גירוי ישיר שוטף הקלטת מערך רבה-אלקטרודה של פעילות כמו-תפיסת עכברי הכנת פרוסת המוח

המטרה הכללית של פרוצדורה ניסויית זו היא לבחון את סידור האלקטרודות בתא ההקלטה עבור גירוי בזרם ישר של פרוסה של מוח והשפעתו על פעילות דמוית פרכוס שהוקלטה באמצעות מערך רב-אלקטרודות. דבר זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לגירוי בזרם ישר, ולפעילות דמוית פרכוס שהוקלטה באמצעות מערך רב-אלקטרודות בפרוסה של מוח עכבר. יתרון של טכניקה זו הוא שניתן להעריך את השפעות הגירוי בזרם ישר במסלול ספציפי של פרוסת מוח העכבר.

הדגמה של הפרוצדורה תבוצע על ידי Hsiang Chin ו-Wei-Jen Chang, טכנאים מהמעבדה שלי. בפרוצדורה זו, יש לעקר את כל המכשרים הכירורגיים בתמיסת 75% ethanol לפני הניסוי. לאחר מכן, חשפו את גולגולת בעל החיים וגזרו את השרירים הנותרים.

בשלב הבא, קלפו את הפני השמאליים של הגולגולת באמצעות רונגורים (rongeurs), וגזרו את הצדדים. לאחר מכן, בעזרת שפכטל, חתכו את הפקעות הריח ואת חיבורי העצבים לאורך הפני השמאליים של המוח לפני הוצאתו. העבירו במהירות את המוח לכלי ביーカー המלא ב-ACSF מחומצן וקר במי קרח.

להכנת פרוסות המכילות את מסלול ה-MT-ACC, בצעו חתך סגיטלי, 2 mm לטרלית לקו האמצע בכל המיספære, כדי לחשוף את האנטומיה הסוב-קורטיקלית. לאחר מכן, בצעו חתך רוחבי בזווית, במקביל לטרקט הסיבים הנראה בסטריאטום. בצעו את החתך הרוחבי השני בזווית, מהחיבור שבין המוח הקטן לקורטקס הוויזואלי, אל נקודת האמצע שבין הקומיסורה האנטריורית לטרקט האופטי, הנמצאים ונטרלית ובמקביל למסלול התלמוס-צינגולט.

לאחר מכן, הצמדו את בלוק המוח ללוחית זוויתית באמצעות דבק ציאנואקרילט. בצעו חיתוך מעט מעל נקודת הפנייה של המסלול. לאחר מכן, פתחו את הלוחית, השטיחו אותה והדביקו אותה על תושבת התא של הוויברטום.

לאחר מכן, חתכו את פרוסות המוח בעובי של 500 micrometers, ושמרו אותן ב-ACSF מחומצן וקר בקרח. העבירו פרוסה לתא ההקלטה בטמפרטורה של 32 degrees Celsius עם זרימה רציפה של ACSF מחומצן למשך שעה אחת. ודאו את מיקום גשש ה-MEA במערכת הרב-ערוצית.

השתמשו בצינור אחד להזרמת ה-ACSF לתוך תא ה-MEA ובצינור השני להוצאת ה-ACSF מהתא. בצעו פרפוזיה רציפה של הדגימה ב-ACSF חם ומחומצן בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. העבירו פרוסת מוח אל ה-MEA באמצעות מקלון צמר גפן רטוב.

העבירו בזהירות את פרוסת המוח כך שה-ACC ימוקם מעל האלקטרודות, ולאחר מכן ייצבו את פרוסת המוח באמצעות מעגן פרוסות כדי להבטיח חיבור חשמלי תקין בין הפרוסה לאלקטרודות. לאחר מכן, מקמו את אלקטרודת האנודה פרוקסימלית ל-ACC ואת אלקטרודת הקתודה דיסטלית ל-ACC. רשמו את עוצמת השדה באמצעות שתי אוריינטציות השדה של ה-MEA.

לאחר מכן, העבירו את זרמי החשמל באמצעות סטימולטור. כווןנו את המרחק בין שתי אלקטרודות הכסף כלוריד לכ-1.5 עד 2 cm, ואת עוצמת הזרם של הסטימולטור כך שזרם ה-DCS יהיה בין 0.5 ל-2 milliamps. בהליך זה, מקמו אלקטרודת טונגסטן ב-MT, והעבירו פולסים מהסטימולטור לאזור התלמוס של הפרוסה.

לאחר מכן, השתמש בעוצמות זרם שונות כדי לקבוע את הסף המעורר תגובת ACC. הזז את אלקטרודת הטונגסטן לאורך נתיב ה-thalamus cingulate כדי להשיג את פרופיל התגובה האופטימלי. רשום 1-20 תגובות ACC והשתמש בתוכנה כדי לבצע ממוצע אוטומטי של כל תגובות ה-ACC שעוררו על ידי גרייה של MT.

כדי להשרות פעילות דמוית פרכוס, הוסיפו 250 micromolar 48P ו-5 micromolar bicuculline לתמיסת הפרפוזיה, והמשיכו בפרפוזיה של הפרוסה במשך שעתיים עד שלוש שעות. שמרו על קצב פרפוזיה מהיר יחסית במשאבה, דבר שיכול לסייע במניעת הצטברות של מדרג pH. לאחר מכן, מקמו את אלקטרודת הטונגסטן ב-MT והפעילו גירוי חשמלי כדי לקבל פרופיל תגובת ACC.

הקליטו 10-20 סריקות (sweeps) ובצעו ממוצע לתגובות. לאחר מכן, החליפו את תמיסתו של שלב טרום-ההיתוך (prefusion) ב-ACSF רענן כדי לשטוף את התרופות. בהליך זה, ודאו יצירת שדות חשמליים אחידים על ידי העברת זרמים בין שני חוטים של כסף מצופים בכסף כלוריד הממוקמים בתוך תא ה-MEA.

אם אין תקלות, ה-DCS אמור להישאר בין 0.5 ל-2 מיליאמפר. לאחר מכן, כבה את ה-DCS ועורר את התלמוס באמצעות אלקטרודת טונגסטן. כדי לקבל תגובות סינפטיות מקסימליות ב-ACC, הקלט 10-20 תגובות ולאחר מכן חשב את הממוצע שלהן.

לאחר מכן, הפעילו את ה-DCS ועצרו בו-זמנית את התלמוס. העריכו את השינויים באמפליטודה של תגובת ה-ACC שהושרה על ידי גירוי התלמוס במהלך ה-DCS. כעת, כבו את ה-DCS, הוסיפו לתרסיף הפרופוזיה 250 micromolar 48P ו-5 micromolar bicuculline, והמתינו 2-3 שעות.

אם התרופות משפיעות על פרוסת המוח, הפרוסה אמורה להפיק תגובות של פרכוסים קורטיקליים. לאחר מכן, אסוף 10-20 תגובות מהקורטקס של הרצועה הקדמית (anterior cingulate cortex), ומדוד את האמפליטודה והמשך של תגובות הפרכוסים הקורטיקליים שהושרה חשמלית. לאחר מכן, הפעל את ה-DCS ועורר את התלמוס בו-זמנית.

העריכו את השינויים באמפליטודה ובמשך של תגובות הפרכוסים הקורטיקליים המושרות במהלך יישום DCS. לאחר מכן, החליפו את תמיסת הפרפוזיה ב-ACSF טרי כדי לשטוף את התרופות. איור זה מציג תגובות מושרות שונות, הכוללות תגובות מושרות על ידי גרייה תלמית ב-ACC, פעילות דמוית פרכוסים המושרית על ידי תרופות, ופעילות דמוית פרכוסים המושרית הן על ידי גרייה תלמית והן על ידי תרופות.

איור זה מציג את ההשפעה של אוריינטציות שונות ב-DCS, כגון אוריינטציות שונות בשדה החשמלי, תגובות שעוררו באמצעות גרייה תלמית ב-DCS, והשפעת DCS קתודי על פעילות דמוית פרכוס. ובאיור זה, נראה כי 15 דקות של DCS קתודי השילו ביעילות דיכוי לטווח ארוך (long term depression) ודיכאו תגובות שעוררו. משך הפרכוס פחת באופן משמעותי לאחר 15 דקות של DCS קתודי בהשוואה לאי-יישום של DCS.

מהיר יותר, מבחינה טכנית ניתן לבצע זאת בארבע שעות אם הפרוצדורה מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע פעולות נוספות כגון גרייה מגנטית טרנסקרניאלית (transcranial magnetic stimulation), במטרה להשיב על שאלות נוספות, כגון אספקת גישות לא פולשניות לשליטה בהתקפים עמידים. לאחר פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול הלא פולשני לבחון טיפולים בהתקפים במודל בעלי חיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בגירוי זרם כדי להעריך פעילות דמוית פרכוסים בפרוסות מוח.