גירוי ישיר שוטף הקלטת מערך רבה-אלקטרודה של פעילות כמו-תפיסת עכברי הכנת פרוסת המוח
June 7th, 2016
מחקרים הראו שגירוי זרם ישר טרנס-גולגולתי קתודלי יכול לייצר השפעות מדכאות על התקפים עמידים לתרופות. במחקר זה, תוכנן מערך ניסוי במבחנה שבו הוערכו גירוי הזרם הישר ורישום מערך מרובה אלקטרודות של פעילות דמוית התקף בהכנת פרוסות מוח של עכברים. פרמטרי הגירוי בזרם ישר הוערכו.
המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה, היא לגשת לסידור האלקטרודות בתא ההקלטה לגירוי זרם ישר של פרוסת מוח והשפעתו על פעילות דמוית התקף שנרשמה באמצעות מערך מרובה אלקטרודות. זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בגירוי זרם ישר, ומערך מרובה אלקטרודות תיעד פעילות דמוית התקף בפרוסת מוח של עכבר. יתרון של טכניקה זו הוא שניתן להעריך את ההשפעות של גירוי זרם ישר במסלול הספציפי של פרוסת מוח העכבר.
מי שידגים את ההליך יהיו הסיאנג צ'ין ווי-ג'ן צ'אנג, טכנאים מהמעבדה שלי. בהליך זה, יש לעקר את כל המכשירים הכירורגיים בתמיסת אתנול של 75% לפני הניסוי. לאחר מכן, חשפו את גולגולת החיה וחתכו את השריר שנותר.
לאחר מכן, קלפו את פני השטח הגביים של הגולגולת בעזרת רונג'ורים, וחתכו את הצדדים. לאחר מכן, בעזרת מרית, חותכים את נורות הריח וחיבורי העצבים לאורך פני הגחון של המוח לפני הסרתו. העבירו במהירות את המוח לכוס מלאה ב-ACSF קר כקרח, מחומצן.
להכנת פרוסות המכילות את מסלול MT-ACC, בצע חתך סגיטלי, 2 מ"מ לרוחב קו האמצע בכל חצי כדור, כדי להציג את האנטומיה התת-קורטיקלית. לאחר מכן, בצע חתך צולב זוויתי במקביל למערכת הסיבים הנראית לעין בסטריאטום. בצע את חתך הצלב הזוויתי השני מהחיבור בין המוח הקטן לקליפת המוח הראייה, לנקודת האמצע בין הקומיסורה הקדמית לדרכי הראייה, שהם גחוניים ומקבילים למסלול החגורה של התלמוס.
לאחר מכן, חבר את גוש המוח לצלחת זוויתית עם דבק ציאנואקרילט. בצע חתך ממש מעל נקודת הפנייה של השביל. לאחר מכן, פרשו את הצלחת, שטחו אותה והדביקו אותה לשלב החדר של ויברטום.
לאחר מכן חתכו את פרוסות המוח בעובי של 500 מיקרומטר, ושמרו אותן ב-ACSF מחומצן קר כקרח. העבירו פרוסה לתא ההקלטה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עם שפע רציף של ACSF מחומצן למשך שעה. אשר את המיקום של בדיקת MEA במערכת הרב-ערוצית.
השתמש בצינור אחד כדי להנחות את ה-ACSF לתוך תא ה-MEA ובצינור השני כדי להנחות את ה-ACSF מחוץ לתא. יש להחדיר את התכשיר ברציפות עם ACSF חם ומחומצן בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. בעזרת צמר גפן רטוב, העבירו פרוסת מוח ל-MEA.
הזיזו בזהירות את פרוסת המוח כדי לכוון את ה-ACC מעל האלקטרודות, ואז ייצבו את פרוסת המוח עם עוגן פרוסה כדי להבטיח חיבור חשמלי טוב בין הפרוסה לאלקטרודות. לאחר מכן, הנח את אלקטרודת האנודה הפרוקסימלית ל-ACC ואת אלקטרודת הקתודה הדיסטלית ל-ACC. רשום את עוצמת השדה לפי שני כיווני השדה של MEA.
לאחר מכן העבירו את הזרמים החשמליים באמצעות ממריץ. כוונן את המרחק בין שתי אלקטרודות כלוריד הכסף לכ-1.5 עד 2 ס"מ והתאם את עוצמת הזרם של הממריצים כדי להפוך את ה-DCS בין 0.5 ל-2 מיליאמפר . בהליך זה, הנח אלקטרודת טונגסטן ב-MT, והעביר פולסים מהסטימולטור לאזור התלמי של הפרוסה.
לאחר מכן, השתמש בעוצמות זרם שונות, כדי לקבוע את הסף שמעורר תגובת ACC. הזז את אלקטרודת הטונגסטן לאורך מסלול החגורה של התלמוס כדי להשיג את פרופיל התגובה האופטימלי. הקלט 1-20 תגובות ACC והשתמש בתוכנה כדי לממוצע אוטומטי של כל תגובות ה-ACC שעוררו את גירוי ה-MT שלי.
כדי לגרום לפעילות דמוית התקף, הוסף 250 מיקרומולרית 48P ו-5 מיקרו-מולרית דו-מולרית לתמיסת הזלוף, והמשיך להעשיר את הפרוסה במשך שעתיים-שלוש. שמור על המשאבה בקצב זלוף מהיר יחסית, מה שיכול לסייע במניעת הצטברות שיפוע pH. לאחר מכן, הנח את אלקטרודת הטונגסטן ב-MT וספק גירוי חשמלי כדי לקבל פרופיל תגובת ACC.
רשום 10-20 סוויפ וממוצע התגובות. לאחר מכן, החלף את תמיסת העירוי ב-ACSF טרי כדי לשטוף את התרופות. בהליך זה, הקפידו על יצירת שדות חשמליים אחידים, על ידי העברת זרמים בין שני חוטי כסף מקבילים מצופים כלוריד כסף הממוקמים בתוך תא ה-MEA.
אם אין בעיות, ה-DCS צריך להישאר בין 0.5 ל-2 מיליאמפר . לאחר מכן, כבה את ה-DCS ועורר את התלמוס עם אלקטרודת טונגסטן. כדי להשיג תגובות סינפטיות מקסימליות ב-ACC, רשום 10-20 תגובות ולאחר מכן ממוצע אותן.
לאחר מכן, הפעל את ה-DCS ועורר את התלמוס בו זמנית. להעריך את שינויי המשרעת של הגירוי התלמי שעורר תגובת ACC במהלך DCS. כעת, כבה את ה-DCS, הוסף 250 מיקרו-מולרי 48P ו-5 מיקרו-מולרי דו-מולרי לתמיסת הזלוף, והמתן 2-3 שעות.
אם התרופות משפיעות על פרוסת המוח, הפרוסה אמורה לייצר תגובות התקפים בקליפת המוח. לאחר מכן, אסוף 10-20 תגובות קליפת המוח החגורה הקדמית, ומדוד את המשרעת ומשך הזמן של תגובות ההתקפים בקליפת המוח המעוררות חשמלית. קן, הפעל את ה-DCS ועורר את התלמוס בו זמנית.
להעריך את השינויים במשרעת ובמשך תגובות ההתקפים בקליפת המוח במהלך יישום DCS. לאחר מכן, החלף את תמיסת הזלוף ב- ACSF טרי כדי לשטוף את התרופות. איור זה מראה תגובות מעוררות שונות, הכוללות את הגירוי התלמי המעורר תגובות ב-ACC, פעילות הנגרמת על ידי תרופות, דמוית התקף, וגם את הגירוי התלמי וגם את הפעילות דמוית ההתקף הנגרמת על ידי תרופות.
איור זה מראה את ההשפעה של כיוונים שונים ב-DCS, כגון כיוונים שונים בשדה החשמלי, גירוי תלמי מעורר תגובות עם DCS, וההשפעה של DCS קתודי על פעילות דמוית התקף. ובאיור זה, 15 דקות של DCS קתודלי מוצגות שגרמו ביעילות לדיכאון לטווח ארוך ותגובות מעוררות דיכאון. משך ההתקף ירד משמעותית לאחר 15 דקות של DCS קתודלי בהשוואה ללא יישום DCS.
מהר יותר, מבחינה טכנית ניתן לעשות זאת תוך ארבע שעות אם זה מבוצע כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע עניינים אחרים כמו גירוי מגנטי טרנס-גולגולתי, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מתן גישות לא פולשניות לשליטה בהתקפי התנגדות. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול הלא פולשני לחקור טיפולי התקפים במודל של בעלי חיים.
אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בגירוי הנוכחי כדי להעריך פעילות דמוית התקף בפרוסות מוח.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה חוקר את ההשפעות של גירוי ישיר טרנס-גולגולתי קטודלי על התקפים עמידים לתרופות באמצעות מודל פרוסת מוח עכבר in vitro. הסידור של האלקטרודות והשפעתם על פעילות דמוית התקף הוערכו באמצעות מערך רב-אלקטרודות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- אלקטרופיזיולוגיה
- גירוי עצבי
רקע
- לגירוי טרנס-גולגולתי ישיר קטודלי יש השפעות טיפוליות פוטנציאליות על התקפים.
- הבנת מנגנוני הגירוי יכולה לסייע בפיתוח טיפולים לאפילפסיה עמידה לתרופות.
- מודלים in vitro מאפשרים שליטה מדויקת ותצפית על פעילות עצבית.
- מערכי רב-אלקטרודות מספקים הקלטות מפורטות של פעילות חשמלית בפרוסות מוח.
מטרת המחקר
- להעריך את ההשפעות של גירוי זרם ישיר על פעילות דמוית התקף בפרוסות מוח עכבר.
- להעריך את סידור האלקטרודות בתא ההקלטה.
- להעמיק את ההבנה של המסלולים המושפעים מהגירוי.
שיטות ששימשו
- הכנת פרוסות מוח עכבר לניסוי.
- יישום גירוי טרנס-גולגולתי ישיר קטודלי.
- הקלטת פעילות דמוית התקף באמצעות מערך רב-אלקטרודות.
- הערכת פרמטרים של גירוי והשפעותיהם.
תוצאות עיקריות
- גירוי זרם ישיר הביא לתוצאות מדכאות על פעילות דמוית התקף.
- סידורי אלקטרודות ספציפיים השפיעו על תוצאות הגירוי.
- המחקר סיפק תובנות לגבי המסלולים המעורבים במודולציית התקפים.
- התוצאות תומכות בפוטנציאל של גירוי זרם ישיר ביישומים טיפוליים.
מסקנות
- גירוי טרנס-גולגולתי ישיר קטודלי יכול למדוד את פעילות ההתקפים in vitro.
- הממצאים תורמים להבנת טכניקות הגירוי בנוירולוגיה.
- יש צורך במחקר נוסף כדי לתרגם את הממצאים האלה ליישומים קליניים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of neuromodulation strategies for seizure disorders by evaluating direct current stimulation effects on thalamocingulate pathway plasticity and seizure-like activity in an in vitro mouse model. It supports target validation and predictive confidence in preclinical neurotherapeutic development by quantifying amplitude and duration changes in electrically evoked cortical responses. The approach provides a reproducible platform for screening stimulation parameters prior to in vivo testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding neuromodulation of thalamocingulate circuitry in seizure suppression.
- Operational Value: Enables biological de-risking of direct current stimulation targets through pathway-specific electrophysiological readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated brain slice preparations for standardized assessment of stimulation parameters including orientation, field strength, and duration.
- Operational Value: Delivers quantitative, multi-channel electrophysiological outputs that support assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity in anterior cingulate cortex.
- Operational Value: Supports translational continuity from mechanistic discovery to preclinical evaluation of neuromodulation interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization in neuromodulation, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions prior to in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of thalamocingulate circuitry as a modifiable target for seizure control.
- Screening: Enables assay readiness through standardized multi-electrode array recording of stimulation-evoked and seizure-like responses.
- Analytics: Generates quantitative measurements of response amplitude and duration that allow comparative analysis across stimulation conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical continuity by modeling drug-resistant seizure phenotypes in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for evaluating diverse neuromodulation paradigms beyond direct current stimulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement by demonstrating suppression of seizure-like activity through cathodal stimulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled perfusion, electrode placement, and multi-channel recording protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parameter optimization in vitro before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of neuromodulation candidates based on electrophysiological de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slice preparation, and multi-electrode array handling.
- Dependent on vibratory microtomes, perfusion systems, stimulators, and multi-electrode array acquisition units.
- Necessitates standardization of slice orientation, electrode positioning, and perfusion timing across experimental replicates.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require validation of pathway preservation and stimulation efficacy.
- Practical limitations include slice viability duration and the need for precise control of current density and field orientation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Preparation of Medial Thalamus-anterior Cingulate Cortex Brain Slice
3:01
Preparation of Perfusion Chamber for Multielectrode Array Recording and Electric Field Generation
4:23
Electrically-induced Cortical Synaptic Responses and Seizure-like Activity
5:58
Testing Effect of DCS on Evoked Cortical Responses
7:37
Results: Testing of Evoked Responses and Effect of DCS on Seizure Activity
8:37
Conclusion
