Name: מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות Elegans Caenorhabditis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: למד איך לאפיין פגמים מורפוגניים בהתארכות עוברית של נמטודות Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרוסקופיה מתקדמת. שיטה זו מאפשרת לזהות גנים המווסתים שלבים מוקדמים ומאוחרים של ההתארכות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה (NSERC) של קנדה וקרן קנדה לחדשנות. תודה לד"ר פול מיינס (אוניברסיטת קלגרי, קלגרי, קנדה) על הזן let-502 (sb118ts). חלק מהזנים סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של ה-NIH (P40 OD010440).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li>
<li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+morphogenesis%3A+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li>
<li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502%2FROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li>
<li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation%3A+LET-502%2FROCK%2C+MRCK-1+and+PAK-1%2C+three+kinases+with+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li>
<li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase%2C+MEL-11+myosin+phosphatase%2C+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li>
<li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684(2014).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22Methods%22">Methods</a>. Wood, W. B. , 587-606 (1988).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform%2C+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li>
<li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li>
<li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077(2014).</li>
<li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li>
<li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin%2FIGF-1+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+cells+%3A+devoted+to+molecular+%26+cellular+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li>
<li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43(2014).</li>
<li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li>
<li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר מדדי רומן לאפיין מוקדם שלבים מאוחר של התארכות עוברית. בסעיף 1, השלב הקריטי הוא הימצאות אפשרית של חיידקים על כן השיגור. העוברים מוקפים הרמטית בין המשטח ואת coverslip במהלך רכישת תמונה. איטום המגלשה נדרש להימנע התייבשות של חיות במהלך הרכישה שנמשך יותר משעתיים. למיטב ידיעתנו, אף אחד האיטום לשמש לעלות רפידות agarose בין שקופיות coverslip הם אוויר-חדיר. כתוצאה מכך, כאשר כמות גדולה של חיידקים (או עוברי...

במשך כמעט 50 שנים elegans Caenorhabditis נמטודות ביססה את עצמה כמודל רב עוצמה כדי לחקור שאלות חשובות בפיתוח, נוירוביולוגיה, אבולוציה, אינטראקציות הפתוגן המארח, וכו &#39;1 עוצמת המודל הזה בחקר התפתחות טמון: מחזור החיים הקצר שלה של 3 ימים; הקלות שבה החיות האלה ניתן לשנות גנטיות; השקיפות שלה המאפשר התצפית של עקירת תא ומורפולוגיה בחיות חיים והתפתחותה כי הוא בעיקר רחמית נוספת. שלבי ההתפתחות של נמטודות לערב עובר וארבעה שלבי זחל (L1 כדי L4), ואחריו לבגרות. במהלך התפתחות עוברית, morphogenesis אפידרמיס משך תשומת לב רבה ביכולתה לאפשר הבנה טובה יותר של איך אפיתל תאי נודדים כקבוצה, איך הוא מחדש צומת שלהם ולשנות המורפולוגיה האישית שלהם, כמו גם המיקום היחסי שלהם בתוך האפיתל פונקציונלי.morphogenesis עוריות מחולק לארבעה שלבים: עיבור הגבה מורכב בארגון מחדש של תאי אפידרמיס הגבה, המכונה hypodermis; מתחם גחון, מורכב נדידת תאי hypodermal גחון כלפי קו אמצע הגחון ובכך עוטף את העובר בתוך monolayer תא אפיתל; מוקדם התארכות מאוחר הפיכה העובר בצורת השעועית לתוך זחלים דמויים תולעת. בעקבות morphogenesis, צוהר עובר וזחלי L1 להתחיל להאכיל באמצעות חיידקים זמינים בסביבה המיידית שלהם. ההתארכות עוברית היא אפוא שלב מאוחר של ההתפתחות העוברית. הוא מורכב ההארכה העובר לאורך ציריו אורך הפחתה של הקוטר הרוחבי שלה. זה כרוך שינוי דרמטי של צורת התאים hypodermal. ההתארכות מחולקת צעיר ושלב מאוחר. השלב מוקדם מתחיל בשלב פסיק ומסתיים כאשר השרירים-קיר הגוף מתחיל לחלות בשלב 1.75 של פי wהכשרת הישוב מסוג (WT) עוברים - המתאים עוברים כי הם 1.75 פי אורך לעומת עוברים שאינם מוארך. תהליכים המתרחשים morphogenic בשלב זה מונעים בעיקר על ידי התכווצות של חבילות אקטין פילמנטיות (FBS) ממוקם בקוטב הפסגה של תאי hypodermal שמניעים התארכות שלהם לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר 2. התכווצות של FBS היא שליטה על ידי זרחון של שרשרות אור שרירן ידי שלוש קינאזות LET-502 / ROCK, MRCK-1 ו- PAK-1 5. השלב המאוחר של ההתארכות, מתחיל כאשר שרירי גוף לקיר להיות פונקציונליים ולהתחיל קבלנות. היא כרוכה איתות mechanotransduction מהשרירים-קיר הגוף אל hypodermal הגב ועל הגחון תאים ומסתיימת כאשר חיות לבקוע 3. פגמי התארכות מאופיינים לרוב אחוז בעלי החיים מתים כמו עוברי (הקטלני עוברי; Emb) ואלה התפתחותם מעצר כזחלי L1 (פנוטיפ מעצר זחל; Lvא) ולהיות קצרים משמעותי מאשר WT. זיהוי של השלב של מעצר התפתחותי דורש תצפית מיקרוסקופית של עוברים מתים ועוצר זחלי 3-6. היא הוצגה לאחרונה כי מספר גנים, כגון רגולטור Cdc42 / Rac ו Pix-1 המפעיל ו פאק-1, לשלוט בתהליכי morphogenic במהלך שני מוקדמת ומאוחר התארכות 3,7. הראנו גם לאחרונה שתהליכים morphogenic שונים לאורך ציר אנטרו-האחורי של העוברים במהלך התארכות מוקדם 3 7. ממצאים אלה הניעו את הפיתוח של מדדי רומן מיקוד בשלבי התארכות מוקדם או מאוחר במיוחד ומדדים אחרים, המאפשרים אפיון של המורפולוגיה של עובר לאורך ציר אנטרו-האחורי שלהם במהלך ההתארכות מוקדם. שיטות חדשניות אלה מורכבות במדידת האורך של עובר בתחילה ובסוף של התארכות מוקדם וכן את הרוחב שלהם הןמודעות וזנבות. 7 שני פרוטוקולים פותחו גם למדוד את אורך הזחלים שבקעו זה עתה, מסונכרן ב L1 בשלב 7. קליפות הביצים של עובר להגן עליהם מפני טיפול תת-כלורי אלקליין בעוד זחלים, מבוגרים חיידקים נוכחיים בתקשורת התרבות, נמוגים ידי הטיפול. טיפול זה משמש אז כדי לטהר עובר מתוך אוכלוסייה הלא מסונכרן המכילה מרבית מבוגרים הניזונים גם 8. הגבלת מזון משמשת לסנכרן זחלים שבקעו זה עתה. מדידת אורך הזחלים אלה לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות פגמי התארכות. מדידה זו עדיפה על פני מדידת זחלים נעצרו על צלחות התרבית כי זחלים בוקעים מן הלא-לגמרי עוברים מוארכים יכולים להתאושש כדי &quot;אורך נורמלי&quot; כאשר האכלה אך ישמרו בגודל המוקטן שלהם כאשר נעצרו בהיעדר מזון. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים מדידה של length של מתארך עובר כמו גם את רוחב הראש שלהם וזנב באמצעות זמן לשגות דסק&quot;ש מיקרוסקופיה וניתוח תמונה (פרוטוקול 1). כמו כן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי למדוד את אורך זחלים מסונכרנים באמצעות ניתוח תמונה (פרוטוקול 2) ושפל-Cytometry (פרוטוקול 3).

<table><tbody><tr><td>אגר&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (סידן כלוריד)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא-אולדריך</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ניקוי&nbsp;</td><td>יוניון ביומטריקה</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>פישרברנד</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>מגלשות זכוכית</td><td>פישרברנד</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי בקרת פלואורסצנט גבוהים</td><td>איחוד ביומטריקה</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (אשלגן פוספט, דו-בסיסי)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (אשלגן פוספט, מונובסיסי)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<תת>4 (מגנזיום גופרתי)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (נתרן פוספט, דו-בסיסי)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (נתרן כלורי)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>מסטיק ציור Pebeo 45&nbsp; מ"ל</td><td>p&eacute; b&eacute; o</td><td>PDG033000</td><td>כל חנות אמנות/יצירה</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>איחוד חיץ נדן</td><td>ביומטריקה</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS</td><td>Biosort union Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; elegans caenorhabditis</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

ניתוח מסלולי האיתות השולטים בשינוי תהליכים מורפוגניים במהלך ההתפתחות העוברית דורש מדדים חזקים ורגישים. התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans היא שלב התפתחותי מאוחר המורכב מהתארכות העובר לאורך ציר האורך שלו. שלב התפתחותי זה נשלט על ידי תקשורת בין-תאית בין תאים תת-עוריים לשרירי דופן הגוף הבסיסיים. מנגנוני איתות אלה שולטים במורפולוגיה של תאים תת-עוריים על ידי עיצוב מחדש של השלד הציטולוגי וצומת התא-תא. מדידת קטלניות עוברית ועצירת התפתחות בשלבי הזחל, כמו גם שינוי של שלד התא ומבני הידבקות תא-תא בתאי היפודרמיס ושריר הם פנוטיפים קלאסיים ששימשו במשך יותר מ-25 שנה לניתוח מסלולי איתות אלה. מחקרים אחרונים דרשו פיתוח מדדים חדשים המכוונים באופן ספציפי להתארכות מוקדמת או מאוחרת ואפיון פגמים מורפוגניים לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים מדידה מדויקת של אורך ורוחב העוברים המתארכים כמו גם אורך הזחלים המסונכרנים. שיטות אלו מהוות כלים שימושיים לזיהוי גנים השולטים בהתארכות, כדי להעריך אם גנים אלה שולטים הן בשלבים המוקדמים והן בשלבים המאוחרים של שלב זה ונדרשים באופן שווה לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.

הראש, זנב והראש / יחס רוחב זנב הם מדדים חזקים. הפרוטוקולים המתואר כאן שימשו בהצלחה כדי לאפיין את הפונקציה של הרגולטורים ומפעילים של...

כאן אנו מפרטים פרוטוקולים שתוכננו במיוחד לניטור פגמים מורפוגניים המתרחשים בשלבים מוקדמים ומאוחרים של התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה נועדו לזהות גנים המווסתים את השלבים הללו ולאפיין את הדרישות הדיפרנציאליות שלהם לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

המטרה הכוללת של קבוצת ניסויים זו היא לזהות פגמים התפתחותיים בנמטודה Caenorhabditis elegans במהלך השלבים המוקדמים והמאוחרים של ההארכה העוברית. שיטה זו יכולה לספק מענה לשאלה מרכזית בתחום הגנטיקה ההתפתחותית. היא מאפשרת את אפיון הגנים השולטים בשלב מאוחר של ההתפתחות העוברית של Caenorhabditis elegans, המכונה הארכה עוברית.היתרון המרכזי של קבוצת טכניקות זו הוא שהן מזהות גנים השולטים בשלב מוקדם או מאוחר של ההארכה, וכן גנים השולטים בתהליכים מורפוגנטיים בחלק הקדמי או האחורי של העובר. אני אדגים את הפרוצדורה יחד עם Olivier Rocheleau-Leclair, סטודנט לשעבר במעבדה. פרוצדורה זו דורשת עדשות DIC, פריזמה ומערכת ללכידת וידאו לביצוע מיקרוסקופיית time-lapse של Z stacks.ראשית, מקמו את הדגימה המורכבת על הזכוכית לצפייה. פרטי ההכנה מופיעים בפרוטוקול הכתוב. התחילו בהגדלה נמוכה, וזהו עוברים בשלבי טרום-מורפוגנזה.לאחר מכן, הוסיפו טיפת שמן והשתמשו בעדשה חזקה יותר. כעת, זהו את הנקודות העליונות והתחתונות של העוברים לצורך ההקלטה והגדירו את פרמטרי ה-Z stack. הגדירו את ה-time-lapse כך שיתבצעו צילומים מדי שתי דקות.וודאו כי תריס האור סגור בין רכישות התמונה. הזמן הדרוש ללכידת אירוע ההתארכות המוקדם עשוי להשתנות בין שעה לשמונה שעות, בהתאם לשלב התפתחותו של העובר. כעת, הפעילו את תוכנת רכישת התמונות ושמרו את התוצאות.בשלב הבא, המשיכו בניתוח התמונות באמצעות תוכנת Fiji ImageJ. לאחר טעינת התמונות, בחרו במצב הצפייה Hyperstack. שם, כווננו את הבהירות והניגודיות על ידי הפעלת ה-Auto Mode מתוך ה-Lookup Tables.בשלב הבא, עברו לתפריט Analyze Set Measurements והגדירו את הפרמטרים. עבור כל עובר, הגדירו את סרגל ה-Z Scale כך שיתמקד בבלעפרונח (pharynx), המהווה נקודת ייחוס טובה למרכז העובר. כעת, התאימו את סרגל ה-Time Scale לתחילת שלב ההתארכות המוקדמת (early elongation) עבור עובר ספציפי.רשמו את הזמן הזה. לאחר מכן, חשבו את אורך העובר באמצעות כלי ה-Analyze Measure על ידי שרטוט קו מקצה הזנב אל הפה לאורך קו האמצע. רשמו את אורך זה.בשלב הבא, התאימו את נקודת הזמן לסוף אירוע ההתארכות המוקדם וחזרו על מדידת האורך. השתמשו בערכים אלו כדי לחשב את משך ההתארכות המוקדמת ואת העלייה באורך במהלך התארכות זו. ניתן למדוד גם את השינוי ברוחב באמצעות כלי קו ישר כדי לשרוט קו לרוחב קו האמצע של הראש.זהו מיקום מתאים למדידות עקביות. בצעו את הפעולה באופן דומה בקו האמצע של הזנב, ולאחר מכן חשבו את היחס בין הראש לזנב עבור כל נקודת זמן, והשתמשו בתוצאה זו כדי לדרג שינויים ברוחב. עבור פרוטוקול זה, יש להכין ציטומטר זרימה למעבר של חלקיקים גדולים.מכונה כזו הופכת למעשה לממיין תולעים. לפני התחלת העבודה, הפעילו את בלוק הלייזר, את המדחס, את ממיין התולעים ואת התוכנה. בתוכנה, לחצו על Start ובדקו את בקרת לייזר הארגון (Argon Laser Control).בחרו במצב Run והמתינו לחימום הלייזר עד להגעה להספק של כ-10 milliwatts, ולאחר מכן בחרו ב-Done. המתינו להתייצבות הלחץ למשך 15 דקות לפחות. כעת, הכינו את הדגימה.ראשית, טענו 10 µL של L1 מסונכרנים מסוג wild type לפיתה של שעון ואמדו את שיעור הביצים המתות תחת מיקרוסקופ. אם ההערכה גבוהה מ-20%, אין להשתמש בדגימה. העבירו כ-700 µL של L1 מסונכרנים בתמיסת M9 למבחנה של 15 mL והוסיפו propidium iodide לריכוז של 10 µg/mL.השאירו את הצבע לפעול במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כעת, הכינו את המערכת. חיוני לכוונן את קצב הזרימה באמצעות בקרי הזרימה של ה-Sheath וה-Sample ל-5.1 ו-5.51 בהתאמה.כאשר הלחצים מתייצבים, סמנו את תיבת ה-Pressure Okay. לאחר מכן, השתמשו בפקודת Acquire והקישו ידנית על הצינורית כדי להסיר בועות מהתעלה שבין כוס הדגימה לתא הניתוח. חלון הרכישה (Acquisition Window) יראה בסופו של דבר שאין בועות.דבר זה חיוני גם עבור הניסוי. כעת, הגדירו את הפרמטרים עבור מדידות הפלואורסצנציה וה-TOF. הגדירו את הסולמות עבור TOF, EXT, Green, Yellow ו-Red ל-256.לאחר מכן, הגדירו את ה-Gain כפי שצוין. לאחר מכן, הגדירו את ה-PMT Control ל-700 עבור Green ו-Yellow, ול-900 עבור Red. כעת, כיילו את המיון של התולעים.העבירו 20 milliliters של חלקיקי בקרה בעלי פלואורסצנציה גבוהה למטרות כלליות לכוס דגימה והכניסו אותה לתוך המיון. בתוכנה, בחרו ב-Run Control Particles תחת תפריט ה-Tools ולחצו על Acquire. ודאו כי מקדם השונות שהתקבל הוא 11 או יותר וכי הממוצע הוא 21 פלוס או מינוס שש.אם הדבר אינו כך, נסו לנקות את הצינוריות על ידי לחיצה על כפתור ה-Clean או על ידי ניעור של תעלת הזרימה. כעת, צאו ממצב Control Particles על ידי ביטול סימון הפקודה ב-Tools. עם סיום צביעת התולעים ב-propidium iodide למשך 30 דקות, הוסיפו 10 milliliters של M9 לתולעים הצבועות וערבבו.דגרו למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. כעת, קחו 5 milliliters מהדילול והוסיפו אותם לכוס דגימה המכילה 15 milliliters של M9. העבירו דילול זה במיין התולעים. לחצו על כפתור ה-Acquire ועקבו אחר קצב הזרימה.ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז התולעים כדי להשיג זרימה טובה, בטווח של 15 עד 25 עצמים לשנייה. לאחר השגת הריכוז המתאים של העצמים, יש להוסיף חלקיקי בקרה לבדיקה כדי להגיע לריכוז סופי של כ-0.5 עד 1x של חלקיקי בקרה בתמיסה. כעת, התאימו את פרמטר ה-Gating בתפריט ה-Gating ל-TOF לעומת Green.לאחר מכן, התאימו את פרמטרי המיון (Sorting) ל-TOF לעומת Red. פעולה זו תמיין את חלקיקי הביקורת מהבעלי החיים המתים ומהבעלי החיים החיים. כעת, הפעילו את הניסוי על ידי לחיצה על Acquire.נתחו כ-10,000 אובייקטים, אשר יתאימו לכ-8,000 בעלי חיים. לאחר מכן הפסיקו את הניסוי ולחצו על Store כדי לשמור את הנתונים כקובץ טקסט לצורך ניתוח. כדי לבסס את חוסנו של מדד רוחב הראש, בוצעה המדידה באופן עצמאי חמש פעמים ב-12 עוברים מסוג wild type בשלב 1.2 fold.לא נמצאו שוניים בנתונים בעקבות יישום מבחן Brown-Forsythe. השחזוריות והשפעות הסדרות (batch effects) הקשורות למדידת רוחב הראש נבחנו באמצעות דימות 4D DIC בשלושה ימים שונים. לא נמצאו שוניים או השפעות סדרות בין שלוש קבוצות מדידה אלו.שני הפרוטוקולים המתוארים שימשו להערכת אורכן של זחלים שעצרו את התפתחותם ברקע של סוג בר ומוטנטים. ניתוח תמונות סיפק מדידות מוחלטות של האורך במיקרומטרים. בניסוי זה, המוטנטים היו קטנים יותר מאשר סוגי הבר.מדידת האורך באמצעות ציטומטריית זרימה הניבה תוצאות דומות. עם זאת, מדידות אלו היו עמידות (robust) הרבה יותר. לפיכך, שיטה זו אמורה להבהיר השפעות עדינות יותר באוכלוסיות מוטנטים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על קצב זרימה קבוע לאורך הניסוי כדי להבטיח השוואה הוגנת בין הזנים המנותחים. לאחר השליטה בטכניקה, מדידת אורך הזחלים באמצעות ציטומטריה של זרימה מאפשרת את אפיון של 18 עד 24 תנאים או זני מוטציה ליום, גם בהתחשב בכיול הראשוני של הציוד. בעקבות פרוצדורה זו, אנו יכולים לחקור את המורפולוגיה של תאי ההיפודרמה.כדי לעשות זאת, ניתן להשתמש בסמן פלואורסצנטי ובמיקרוסקופיה קונפוקאלית כדי לאפיין את התפקוד המולקולרי של הגנים שזוהו. זכרו ש-propidium iodide עלול להיות מסוכן ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ומשקפי מגן בעת ביצוע הליך זה.

novel-metrics-to-characterize-embryonic-elongation-nematode

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

פתחנו מערכת מיקרוסקופ מעקב וידאו שיעור שיכול להקליט...

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת תנועה רדיאלית כדי להעריך תפקוד לקוי של מוטוריקה ב-C. elegans המבטא חלבון TDP-43 אנושי מסוג פרא או מוטנטי ALS. תולעים עם רמות שונות של ביטוי TDP-43 מסוג בר או מוטנטי מורשות לזחול, ותנועתן נמדדת על ידי המרחק הרדיאלי שעובר מהנקודה המרכזית על לוחית הבדיקה. הבדיקה מבחינה בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים על סמך המרחק שעברו הזנים השונים C. elegans.

הערכת ליקוי מוטורי במודלים של C. elegans באמצעות בדיקת תנועה רדיאלית

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

זרע חייב לנווט בהצלחה דרך צינור ההטלה כדי להפרות oocyte. כאן אנו מתארים את הבקשה למדידת העברת זרע  בתוך הרחם הדו. הדבר יכול לספק נתונים כמותיים על חלוקת זרע בתוך הרחם לאחר ההזדווגות, כמו גם על מהירות, מהירות כיוונית ותדר היפוך.

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

כאן, אנו מציגים שיטה כללית לקביעת הכדאיות העוברית והמספר הכולל של עוברים המיוצרים (brood) באמצעות אורגניזם המודל C. elegans.

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

למד איך לאפיין פגמים מורפוגניים בהתארכות עוברית של נמטודות Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרוסקופיה מתקדמת. שיטה זו מאפשרת לזהות גנים המווסתים שלבים מוקדמים ומאוחרים של ההתארכות.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות

גלה סרטונים נוספים