Name: באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: חקור אפיון סרטי חלבון מומסים במים באמצעות TOF-SIMS וממשק SALVI. שיטה זו מאפשרת ניתוח in situ של ביומולקולות בממשק מוצק-נוזלי לחקר מערכות ביולוגיות מורכבות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה ליוזמת ההדמיה הכימית של המעבדה הלאומית של צפון מערב האוקיינוס השקט (PNNL) - מחקר ופיתוח מכוון מעבדה (CII-LDRD) וקרן סינתזה וסימולציה של חומרים על פני קנה מידה (MS3) יוזמת LDRD על התמיכה. גישה אינסטרומנטלית ניתנה באמצעות הצעה בנושא מדע של המעבדה למדעי הסביבה (EMSL) של המעבדה למדעי הסביבה (EMSL). EMSL הוא מתקן משתמש מדעי לאומי בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי (BER) ב-PNNL. המחברים מודים למר שיאו סוי, מר יואן-ג'או דינג וגב' חואן יאו על קריאת כתב היד ומתן משוב מועיל. PNNL מופעל על ידי Battelle עבור ה-DOE תחת חוזה DE-AC05-76RL01830.

<ol><li>Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+rotation+barriers+on+protein+molecular+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Water rotation barriers on protein molecular surfaces.</a> Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).</li>
<li>Maruyama, Y., Harano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+water+drive+protein+folding%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Does water drive protein folding?</a> Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).</li>
<li>Chaplin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+-+Do+we+underestimate+the+importance+of+water+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+hydration+dynamics+around+a+protein+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mapping hydration dynamics around a protein surface.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).</li>
<li>Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+analysis+of+conformational+changes+in+adsorbed+protein+films%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films.</a> Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).</li>
<li>Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+proteins+with+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The interaction of proteins with solid surfaces.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).</li>
<li>Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+structure+of+binary+and+ternary+adsorbed+protein+films+using+electron+spectroscopy+for+chemical+analysis%2C+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry%2C+and+radiolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling.</a> Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).</li>
<li>Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+liquid+surfaces+under+vacuum+using+SEM+and+and+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).</li>
<li>Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+hybrid+microfluidic+platform+compatible+for+in+situ+imaging+by+vacuum-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+A%22%5BJournal%5D)">Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101(2011).</li>
<li>Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+aqueous+surfaces+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22LC+GC+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS.</a> LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).</li>
<li>Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , 8,555,710 B2 (2013).</li>
<li>Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , 20,140,038,224 A1 (2014).</li>
<li>Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+microfluidic+device+for+in+situ+ToF-SIMS+analysis+of+selected+organic+molecules+at+aqueous+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces.</a> Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+SEM+and+ToF-SIMS+analysis+of+IgG+conjugated+gold+nanoparticles+at+aqueous+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces.</a> Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+molecular+imaging+of+hydrated+biofilm+in+a+microfluidic+reactor+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS.</a> Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+and+three-dimensional+dynamic+imaging+of+live+biofilms+in+a+microchannel+by+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry.</a> Biomicrofluidics. 9 (3), 031101(2015).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chemical+probing+of+the+electrode-electrolyte+interface+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).</li>
<li>Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibronectin at a glance.</a> J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+the+cell-attachment+site+in+fibronectin+with+monoclonal+antibodies+and+proteolytic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule.</a> Cell. 26 (2), 259-267 (1981).</li>
<li>Engvall, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+soluble+form+of+fibroblast+surface+protein%2C+fibronectin%2C+to+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen.</a> Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).</li>
<li>Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOF-SIMS%3A+Accurate+mass+scale+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).</li>
<li>Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liquids+using+microfluidic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Imaging liquids using microfluidic cells.</a> Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).</li>
<li>Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sailing+into+uncharted+waters%3A+recent+advances+in+the+in+situ+monitoring+of+catalytic+processes+in+aqueous+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Catal.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments.</a> Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).</li>
<li>Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+biophysical+tools+to+investigate+lipid+specificity+in+the+interaction+between+bioactive+molecules+and+the+plasma+membrane%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta-Biomembr%22%5BJournal%5D)">Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review.</a> Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).</li>
<li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+Mol.+Cell+Biol.+Lipids%22%5BJournal%5D)">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li>
<li>Gilmore, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMS+of+organics-Advances+in+2D+and+3D+imaging+and+future+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+A%22%5BJournal%5D)">SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819(2013).</li>
<li>Muramoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToF-SIMS+Analysis+of+Adsorbed+Proteins%3A+Principal+Component+Analysis+of+the+Primary+Ion+Species+Effect+on+the+Protein+Fragmentation+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns.</a> J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).</li>
<li>Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+interpretation+of+ToF-SIMS+measurements+on+adsorbed+proteins+using+PCA%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA.</a> Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).</li>
<li>Gustavsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.-Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications.</a> J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).</li>
<li>Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly%28hydroxylethyl+methacrylate%29+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Biomater%22%5BJournal%5D)">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Salvi הוא ממשק microfluidic המאפשר פני הנוזל דינמי וניתוח ממשק נוזל-מוצק על ידי מכשירים מבוססי ואקום, כגון TOF-SIMS במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). בשל השימוש של פתחים קטנים לחשוף נוזל ישירות בריק, Salvi מתאים טכניקות ספקטרוסקופיה ודימות רבות ממוקדות דק ללא כל שינוי; 22 את הטלטלות הצדדיות של מיקרופלואידיקה להפוך אותו פלטפורמת הדמית multimodal נכון. ייחודיויות ומשמעות של Salvi לעומת טכניקות קיימות אחר מסוכמות כמה סקירות אחרונות. 22-25 כמפתח של טכנולוגית Salvi...

הידרציה חיוני למבנה, 1 קונפורמציה, 2 והפעילות הביולוגית 3 של חלבונים. חלבונים ללא מולקולות מים המקיף אותם לא יצטרכו פעילויות ביולוגיות קיימא. באופן ספציפי, מולקולות מי אינטראקציה עם פני שטח ואת המבנה הפנימי של חלבונים, ומדינות הידרציה שונות של חלבונים לעשות אינטראקציות כאלה ברורים. 4 האינטראקציה של חלבונים עם משטחים מוצקים היא תופעה בסיסית עם השלכות בננוטכנולוגיה, בביו-חומרים ותהליכי הנדסת רקמות. מחקרים ארוכים הראו כי שינויים מרחביים עלולים להתרחש כחלבון מפגשי משטח. TOF-SIMS כבר שנחזה הטכניקה שיש לו פוטנציאל ללמוד ממשק החלבון-מוצק. 5-7 חשוב להבין את הידרציה של חלבונים על משטחים מוצקים, אשר באופן פוטנציאלי מספק הבנה בסיסית של המנגנון של מבנה שלהם, קונפורמציה, ו ביולוגיפעילות אל. עם זאת, שיטות אנליטיות פני השטח העיקריים הם בעיקר מבוססי ואקום יישומים ישיר ללימודי נוזל נדיף קשה עקב אידוי מהיר של נוזל נדיף תחת סביבת ואקום. פיתחנו ואקום תואם microfluidic ממשק, מערכת לניתוח בבית ממשק אבק נוזלי (Salvi), כדי לאפשר תצפיות ישירות של משטחים נוזלי אינטראקציות מוצק נוזלי באמצעות ספקטרומטריית מסה זמן של הטיסה משני יון (TOF-SIMS). 8- 11 ההיבטים הייחודיים כוללים את הפעולות הבאות: 1) בחלון הזיהוי צמצם של 2-3 מיקרומטר קוטר המאפשר הדמיה ישירה של פני הנוזל, 2) מתח הפנים משמש להחזיק את הנוזל בתוך הצמצם, ו -3) Salvi הוא נייד בקרב פלטפורמות מרובות אנליטי. 11,12 Salvi מורכב סיליקון ניטריד (חטא) קרום כאזור זיהוי וכן microchannel עשויים polydimethylsiloxane (PDMS). זה fabricated בחדר הנקי, וגורמי הייצור ועיצוב מפתח כבר מפורט ניירות ופטנטים קודמים. 8-12 היישומים של TOF-SIMS ככלי אנליטי הודגמו באמצעות מגוון של תמיסות מימיות ותערובות נוזל מורכבות, חלק שהכיל חלקיקים. 13-17 באופן ספציפי, נוזל Salvi TOF-SIMS מאפשר דינמי חיטוט של הממשק הנוזל-מוצקה של מערכות ביולוגיות חיות (כלומר, biofilms), תאים בודדים, וממשק מוצקים אלקטרוליטים, פתיחת הזדמנויות חדשות עבור בשלב באתרו מרוכז מחקרים כוללים נוזלים באמצעות TOF-SIMS. עם זאת, העיצוב הנוכחי אינו מאפשר אינטראקציות נוזלי גז עדיין. זהו כיוון לפיתוח עתידי. Salvi נעשה שימוש כדי ללמוד את סרט חלבון hydrated בעבודה זו בפעם הראשונה. פיברונקטין הוא דימר חלבון נפוץ, מורכב משני מונומרים כמעט זהה מקושרים על ידי זוג אג&quot;ח דיסולפיד, 18 אשר אניS-ידוע ביכולתה לאגד תאים. 19,20 נבחר כמערכת מודל כדי להמחיש כי סרט חלבון hydrated יכול להיות נחקר באופן דינמי באמצעות נוזל Salvi TOF-SIMS גישה. פתרון החלבון הוכנס microchannel. לאחר דוגר במשך 12 שעות, סרט חלבון hydrated עטף את הצד האחורי של הממברנה SiN. מים ללא יונים (DI) שימש כדי לשטוף לערוץ לאחר ההקדמה חלבון. מידע נאסף מולקולות חלבון פיברונקטין hydrated ב microchannel Salvi באמצעות TOF-SIMS דינמי. מים די נחקרו גם כביקורת להשוות עם תוצאות שהתקבלו סרט דק hydrated פיברונקטין. הבדלים ברורים נצפו בין סרט חלבון hydrated ומי DI. עבודה זו ממחישה כי חלבון ספיחה על פני שטח בסביבת הנוזלי ניתן ללמוד באמצעות Salvi רומן גישת TOF-SIMS נוזלי. פרוטוקול סרטון נועד לספק הדרכה טכנית עבור אנשים המעונייניםניצול כלי אנליטי חדש ליישומים מגוונים של Salvi עם TOF-SIMS ולהפחית טעויות מיותרות בטיפול נוזלי, כמו גם רכישת וניתוח נתונים TOF-SIMS.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF TOF</td><td>. </td><td>רזולוציית SIMS 5: >10,000 m/&דלתא; m לרזולוציית מסה; >4,000 מ' דלתא; M לרזולוציה מרחבית גבוהה&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת לניתוח בממשק ואקום נוזלי (SALVI)</td><td>המעבדה הלאומית של צפון מערב האוקיינוס השקט</td><td>N/A</td><td>SALVI היא כלי אנליטי ייחודי, עצמאי ונייד המאפשר לראשונה למכשירים מדעיים מבוססי ואקום כגון ספקטרומטריית מסה של יונים משנית בזמן טיסה (ToF-SIMS) לנתח משטחים נוזליים במצבם הטבעי ברמה המולקולרית.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>לחיבור הכניסה והיציאה של SALVI</td></tr><tr><td>5 צירים שלב לדוגמא</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>STAGE מתוצרת עצמית להרכבת SALVI במערכת</td></tr><tr><td>טיהור מים ננו-טהורה</td> ToF-SIMS Barnstead <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP מודול סינון אוסמוזה הפוכה (D2716)</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>21-377-821</td><td>טווח: 100 עד 1,000 מ"ל</td></tr><tr><td>קצה פיפטה</td><td>נפטון</td><td>2112.96.BS</td><td>1,000 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>430791</td><td>15 מ"ל</td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F1141</td><td>1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S25310A</td><td>95% מפורק</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי salvi ו tof-sims

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

עבודה זו ממחישה באפיון באתרו של ביומולקולות חלבון בתמיסה המימית באמצעות מערכת לניתוח בבית ממשק האבק הנוזלי (Salvi) וזמן של הטיסה ספקטרומטריית משני יון המוני (TOF-SIMS). סרט חלבון פיברונקטין מאובן על סיליקון ניטריד (חטא) קרום הנוצר באזור זיהוי Salvi. במהלך ניתוח TOF-SIMS, שלושה מצבים של ניתוח נערכו כולל ספקטרומטריית מסה ברזולוציה מרחבית גבוהה, דו מימדי (2D) הדמיה, ו פרופיל עומק. ספקטרה המונית נרכשה בשני מצבים חיוביים ושליליים. מים ללא יונים נותחו גם כמדגם התייחסות. התוצאות שלנו מראה כי סרט פיברונקטין במים יש יותר פסגות אשכול מים ברורות וחזקות נמשלו למים לבד. פסגות מאפיין של שברי חומצת אמינו ניתנים לצפייה גם בחלבון hydrated ספקטרה TOF-SIMS. תוצאות אלו ממחישות כי ספיחת מולקולת חלבון על משטח ניתן ללמוד דינמיקהlly באמצעות Salvi ו TOF-SIMS בסביבת הנוזל בפעם הראשונה.

כמה תוצאות נציג מוצגים כדי להדגים את היתרונות של הפרוטוקול המוצע. באמצעות ממשק microfluidic Salvi, אלומת יונים העיקרי (Bi 3 +) יכול להפציץ ישירות על הסרט פיברונקטין hydrated במים DI. לפיכך המיפוי הכימי המולקולרי של פני הנוזל ניתן לרכוש בהצלחה. איור 1 א ו -1 B להראות את ספקטרה המונית TOF-SIMS ה...

עבודה זו מציג פרוטוקול טיפול נוזל וההכנסה מדגם על microchannel עבור באתרו זמן של טיסת ניתוח ספקטרומטריית משני יון המוני של ביומולקולות חלבון בתמיסה מימית.

באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפיין שכבות חלבון ספח בתוך תמיסות מימיות, תוך שימוש במערכת לניתוח בממשק נוזל-ואקום (System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface) ובספקטרומטריית מסות של יוני משניים בזמן מעוף (time-of-flight secondary ion mass spectrometry). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע למולקולות ביולוגיות ולממשק הביולוגי. לדוגמה, אפיון של חלבונים ספוחים על פני שטח מוצק.היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן להתחיל את הטיפול בביומולקולות in situ בסביבה נוזלית, ובשילוב עם מיפוי מולקולרי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביומולקולות בממשק מוצק-נוזל, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כולל חקירה של תאי סרטן בודדים, אינטראקציות של תרופות והיצמדות של ביופילמים. שאבו למזרק של 5 mL נפח של 2 mL של תמיסת 70% ethanol.חברו את המזרק לקצה הכניסה של מכשיר ה-SALVI, והזריקו לאט מיליליטר אחד של הנוזל לאורך 10 דקות. בסיום ההזרקה, הסירו את המזרק וחברו את הכניסה והיציאה של ה-SALVI באמצעות מחבר polyether-ether-ketone. השאירו את המיקרו-תעלה של ה-SALVI מלאה בתמיסת 70%ethanol בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.לאחר מכן, מלאו מזרק שני במים דה-יוניים סטריליים. חברו אותו לכניסה של ה-SALVI והזריקו לאט את המים הדה-יוניים אל תוך המכשיר לאורך 10 דקות. הסירו את המזרק וחברו מחדש את הכניסה והיציאה של המכשיר זו לזו.כדי לקבע שכבת חלבון, התחילו בשאיבת 2 mL של תמיסת פיברונקטין למזרק. חברו את המזרק לכניסה של מכשיר ה-SALVI, והזרימו באיטיות 1 mL של הנוזל לאורך 10 דקות. לאחר מכן, הסירו את המזרק וחברו מחדש את הכניסה והיציאה.דגרו את המערך בצלחת תרבית נקייה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות. לאחר הדגירה, הזריקו לאט 1 mL של מים סטריליים דאיוניים לאורך 10 דקות, ולאחר מכן חברו מחדש את פתח הכניסה לפתח היציאה. להתחלה, הניחו את במת ה-ToF-SIMS על משטח שטוח ונקי.הניחו את מכשיר ה-SALVI על הבמה כאשר פרוסת הסיליקון וממברנת הסיליקון ניטריד פונות כלפי מעלה. קבעו את מכשיר ה-SALVI לבמה באמצעות ארבעה תפסני מתכת, והבריגו את חלקי המתכת המחזיקים את פינות המכשיר אל לוח המתכת באמצעות ארבעה ברגים. לאחר מכן, גלגלו בעדינות את צינור ה-PFTE המחובר לערוץ המיקרופלואידי.השתמש בארבעה חלקי מתכת ובארבעה ברגים כדי לקבע את החלק הקשיח. ודא שהמכשיר ממוקם בשטח הפתוח שעל הבמה, כך שלא יפריע לאלומה הראשית של היונים במהלך הניתוח. לאחר מכן, הרכב את כוס פראדיי (Faraday cup) על הבמה באמצעות בורג.לאחר מכן, פתח את דלת תא ההעמסה (loadlock) של ה-ToF-SIMS והנח את הבמה באופן אופקי על פלטפורמת ההעמסה לפני סגירת הדלת. הפעל את משאבת הוואקום והמתן עד שפנימיות תא ההעמסה תגיע לריק של כ-10⁻⁶ millibar. לאחר כ-30 דקות, ברגע שהוואקום התייצב, העבר את מכשיר ה-SALVI אל התא הראשי.כווננו את קרן היונים הראשונית ואת האנלייזר של ה-ToF-SIMS כדי להשיג רזולוציה מרחבית של כ-400 ננומטר, וזאת בהתאם לפרוטוקול המומלץ על ידי היצרן. לאחר מכן, אתרו את התעלה המיקרופלואידית באמצעות המיקרוסקופ האופטי. השתמשו במרכז התמונה האופטית כנקודת ייחוס, וכווננו אותו כך שיהיה תואם למרכז תמונת היונים המשניים.הדגמה חזותית של שלב זה היא קריטית, שכן קשה ללמוד אותו בגלל שהדגימה עבה יותר מדגימות מוצקים רגילות, וקשה להתאים את ההגדרות כדי למצוא את המיקוד המיטבי של הערוץ. לפני כל מדידה, השתמש בקרן חמצן של 1 keV כדי לסרוק את חלון הסיליקון ניטריד למשך כ-15 שניות להסרת זיהומי פני השטח. כמו כן, השתמש בתותח אלקטרונים (electron flood gun) כדי לפצות על טעינה פנית במהלך כל המדידות.בשלב הבא, בחרו את המצב החיובי או השלילי לפני תחילת רכישת הנתונים. השתמשו ב-25 kiloelectronvolt bismuth three plus כקרן היונים הראשונית בכל המדידות. עבור פרופיל עומק, סרקו את קרן היונים הראשונית על שטח עגול שקוטרו כ-2 micrometers ברזולוציה של 32 pixels על 32 pixels.כדי לצמצם את הזמן הנדרש לפריצה דרך ממברנת הסיליקון ניטריד, השתמש בקרן יונים ראשונית בעלת רוחב פולס ארוך. לאחר הפריצה דרך ממברנת הסיליקון ניטריד, שמור על אותו זרם למשך כ-200 שניות כדי להשיג נתונים מספיקים לשחזורי תמונות דו-ממדיים. לצורך איסוף נתונים, הקטן את רוחב הפולס ל-80 nanoseconds כדי לרכוש ספקטרומים בעל רזולוציית מסה טובה יותר.המשיכו ברכישה זו למשך כ-200 שניות נוספות. באמצעות הממשק המיקרופלואידי של SALVI, קרן היונים הראשונית יכולה להפגיז ישירות את שכבת הפיברונקטין ההידרטציה. מספר צבירי מים ומקטעי חומצות אמינו מצוינים בנתוני ספקטרומטריית המסה של ToF-SIMS.דבר זה מספק ראיה ישירה לתכונות של מולקולות המים המקיפות את מולקולות החלבון המהודרות ונמצאות בתוכן. כאן ניתן לראות את סדרת הזמנים של פרופיל העומק של סרט פיברונקטין מהודר ושל מים דה-יוניים. העוצמות של יונים שניים נבחרים הן זניחות לפני פריצת ממбраנת הסיליקון ניטריד.ברגע שקרום סיליקון ניטריד ננקב, עוצמתם של היונים המשניים עולה באופן משמעותי. תהליך רוחב פולס קצר משמש להשגת נתונים עם רזולוציית מסה טובה יותר עבור שחזורי תמונה וספקטרום. תמונות ה-2-D של סרט הפיברונקטין המהוהוה ומים דאיוניים מייצגות את ספירות היונים המשניים הנבחרים מהדגימה.ככל שהתמונה בהירה יותר, כך גבוה יותר מספר היונים המשניים. תמונות אינטואיטיביות אלו מספקות השוואה ברורה של יונים משניים נבחרים בין דגימות שונות, דבר המסייע בניתוח הנתונים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי המיקרו-ריאקטור חייב להיות אטום לחלוטין לפני התקנתו בתא הוואקום.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומי הביולוגיה וממשקים ביולוגים לחקור ספיחה של חלבונים, היצמדות של ביופילם, שכבות מונו-מולקולריות המורכבות על פני שטח ותופעות רבות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי הדרך לבחינת דגימות נוזליות שונות באמצעות SALVI ו-ToF-SIMS לנוזלים.

in-situ-characterization-hydrated-proteins-water-salvi-tof

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

מטרת הניסוי היא לקבוע ולשלוט, גודל, צורה יציבות עצמית התאספו amphiphiles discotic במים. עבור מימית פולימרים מולקולריים מבוסס ברמה כזו של שליטה קשה מאוד. אנחנו מיישמים את האסטרטגיה בשתי אינטראקציות דוחה ומושכת. את ניסיוני בטכניקות להחיל לאפיין מערכת זו חלים באופן רחב.

שליטה על גודל, צורה ויציבות של פולימרים מולקולריים במים

יותר ממחצית מחלבונים הם חלבונים קטנים (מסה מולקולרית &lt;200 KDA) שקוראים תיגר על שתי הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזורים תלת ממדים. מכתים שלילי אופטימלי הוא פרוטוקול תפוקה גבוהה חזקה ולהשיג ניגודיות גבוהה ויחסית ברזולוציה גבוהה (~ 1 ננומטר) תמונות של חלבונים סימטריים קטנים או מתחמים בתנאים פיסיולוגיים שונים.

מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

נחיתה רכה של יונים שנבחרו המוניים על גבי משטחים היא גישה רבת עוצמה לעריכה לשליטה מאוד של חומרים חדשים. בשילוב עם ניתוח על ידי בספקטרומטריית האתר משנית המונית יון (SIMS) וספקטרוסקופיה קליטת השתקפות אינפרא אדום (IRRAS), נחיתה רכה מספקת תובנות חסרות תקדים לתוך האינטראקציות של מינים מוגדרים היטב עם משטחים.

בSIMS אתרו וIR ספקטרוסקופיה של משטחים מוגדרים היטב הוכן על ידי רכה נחיתה של יונים המוניים שנבחרו

שלבי מפתח בתפקוד החלבון, בפרט שינויים בקונפורמציה של עמוד השדרה ותגובות העברת פרוטונים, מתרחשים לעתים קרובות בסולם הזמן של מיקרו-שנייה עד אלפית השנייה. ניתן לחקור תהליכים דינמיים אלה על ידי ספקטרוסקופיה אינפרא אדום של טרנספורמציה פורייה, במיוחד עבור חלבונים שתפקודם מופעל על ידי אור.

העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום

שיווי משקל שקיעה (SE) יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בסביבה פיזיולוגית. כתב יד זה מתאר את השימוש בטכניקה זו כדי לקבוע את השפעת ה-pH על היציבות של הומו-פנטמר שנוצר על ידי החלבון ההידרופובי הקטן (SH) המקודד על ידי נגיף הנשימה הסינציאלי האנושי (hRSV).

שקיעת שיווי משקל של חלבון ממברנה הקטן oligomer יוצרי: אפקט של היסטידין protonation על pentameric יציבות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום במצב מוצק (ssHDX-MS) וספקטרומטריית מסה של תיוג פוטוליטי במצב מוצק (ssPL-MS) עבור חלבונים באבקות מוצקות. השיטות מספקות מידע ברזולוציה גבוהה על קונפורמציה של חלבונים ואינטראקציות במצב מוצק אמורפי, שעשוי להיות שימושי בתכנון ניסוח.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

מאמר זה מציג שיטה לגידול ממבנה biofilm עבור בחיי עיר יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה למיפוי כימי במצב רטוב, מופעל על ידי כור microfluidic, מערכת לניתוח-הממשק ואקום נוזלי. מר Shewanella oneidensis -1 עם פלורסצנטיות ירוק חלבון שימשה כמודל.

בחיי עיר אפיון Biofilms MR1 Shewanella oneidensis על ידי SALVI וסימס תוף

אנו מציגים שגרה עבור הדמיה בזמן אמת וניתוח הרכב היסודות של חלקיקים boehmite במים יונים על-ידי בחיי עיר נוזלי מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה.

בחיי עיר איפיון חלקיקים Boehmite במים באמצעות נוזלי SEM

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את המבנה ואת הדינמיקה של מים פנים את המשקל האטומי, מבחינת דימות ברזולוציה submolecular, מניפולציה מולקולרית, ספקטרוסקופיה הרטט קשר יחיד.

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של מים פנים עם סריקה מיקרוסקופ מינהור וספקטרוסקופיה

פרוטוקול זה מתאר גישה ללא כיול עבור לכימות חלבון ההומו-oligomerization במבחנה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אור מסחרי. שיטות ניתוח וההגדרות רכישה נכונה מוצגים.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

חקור אפיון סרטי חלבון מומסים במים באמצעות TOF-SIMS וממשק SALVI. שיטה זו מאפשרת ניתוח in situ של ביומולקולות בממשק מוצק-נוזלי לחקר מערכות ביולוגיות מורכבות.

באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS

גלה סרטונים נוספים