באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS
15 בפברואר 2016
עבודה זו מציג פרוטוקול טיפול נוזל וההכנסה מדגם על microchannel עבור באתרו זמן של טיסת ניתוח ספקטרומטריית משני יון המוני של ביומולקולות חלבון בתמיסה מימית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין סרטי חלבון נספגים בתמיסות מימיות, תוך שימוש במערכת לניתוח בממשק הוואקום הנוזלי, וספקטרומטריית מסה משנית של יונים בזמן טיסה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ביומולקולות והממשק הביולוגי. לדוגמא, אפיון חלבונים נספגים במשטח מוצק.
היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן להתחיל את הביו-מולקולות באתרן בסביבה הנוזלית, ובשילוב עם מיפוי מולקולרי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ביומולקולות בממשק מוצק-נוזל, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות, כולל חקירה של תאי סרטן בודדים, אינטראקציות עם תרופות והצמדה של ביופילמים. למזרק של חמישה מיליליטר, שאבו שני מיליליטר של תמיסת אתנול של 70%.
חבר את המזרק לקצה הכניסה של מכשיר SALVI, והזריק לאט מיליליטר אחד מהנוזל במשך 10 דקות. בתום ההזרקה, הסר את המזרק וחבר את הכניסה והיציאה של ה-SALVI באמצעות איחוד פוליאתר-אתר-קטון. שמור את המיקרו-ערוץ SALVI מלא בתמיסת אתנול 70% בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.
לאחר מכן, מלאו מזרק שני במים סטריליים נטולי יונים. חבר אותו לכניסה של ה-SALVI והזריק לאט את המים נטולי היונים למכשיר במשך 10 דקות. הסר את המזרק וחבר מחדש את הכניסה והיציאה של המכשיר יחד.
על מנת לשתק סרט חלבון, התחל במשיכת שני מיליליטר של תמיסת פיברונקטין למזרק. חבר את המזרק לכניסה של מכשיר SALVI, והזריק לאט מיליליטר אחד מהנוזל במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את המזרק וחבר מחדש את הכניסה והיציאה.
דגרו את ההתקנה בכלי תרבות נקי בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות. לאחר הדגירה, הזריק לאט מיליליטר אחד של מים סטריליים נטולי יונים במשך 10 דקות, ולאחר מכן חבר מחדש את הכניסה לשקע. כדי להתחיל, הנח את ה-ToF-SIMS stage על משטח ישר ונקי.
הנח את מכשיר ה-SALVI על ה-stagכשפרוסת הסיליקון וממברנת הסיליקון ניטריד פונים כלפי מעלה. קבע את מכשיר ה-SALVI לבמה באמצעות ארבעה מתכת clampחלקי הידוק, והברג את חלקי המתכת המחזיקים את פינת המכשיר לתוך לוחית המתכת בארבעה ברגים. לאחר מכן, גלגל בעדינות את צינור ה-PFTE המחובר לתעלה המיקרופלואידית.
השתמש בארבעה חלקי מתכת וארבעה ברגים כדי להחזיק את החלק הנוקשה כלפי מטה. ודא שהמכשיר ממוקם בחלל הפתוח על הבמה, כך שהוא לא יפריע לקרן היונים הראשונית במהלך הניתוח. לאחר מכן, הרכיבו את פאראדיי על הבמה באמצעות בורג.
לאחר מכן, פתח את דלת נעילת המטען של ToF-SIMS והנח את ה-stagה אופקית על משטח הטעינה לפני סגירת הדלת. הפעל את משאבת הוואקום ותן לתא נעילת העומס לשאוב לסביבות 10 עד מינוס שישי מיליבר. לאחר מכן, העבר את מכשיר ה-SALVI לתא הראשי לאחר כ-30 דקות, לאחר התייצבות הוואקום.
כוונן את אלומת היונים הראשונית, ואת המנתח של ה-ToF-SIMS, כדי להשיג רזולוציה מרחבית של כ-400 ננומטר על ידי ביצוע הפרוטוקול המומלץ של היצרן. לאחר מכן, מצא את התעלה המיקרופלואידית באמצעות המיקרוסקופ האופטי. השתמש במרכז התמונה האופטי כהתייחסות, ויישר אותו כך שיהיה עקבי עם מרכז תמונת היונים המשני.
הדגמה חזותית של שלב זה היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד אותה, מכיוון שהדגימה עבה יותר מדגימות מוצקות רגילות, וקשה להתאים את ההגדרות כדי למצוא את המיקוד הטוב ביותר של הערוץ. לפני כל מדידה, השתמש בקרן חמצן של קילו-אלקטרון וולט אחד כדי לסרוק את חלון הסיליקון ניטריד למשך כ-15 שניות כדי להסיר זיהום פני השטח. כמו כן, השתמש באקדח הצפה אלקטרונים כדי לפצות על טעינת פני השטח במהלך כל המדידות.
לאחר מכן, בחר את המצב החיובי או השלילי לפני תחילת רכישת הנתונים. השתמש בביסמוט של 25 קילו-אלקטרון-וולט שלוש פלוס כקרן היונים העיקרית בכל המדידות. לצורך פרופיל עומק, סרוק את קרן היונים העיקרית על שטח עגול בקוטר של כשני מיקרומטר ברזולוציה של 32 פיקסלים על 32 פיקסלים.
כדי למזער את הזמן הנדרש לניקוב דרך קרום הסיליקון ניטריד, השתמש בקרן יונים ראשונית ברוחב פולס ארוך. לאחר ניקוב קרום הסיליקון ניטריד, שמור על אותו זרם למשך כ-200 שניות כדי להשיג מספיק נתונים לשחזורי תמונה דו מימדיים. לאיסוף נתונים, צמצם את רוחב הדופק ל-80 ננו-שניות על מנת לרכוש ספקטרום עם רזולוציית מסה טובה יותר.
המשיכו ברכישה זו כ-200 שניות נוספות. באמצעות הממשק המיקרופלואידי של SALVI, קרן היונים הראשונית יכולה להפציץ ישירות על סרט הפיברונקטין המיובש. מספר אשכולות מים ושברי חומצות אמינו מסומנים על ידי נתוני מפרט המסה של ToF-SIMS.
זה מספק עדות ישירה לתכונות של מולקולות מים סביב ובתוך מולקולות החלבון המייבשות. כאן, ניתן לראות את סדרות הזמן של פרופיל העומק של סרט הפיברונקטין המיובש ושל מים נטולי יונים. העוצמות של יונים שניים נבחרים זניחות לפני ניקוב קרום הסיליקון ניטריד.
לאחר ניקוב קרום הסיליקון ניטריד, עוצמות היונים המשניים גדלות משמעותית. תהליך רוחב הדופק הקצר משמש להשגת נתונים עם רזולוציית מסה טובה יותר לשחזורי תמונה וספקטרום. התמונות הדו-ממדיות מסרט הפיברונקטין המיובש והמים נטולי היונים מייצגות את ספירת היונים המשניים שנבחרו מהדגימה.
ככל שהתמונה בהירה יותר, כך ספירת היונים המשנית גבוהה יותר. תמונות אינטואיטיביות אלו נותנות השוואה ברורה של יונים משניים נבחרים בין דגימות שונות, מה שמסייע בניתוח נתונים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמיקרו-כור צריך להיות נטול דליפות לפני התקנתו בתא הוואקום.
טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה והממשקים הביולוגיים לחקור ספיחת חלבונים, הצמדת ביופילם, חד-שכבות מורכבות על פני השטח ותופעות רבות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ללמוד דגימות נוזליות שונות באמצעות SALVI והנוזל ToF-SIMS.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
עבודה זו מציגה פרוטוקול לאפיון של שכבות חלבון ספחב בממסים מימיים באמצעות ספקטרומטריית מסות של יוניים משניים בזמן מעוף (time-of-flight secondary ion mass spectrometry). שיטה זו מאפשרת ניתוח in situ של ביו-מולקולות בממשק מוצק-נוזל, ומספקת תובנות לגבי מערכות ביולוגיות שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוכימיה
- ספקטרומטריית מסות
- ניתוח ביו-מולקולרי
רקע
- אפיון של ביומולקולות הוא חיוני להבנת האינטראקציות שלהן.
- ספקטרומטריית מסות של יוניים משניים בזמן מעוף (Time-of-flight secondary ion mass spectrometry) מאפשרת מיפוי מולקולרי מפורט.
- ניתן להחיל את השיטה על מערכות שונות, כולל תאי סרטן ואינטראקציות של תרופות.
- ניתוח in situ משפר את ההבנה של ביומולקולות בסביבתן הטבעית.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לטיפול בנוזלים ולהחדרת דגימות.
- ניתוח של ביו-מולקולות חלבון בתמיסות מימיות.
- אספקת תובנות לגבי התנהגותן של ביו-מולקולות בממשקים ביולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במערכת לניתוח בממשק ואקום-נוזל.
- ספקטרומטרית מסות של יונים משניים בשיטת זמן מעוף (Time-of-flight secondary ion mass spectrometry) לניתוח.
- הכנת דגימות הכוללת תמיסת אתנול 70%.
- אפיון in situ של חלבונים ספיחים.
תוצאות עיקריות
- החדרה מוצלחת של דגימות לתוך מיקרו-תעלות לצורך אנליזה.
- אפיון של חלבונים שנסמכו על פני שטח מוצק.
- תובנות לגבי אינטראקציות של ביומולקולות בסביבות נוזליות.
- יישומים פוטנציאליים במחקר הסרטן ובמחקרי אינטראקציית תרופות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח יעיל של ביו-מולקולות חלבון.
- ניתוח in situ מספק תובנות בעלות ערך לגבי התנהגות ביו-מולקולרית.
- ניתן להתאים שיטה זו למגוון יישומים של מחקר ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולרי ישיר של חלבונים מהידרטסביים בסביבתם המימית הטבעית, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בניתוח ממשקים ביולוגיים. באמצעות שימור מצב ההידרטציה של החלבון במהלך ניתוח ToF-SIMS, היא מספקת תובנות מכניסטיות לגבי ספיחה ביו-מולקולרית ואינטראקציות בין מים לחלבונים הרלוונטיות לתיקוף מטרות. גישה זו תומכת במאמצי גילוי מוקדמים על ידי אספקת נתונים כימיים ברזולוציה מרחבית, המנחים הערכה פונקציונלית של המטרה ומפחיתים את אי-הוודאות בזיהוי מובילים (leads).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני ספיחה של חלבונים בממשקים מוצק-נוזל תחת תנאי הידרציה רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מספק זיהוי ישיר של פרגמנטים של חומצות אמינו וחתימות של אשכולות מים כדי לאשש את נוכחות החלבון ואת הקונפורמציה שלו.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביעד על ידי חשיפת האופן שבו שכבות הידרציה משפיעות על אינטראקציות של ביו-מולקולות עם פני השטח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מפות מולקולריות ללא סימון (label-free) של התפלגות חלבונים ברזולוציה מרחבית של ~400 nm לצורך אפיון פני השטח של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מספק ספירות כמותיות של יוני משניים, המאפשרות הערכת שחזוריות בין תנאים שונים של קיבוע חלבונים.
- מוכנות לבדיקה: מקל על הכנת פני שטח המוכנים לסריקה על ידי אימות שלם שכבת החלבון לפני קמפיינים של סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין בדיקות קישור in vitro לסביבות דומות למצב טבעי על ידי אפיון חלבונים במצב מומה.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהיר האם אירועי קישור שנצפו מתרחשים באמצעות מגע חלבוני ישיר או שהם מתווכים על ידי שכבות הידרציה.
- רלוונטיות פרה-קלינית: תומך במידול מערכות הרלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לניתוח של פיברונקטין וחלבונים אחרים של המטריקס החוץ-תאי בתמיסה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הטכניקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת מעורבות המטרה ועד לאופטימיזציה של מוביל, על ידי אספקת נתונים מולקולריים ממשקיים המשלים בדיקות של תמיסות במסה. היא ממוקמת לאחר תיקוף ראשוני של המטרה אך לפני סריקה תאית, ומספקת רובד מכניסטי למעבר משלב הפגיעה לשלב המוביל (hit-to-lead).
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנוני ספיחה ותפקוד של מטרות הקשורות למסלולים באמצעות מיפוי מולקולרי ישיר.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות על ידי אימות אחידות שכבת החלבון ועקביות האות התלויה במימד ההידרטציה.
- אנליזה: מספקת ספקטרומים ברזולוציית מסה ומפות יונים דו-ממדיות המאפשרות השוואה של פרגמנטים של חלבונים ומקבצי מים תחת תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לעבודה פרה-קלינית על ידי שמירה על מצב ההידרטציה של החלבון, ובכך משפרת את הרלוונטיות לתנאי ממשק ביולוגי in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לאנליזה של ממשקים, ישימה על פני מטרות ומשפחות חלבונים מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות במנגנוני אינטראקציה בין חלבון לפני השטח.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של ניתוח חלבונים מהודרים באמצעות טיפול בנוזלים הניתן לשחזור וממשק מיקרופלואידי תואם ואקום.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות go/no-go בשלב מוקדם, המבוססות על נתונים מכניסטיים של ממשקים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי הבהרה האם המעורבות של המטרה היא ישירה או מתווכת על ידי הידרציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח פני שטח בוואקום וטיפול במכשירים מיקרופלואידיים כדי לשמור על תפעול SALVI ללא דליפות.
- תלוי במכשור ToF-SIMS בעל יכולת החלפה בין מצבי יונים חיוביים/שליליים וביצוע פרופילי עומק.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי מדע הפני שטח וביולוגיה לצורך הכנת דגימות ופירוש נתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת השימוש מעבר לפיברונקטין לחלבונים אחרים בעלי קינטיקה של ספיחה משתנה.
- מוגבל על ידי הצורך בתאימות לוואקום גבוה במיוחד (ultra-high vacuum), המגביל את הניתוח למשטחים התואמים איטום מיקרופלואידי תחת ואקום.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Cleaning and Sterilization of the SALVI Microchannel
2:05
Immobilization of the Protein Film in SALVI
2:50
Install SALVI into the ToF-SIMS Loadlock Chamber
4:05
ToF-SIMS Data Acquisition
7:35
Results: Dynamic Liquid Surface and Liquid-solid Interface Analysis
9:02
Conclusion
