מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

המטרה הכוללת של שבב מתח שיפוע זה היא לספק גישה פשוטה ליצירת זנים סטטיים בשיפוע לא רציף על הידרוג'ל תלת מימדי לחקירת התנהגויות תאים בסדרה של תנאי מתח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-הנדסה כגון גירויים של התמיינות תאי גזע וויסות יישור תאים להתפתחות איברי רקמה מלאכותית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם זנים שונים על שכבת התא והידרוג'לים באותה סביבת מיקרו להשוואה של התנהגות התא.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכנת השבב מכיוון שהאור צריך להסתיים תוך שלוש עד ארבע שעות לבסיס הניסוי כדי להבטיח שונות תאים גבוהה. שוקלים 10 גרם אבקת ג'לטין ומוסיפים אותה לבקבוק זכוכית עם 100 מיליליטר של מי מלח פוספט של Dulbecco, או DPBS. הכניסו מוט ערבוב מגנטי לבקבוק והניחו את הבקבוק על צלחת חמה מערבבת.

מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי מים. הגדר את טמפרטורת הפלטה החמה ל 50 עד 60 מעלות ואת המערבל על 100 סל"ד למשך שעה כדי להמיס את אבקת הג'לטין. לאחר שהג'לטין נמס, מוסיפים שמונה מיליליטר של אנהידריד מתאקרילי לאט מאוד בעזרת פיפטה.

תן לו להגיב ב-60 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן הוסף DPBS מחומם מראש לבקבוק לנפח סופי של 500 מיליליטר. הניחו לתמיסה להתערבב היטב למשך 15 דקות כדי לעצור את התגובה.

בינתיים חתכו קרום דיאליזה לכמה צינורות באורך 25 מילימטר. טבלו אותם במים נטולי יונים למשך 15 דקות. וצרו קשר כדי לסגור קצה אחד של צינורות הדיאליזה.

טען את הכמות המתאימה של תמיסת הפולימר לתוך צינורות הדיאליזה וסגור את הקצה השני. לאחר מכן הניחו את הצינורות המלאים בכוס פלסטיק של חמישה ליטר עם מים נטולי יונים למשך שבוע. לחדש את המים נטולי היונים פעמיים ביום ולשמור על התמיסה בטמפרטורה של 40 עד 50 מעלות צלזיוס במהלך תהליך הדיאליזה.

לאחר הדיאליזה יש לאסוף את התמיסה מהצינורות לבקבוק זכוכית של 500 מיליליטר. שופכים כ -450 עד 500 מיליליטר תמיסה לכוס פילטר של 500 מיליליטר. והחל ואקום כדי לאלץ את התמיסה לעבור דרך קרום המסנן לעיקור.

לאחר מכן העבירו את הפולימר המעוקר למספר צינורות מעוקרים של 50 מיליליטר. מעבירים את הפולימר המעוקר למספר צינורות מעוקרים של 50 מיליליטר ומאחסנים אותם במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים. יש לייבש בהקפאה את הפולימר מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שבוע באמצעות מייבש הקפאה ליצירת GelMA אשר ניתן לאחסן במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.

לייצור שבבים הכינו תחילה את הפולימתאקרילט או PMMA, מנוגנים ומעוצבים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הכן את מכסה ה-PTMS ואת תקע ה-PTMS על ידי ערבוב נכון של 30 גרם אלסטומר PTMS ושלושה גרם של חומר ריפוי PTMS. הסר את התערובת מתחת לתא ואקום למשך שעה.

יצקו 1.8 עד שני גרם מהתערובת לתבנית PMMA לכיסוי ה-PTMS. השתמש גם בכמות המתאימה למילוי כל חלל עבור תבנית PMMA עבור תקע ה-PTMS. בנוסף, יצקו 10 גרם של תערובת PTMS לא נרפאה בצלחת פלסטיק ריקה של 10 סנטימטרים.

הכניסו את התבניות הללו לתא ואקום להסרת גז למשך 30 דקות. רפאו את ה-PTMS במשך שעתיים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. לאחר קירור ה-PTMS הנרפא על התבנית, נתק את כיסויי ה-PTMS ואת תקעי ה-PTMS מתבניות ה-PMMA.

לאחר מכן, אגרוף שני חורים בקוטר של כשלושה מילימטרים בקצות תעלות הזרימה של כיסויי ה- PTMS. חותכים את יריעת ה- PTMS המעוצבת מצלחת הפלסטיק של 10 סנטימטר לקוביות רבות של סנטימטר על סנטימטר אחד. ולנקב חור של שלושה מילימטר בכל קוביית PTMS.

הדביקו שתי קוביות PTMS לא מעובדות סנטימטר על סנטימטר אחד על פתחי מכסה ה-PTMS כדי לשמש כמאגרים בינוניים ולסייע בתהליך הריפוי של דפוסי ההידרוג'ל המעגליים של השיפוע. לאחר מכן יש לרפא במשך שעה בחום של 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חבר את כיסויי ה-PTMS עם שני מאגרי ה-PTMS על שקופית מצופה TMSPMA.

לשם כך, טפל מראש בצד ההדבקה של מכסה ה-PTMS ובהחלקה המצופה TMSPMA מתחת למכונת פלזמת חמצן למשך 90 שניות של טיפול בפלזמת חמצן. צור קשר עם המשטח המטופל בפלזמה של כיסויי ה-PTMS ושקופית ה-TMSPMA ולחץ עליהם בחוזקה להדבקה קבועה באמצעות היווצרות קשר סיליקון חמצן סיליקון. הדפס מסיכת צילום על-ידי הדפסת הפריסה שנקבעה על סרט צילום שקוף.

לאחר מכן חותכים את מסכת הצילום המודפסת לגודל של 25 מילימטרים על 37.5 מילימטרים. שקלו 25 מיליגרם של GelMA מיובש בהקפאה לתוך 0.3 מיליליטר של מדיום תרבית תאים שחומם מראש בצינור מיקרו-צנטריפוגה שחור של 1.5 מיליליטר. הנח את צינור המיקרו-צנטריפוגה על פלטה חמה של מערבל מעבדה עד שה-GelMA מתמוסס במדיום.

הוסף 50 מיליגרם של פוטו-יוזם למיליליטר אחד של DPBS בצינור מיקרו-צנטריפוגה. והכניסו אותו לתנור של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות או עד שהפוטו-יוזם נמס. הוסף 25 מיקרוליטר של הפוטו-יוזם 10% לצינור המיקרו-צנטריפוגה.

פיפטה מספר פעמים לערבב היטב. לאחר מכן, ספרו שלושה מיליון תאי NIH3T3 באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר צנטריפוגה של התרחיף ב-200 גרם למשך חמש דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-175 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים.

הוסף את תמיסת התא לצינור המיקרו-צנטריפוגה כדי לקבל תמיסת תא קדם-פולימר של 5% GelMA, 0.5% פוטו-יוזם וכשישה מיליון תאי 3T3 למיליליטר. לאחר הערבוב טען 100 מיקרוליטר של פרה-פולימר תאים למיקרו-מזרק של 100 מיקרוליטר. יישר ידנית חלק ממסכת הפוטו-סיכה על השקופית התחתונה של שבב המתח המעוקר של מעבר הצבע.

ופשוט תקן את המיקום באמצעות טיפה קטנה של מים נטולי יונים בין לבין. חבר את המיקרו-מזרק בנפח 100 מיקרוליטר, עמוס בתמיסת תא פרה-פולימר לכניסת השבב. לאחר מכן הנח 50 מיקרוליטר של תמיסת תאים פרה-פולימריים בתעלת הזרימה באמצעות המיקרו-מזרק וחבר את השקע באמצעות תקע PTMS.

הזרקו 40 מיקרוליטר נוספים של תמיסה ליצירת בליטה קמורה בקרום ה-PTMS העגול. העבר את השבב עם מסכת הצילום, המיקרו-מזרק ותקע ה-PTMS מתחת למנורת UV. וחשוף אותו למשך 30 עד 45 שניות כדי להצליב את ההידרוג'ל המעגלי הקונצנטרי בתא הנוזל.

לאחר קישור צולב הסר את תקע ה-PTMS ואת המיקרו-מזרק כדי לשחרר את לחץ הנוזל. השתמש במזרק של מיליליטר אחד עמוס ב-DPBS מחומם מראש כדי לשטוף שרפים לא מקושרים שלוש פעמים על ידי שטיפה מהכניסה לשקע. לאחר מכן, מלאו את תעלת הזרימה בכ-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים.

מניחים את הצ'יפס בצלחת תרבית מעוקרת ותרבית באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע. רענן את המדיום כל יום. צלם תמונות של שלושה שבבים ביום האפס לאחר ארבע שעות דגירה כקבוצת הביקורת.

ושלושה שבבים ביום השלישי כאשר ערכת הניסוי משתמשת במיקרוסקופ עם מטרה פי 20. מדוד את רוחב הקו של כל הידרוג'ל מקו אחד עד שורה 12 באמצעות תוכנה לחישוב כתמי הדחיסה. מוצגות כאן תוצאות מייצגות של דפוסי הידרוג'ל עם אפס מיקרוליטר ו-40 מיקרוליטר בהזרקה, לאחר קישור צולב UV וארבע שעות דגירה.

רוחב הקו של ההידרוג'ל התלת-ממדי בבקרת הזרקת היתר נראה אחיד כצפוי. עם זאת, דפוסי ההידרוג'ל עם הזרקה של 40 מיקרוליטר נותנים רוחב קו שיפוע של הידרוג'ל היורד מקו אחד לקו 12. לאחר שלושה ימים של דגירה, התאים בהידרוג'ל משתרעים לכיוונים שונים.

התאים בשורה אחת מתיישרים לאורך הכיוון הרדיאלי עקב גירוי התארכות ההידרוג'ל. להיפך, התאים בשורה 12 מתיישרים לאורך צורת ההידרוג'ל שבה רמז הגיאומטריה שולט ביישור התאי. אין יישור תאים ספציפי בשורה 7 שבו שני רמזי היישור התאיים של קו 1 ושורה 12 מאזנים זה את זה.

לאחר מדידת סביבת המיקרו של זני שיפוע על הידרוג'ל תלת מימדי יכולה להיעשות על ידי שבב מתח השיפוע תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקר את שבב מתח השיפוע לפני טעינת תמיסת הקדם-פולימר של התא. כמו כן, נגב היטב את פני השבב עם 75% אתנול לפני הכנסת השבבים לחממת תרבית התאים.

לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה מאוד כיצד ליצור שבב מתח שיפוע כדי לחקור התנהגויות תאים תחת זנים שונים אימפריאליים.