיפה לתרכובת לדינמיקת סידן כמותית בזמן אמת ברקמה עצבית שלמה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם כקריאה תפקודית (functional readout) בעקבות מעורבות המטרה, ובכך היא מגשרת בין בדיקות ביוכימיות לסריקה פנוטיפית על ידי אספקת תיקוף מבוסס-פעילות בזמן אמת של אפלול המטרה העצבית.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות דימות של תגובות סידן לנוירומודולטורים (למשל, nicotine) באזורי מוח מוגדרים, מה שמאפשר הפחתת סיכונים עבור מטרות המעורבות באותות סינפטיים.
- סריקה (Screening): מספק נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של שטף סידן באמצעות ספירת פוטונים, מה שמאפשר השוואה של יעילות תרכובות ומשך פעולתן בין קבוצות ניסוי.
- אנליטיקה: מייצר עקומות קצב ספירה ומדדי שטח תחת העקומה (AUC) המאפשרים לצומיים להשוות את עוצמת התגובה, הקינטיקה וההתאוששות בין תנאים שונים, ובכך לתמוך בניתוח יחסי מבנה-פעילות (SAR).
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לדימות במעגלים שמורים (למשל, mushroom bodies) המעורבים בתוצרי התנהגות, עם יישום למודלים של יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקיים פלטפורמת דימות הניתנת לשימוש חוזר למחקרים אורכיים, מה שמפחית את הצורך בהכנה חוזרת של מודלים ותומך בסטנדרטיזציה בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון ניבואי בתיקוף המטרה על ידי אפשור תצפית ישירה על פעילות נוירונלית המתווכת על ידי סידן, ללא הפרעות של פוטוטוקסיות או ארטיפקטים של הבהרה (bleaching).
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה באמצעות רפורטרים מקודדים גנטית ומערכות פרפוזיה מבוקרות, תוך מזעור השונות בין הרצות שונות ומעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים פונקציונליים רציפים וברזולוציה גבוהה, המפחיתים נשירה בשלבים מאוחרים עקב השפעות בלתי צפויות של רשתות עצביות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם סיכון על בסיס פרופילים כמותיים של תגובת סידן, ובכך תומך ביעילות הון בתהליך אופטימיזציה של מובילים (lead optimization).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במערכות מודלים גנטיות (למשל, GAL4/UAS ב-Drosophila) ובביולוגיה מולקולרית לצורך יצירה ותיקוף של קווים טרנסגניים.
- תלוי בתשתית לגילוי פוטונים, הכוללת מצלמות מקוררות (-80°C), מדמי פוטונים ומערכות פרפוזיה להחלפת תמיסות.
- מחייב סטנדרטיזציה של טעינת coelenterazine, זמני דגירה ופרוטוקולי הקלטת בסיס (baseline) כדי להבטיח השוואתיות בין דגימות.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת הגישה בין מינים שונים (למשל, עכבר לעומת זבוב) בשל הבדלים בחדירה למחסום המוח-דם ובהגשת קו-פקטורים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בתנאי חדר אפל במהלך גילוי הפוטונים וטיפול זהיר ב-coelenterazine, שהוא רגיש לאור ודורש הכנה טרייה.
