Name: מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: למדו כיצד לייצר שבב מעבר צבע למתח סטטי בהידרוגל תלת-ממדי עמוס בתאים לחקירת התנהגויות תאיות ויישור תאים בהנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי בוגר סטודנט מחקר בחו ל התוכנית (NSC-101-2917-I-007-010); התוכנית הנדסה ביו-רפואית (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); ואת התוכנית ננוטכנולוגיה הלאומי (NSC-101-2120-M-007-001-), המועצה הלאומית למדע של R.O.C., טייוואן. המחברים רוצה להודות פרופסור עלי Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya פול, וליאו Ronglih בבית הספר לרפואה בהרווארד לשיתוף הטכנולוגיה כימוס הידרוג ותא.

1. סינתזת GelMA
<ol>
	<li>שקלו 10 גרם אבקת ג'לטין והוסיפו אותה לבקבוק זכוכית עם 100 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) של Dulbecco. הכניסו מוט ערבוב מגנטי לבקבוק והניחו את הבקבוק על צלחת חמה מערבבת.</li>
	<li>מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי מים. הגדר את טמפרטורת הפלטה החמה ל-50-60 מעלות צלזיוס ואת המערבל על 100 סל"ד למשך שעה כדי להמיס היטב את אבקת הג'לטין.</li>
	<li>לאחר שהג'לטין נמס, הוסיפו 8 מ"ל של אנהידריד מתאקרילי לאט מאוד (טיפה אחת לשנייה) בעזרת פיפטה. תן לו להגיב ב-60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.</li>
	<li>הוסף DPBS מחומם מראש (40 מעלות צלזיוס) לבקבוק לנפח סופי של 500 מ"ל ואפשר לתערובת זו היטב למשך 15 דקות כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>בינתיים, חותכים קרום דיאליזה (משקל מולקולרי חתוך של 14 kDa) למספר צינורות באורך 25 ס"מ. טבלו אותם במים נטולי יונים (DI) למשך 15 דקות וצרו קשר לסגירת קצה אחד של צינורות הדיאליזה.</li>
	<li>טען את הכמות המתאימה (30 - 60 מ"ל) של תמיסת הפולימר לצינורות הדיאליזה וסגור את הקצה השני. מניחים אותם בכוס פלסטיק 5 ליטר עם מי DI למשך שבוע. יש לחדש את מי ה-DI פעמיים ביום ולשמור על התמיסה בטמפרטורה של 40-50 מעלות צלזיוס במהלך תהליך הדיאליזה.</li>
	<li>אוספים את התמיסה מהצינור בבקבוק זכוכית של 500 מ"ל. יוצקים ~450 - 500 מ"ל תמיסה בכוס סינון של 500 מ"ל (גודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר) ומורחים ואקום על המסנן כדי לאלץ את התמיסה לעבור דרך קרום המסנן לעיקור.</li>
	<li>מעבירים את הפולימר המעוקר למספר צינורות מעוקרים של 50 מ"ל ומאחסנים אותם במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 3-5 ימים.</li>
	<li>יש לייבש בהקפאה את הפולימר -80 מעלות צלזיוס למשך שבוע באמצעות מייבש הקפאה ליצירת GelMA. אחסן את ה-GelMA במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>
2. שינוי 3-(Trimethoxysilyl)פרופיל מתאקרילט (TMSPMA)
<ol>
	<li> חותכים שקופיות זכוכית מסחריות לשתי חתיכות קטנות (25 מ"מ על 37.5 מ"מ) וטובלים אותן בתמיסת NaOH של 0.5 M למשך 4 שעות.</li>
	<li>הנח את השקופית על מתלה בתוך מיכל זכוכית עם 95% אתנול ונקה באמצעות אולטרסאונד ב-43 קילו-הרץ למשך 15 דקות.</li>
	<li>טבלו את מגלשות הזכוכית ב-5% TMSPMA ב-99.5% אתנול למשך שעה אחת.</li>
	<li>שטפו את השקופיות ב-95% אתנול, יבשו את השקופיות באוויר וחישטו את ציפוי ה-TMSPMA בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.</li>
</ol>
3. ייצור שבבים
<ol>
	<li>קח צלחת פולימתיל-מתאקרילט (PMMA) אחת בעובי 2 מ"מ ו-0.3 מ"מ, החל סרט דו צדדי על צד אחד של משטח ה-PMMA ושחרר את התוחם בצד אחד. השאירו שתי צלחות PMMA בעובי 2 מ"מ וצלחת אחת בעובי 1 מ"מ ללא סרט דו צדדי.</li>
	<li>חתוך בלייזר לוחית PMMA בעובי 2 מ"מ ללא סרט דו צדדי ל-42 מ"מ על 30 מ"מ כדי ליצור את הצלחת התחתונה. חותכים לוחית PMMA בעובי 2 מ"מ עם סרט דו צדדי כדי ליצור את מסגרת הגבול, עם מידות חיצוניות של 42 מ"מ x 30 מ"מ ומידות פנימיות של 37.5 מ"מ x 25 מ"מ.</li>
	<li>חתכו בלייזר את לוחית ה-PMMA בעובי 0.3 מ"מ עם סרט דו-צדדי לתוך עיגול מרכזי של 12 מ"מ עם שתי תעלות זרימה ברוחב 2 מ"מ ואורך 8 מ"מ בצדדים מנוגדים של המעגל (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1a).</li>
	<li>כדי להכין את תבנית ה-PMMA ליציקת מכסה ה-PDMS, הרכיבו את שלושת החלקים של רכיבי PMMA משלבים 3.2-3.3 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1b) באמצעות סרט דו צדדי.</li>
	<li>חתוך בלייזר לוח PMMA בעובי 2 מ"מ עם סרט דו צדדי לחתיכה בגודל 5 ס"מ x 5 ס"מ עם מערך של 3 x 3 של מלבנים חלולים בגודל 8.5 מ"מ x 8.5 מ"מ. חותכים חתיכה נוספת בגודל 5 ס"מ על 5 ס"מ עם מערך של 3X3 של עיגולים חלולים בגודל 4 מ"מ. חתוך בלייזר צלחת PMMA בעובי 1 מ"מ ללא סרט דו צדדי לתוך צלחת תחתונה PMMA בגודל 5 ס"מ על 5 ס"מ.</li>
	<li>הכן את תבנית ה-PMMA ליציקת תקע ה-PDMS על ידי הרכבת שלושת החלקים של רכיבי PMMA משלב 3.5 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1c) באמצעות סרט דו צדדי.</li>
	<li>הכן את מכסה ה-PDMS ואת תקע ה-PDMS על ידי ערבוב נכון של 30 גרם אלסטומר PDMS ו-3 גרם של חומר ריפוי PDMS; הסר את התערובת מתחת לתא ואקום למשך שעה.</li>
	<li>יצוק 1.8-2.0 גרם מהתערובת לתבנית PMMA לכיסוי ה-PDMS והשתמש בכמות המתאימה למילוי כל חלל בתבנית PMMA עבור תקע ה-PDMS. יצקו 10 גרם תערובת PDMS לא נרפאה בצלחת פלסטיק ריקה בגודל 10 ס"מ. הכניסו את התבניות הללו לתא ואקום להסרת גז למשך 30 דקות.</li>
	<li>רפאו את ה-PDMS למשך שעתיים ב-80 מעלות צלזיוס. לאחר קירור ה-PDMS הנרפא על התבנית, נתק את כיסויי ה-PDMS ואת תקעי ה-PDMS מתבניות ה-PMMA.</li>
	<li>אגרוף שני חורים בקוטר של כ -3 מ"מ בקצות תעלות הזרימה של כיסויי ה- PDMS.</li>
	<li>חותכים את יריעת ה-PDMS המעוצבת מלוח הפלסטיק בגודל 10 ס"מ לקוביות רבות בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ ומחוררים חור של 3 מ"מ בכל קוביית PDMS. הדביקו שתי קוביות PDMS לא מעובדות בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ על פתחי מכסה ה-PDMS (כדי לשמש כמאגרים בינוניים ולסייע בתהליך הריפוי של דפוסי ההידרוג'ל המעגליים של השיפוע) ולרפא למשך שעה אחת ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חבר את כיסויי ה-PDMS עם שני מאגרי ה-PDMS על שקופית מצופה TMSPMA על ידי טיפול מקדים בצד ההדבקה של מכסה ה-PDMS והמגלשה המצופה TMSPMA תחת מכונת פלזמת חמצן (הספק RF של 30 W (מצב גבוה) ואוויר דחוס של 600 mTorr) או מחולל קורונה אלקטרוני בתדר גבוה (115 V, 50/60 Hz, 0.35 A) למשך 90 שניות של טיפול בפלזמה O2.</li>
	<li>צור קשר עם המשטח המטופל בפלזמה של כיסויי ה-PDMS ושקופית TMSPMA ולחץ עליהם בחוזקה לקישור קבוע באמצעות היווצרות קשר Si-O-Si. 
	הערה: הכנסת השבב לתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה יכולה לשפר עוד יותר את חוזק ההדבקה.</li>
	<li>לאחר הקירור טובלים את הצ'יפס באתנול 95% למשך 15 דקות ומייבשים באוויר. לאחר מכן, עקרו את השבבים תחת קרינת UV למשך שעה אחת ואחסנו אותם בקופסה עטופה בנייר אלומיניום במכסה המנוע הלמינר.</li>
</ol>
4. מתח שיפוע סטטי על ההידרוג'ל עמוס התאים
<ol>
	<li>הדפס וחתוך פיסת מסכת צילום בגודל 25 מ"מ על 37.5 מ"מ, על ידי הדפסת הפריסה באיור 2b על סרט שקוף. התאם את הגודל המודפס של איור 2b כך שיתאים לממד ב-איור 2a.</li>
	<li>הכן 100 מ"ל של מדיום DMEM עם 10% FBS, 1% Pen-Strep ו-250 מ"ל DPBS באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס לשימוש כמדיום תרבית התאים.</li>
	<li>שקלו 25 מ"ג של GelMA מיובש בהקפאה לתוך 0.3 מ"ל של מדיום תרבית תאים שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) בצינור מיקרו-צנטריפוגה שחור של 1.5 מ"ל. שים את צינור המיקרו-צנטריפוגה על מערבל/פלטה חמה במעבדה עד שה-GelMA מתמוסס במדיום.</li>
	<li>שקלו 50 מ"ג של פוטו-יוזם לתוך 1 מ"ל DPBS בצינור מיקרו-צנטריפוגה והכניסו אותו לתנור של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות או עד שהפוטו-יוזם נמס.</li>
	<li>קח 25 מיקרוליטר של 10% פוטו-יוזם משלב 4.4 והוסף אותו לצינור המיקרו-צנטריפוגה משלב 4.3. פיפטה מספר פעמים לערבב היטב.</li>
	<li>ספור 3 x 106 תאי NIH 3T3 באמצעות מונה תאים אוטומטי. צנטריפוגה את התרחיף ב-200 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את התאים ב-175 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים.</li>
	<li>הוסף את תמיסת התא משלב 4.6 לצינור המיקרו-צנטריפוגה משלב 4.5 כדי לקבל תמיסת תא פרה-פולימר של 5% GelMA, 0.5% פוטו-יוזם ו~6 x 106 3T3 תאים/מ"ל. לאחר הערבוב, טען 100 מיקרוליטר של קדם-פולימר תאים במזרק מיקרו של 100 מיקרוליטר.</li>
	<li>יישר ידנית (ראה איור 3a) חתיכה ממסכת הפוטו על השקופית התחתונה של שבב המתח השיפוע המעוקר ופשוט תקן את המיקום באמצעות טיפה קטנה של מי DI ביניהם. חבר את המיקרו-מזרק של 100 מיקרוליטר עמוס בתמיסת תאים פרה-פולימריים לכניסת השבב.</li>
	<li>הנח (ראה <מחלקה חזקה="xfig">איור 3b) 50 מיקרוליטר של תמיסת תא פרה-פולימר בתעלת הזרימה באמצעות המיקרו-מזרק ולאחר מכן חבר את השקע באמצעות תקע PDMS. הזרקו 40 מיקרוליטר נוספים של תמיסה ליצירת בליטה קמורה בקרום ה-PDMS המעגלי.</li>
	<li>הזז את השבב עם מסכת הפוטו (התחתונה), המיקרו-מזרק (כניסה) ותקע ה-PDMS (יציאה) משלב 4.9 מתחת למנורת UV (365 ננומטר, 9 mW/cm2) וחשוף אותו למשך 30 - 45 שניות כדי להצליב את ההידרוג'ל המעגלי הקונצנטרי בתא הנוזל.</li>
	<li>הסר את תקע ה-PDMS ואת המיקרו-מזרק כדי לשחרר את לחץ הנוזל (ראה <מחלקה חזקה="xfig">איור 3c). השתמש במזרק של 1 מ"ל עמוס ב-DPBS מחומם מראש כדי לשטוף שרפים לא מקושרים 3 פעמים על ידי שטיפה מהכניסה לשקע.</li>
	<li>מלאו את תעלת הזרימה בכ-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים.</li>
	<li>מניחים את הצ'יפס בצלחת תרבית מעוקרת ותרבית באווירה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע. רענן את המדיום כל יום.</li>
	<li>צלם תמונות של שלושה שבבים ביום 0 לאחר 4 שעות של דגירה, כקבוצת ביקורת, ושלושה שבבים ביום השלישי, כערכת הניסוי, באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה של פי 20. מדוד את רוחב הקו של כל הידרוג'ל מקו 1 לקו 12 באמצעות תוכנה (למשל, ImageJ) כדי לחשב את זני הדחיסה ( איור 4). 
	הערה: אחוז ההתארכות מחושב על-ידי חלוקת הערך של הפרש רוחב הקו בין 40 μL ל-0 μL ברוחב הקו ב-40 μL.</li>
</ol>
5. צביעת תאים לניתוח יישור
<ol>
	<li>השתמש במזרק כדי להזריק 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-DPBS ב-RT לשבב הזרימה למשך 15 דקות לקיבוע ההידרוג'ל העמוס בתאים. 
	הערה: זהירות. PFA רעיל ויש לטפל בו בזהירות.</li>
	<li>החלף את התמיסה בתמיסה המחלחלת לקרום התא של 0.5% ב-DPBS למשך 10 דקות כדי לחלחל את קרום התא ב-RT.</li>
	<li>PBS שוטף את הדגימות 3 פעמים במרווח של 5 עד 10 דקות בין שטיפות (באמצעות מזרק טעון, כמו בשלב 5.1).</li>
	<li>טען תמיסת BSA של 1% לתוך תעלת הנוזל למשך 45-60 דקות ב-RT (באמצעות מזרק טעון דרך יציאת הכניסה).</li>
	<li>הוסף 1.5 מ"ל מתנול לבקבוקון עם Alexa Fluor 488 phalloidin כדי להניב ריכוז סופי של תמיסת מלאי של 6.6 מיקרומטר.</li>
	<li>קח 5 מיקרוליטר של Alexa Fluor 488 phalloidin משלב 5.5 ודלל אותו ב-200 מיקרוליטר של DPBS עם 0.1% BSA ליצירת ריכוז סופי של 0.165 מיקרומטר Alexa Fluor 488 phalloidin.</li>
	<li>הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת התערובת לתעלה הנוזלית באמצעות מיקרופיפטה ודגר את השבב ב-37 מעלות צלזיוס למשך 45 - 60 דקות לצביעה של אקטין. PBS שוטף (כנ"ל) את הדגימות 3 פעמים.</li>
	<li>הכן 1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI ב-PBS, הזרם אותו דרך השבב וצבוע גרעיני תאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה DPBS לתוך התעלה הנוזלית כדי לשטוף את תמיסת הצביעה ולמלא מחדש את תא הנוזל בתמיסת PBS כדי לצלם תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>צלם את התמונות הפלואורסצנטיות של תאי 3T3 בהידרוג'לים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 40 עם גלאי CCD וערכות סינון של ex/em ב-488/520 ננומטר ו-358/461 ננומטר עבור Alexa Fluor 488 phalloidin (אקטין) ו-DAPI (גרעין), בהתאמה.</li>
</ol>

<ol><li>Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystems+for+biomimetic+stimulation+of+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells.</a> Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).</li>
<li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulation+of+the+cardiac+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+tissue+constructs+that+mimic+myocardium+structure+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics.</a> Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).</li>
<li>Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes+in+a+compliant+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system.</a> Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+effects+of+mechanical+strain+on+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).</li>
<li>Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+strain+stimulates+fibroblastic+phenotype+shift+in+smooth+muscle+cells+in+an+engineered+tissue+model+of+the+aortic+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall.</a> Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).</li>
<li>Ramon-Azcon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacrylate+as+a+promising+hydrogel+for+3D+microscale+organization+and+proliferation+of+dielectrophoretically+patterned+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells.</a> Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).</li>
<li>Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-Based+Comparison+of+the+Osteogenesis+of+Human+Bone+Marrow-+and+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+under+Mechanical+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation.</a> PLoS One. 7 (9), e46689(2012).</li>
<li>Gould, R. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22281945">Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture.</a> Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17060641">Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells.</a> Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).</li>
<li>Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li>
<li>Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-Induced+Alignment+in+Collagen+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strain-Induced Alignment in Collagen Gels.</a> PLoS One. 4 (6), e5902(2009).</li>
<li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li>
<li>Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/4/2/1084">Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery.</a> Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li>
<li>Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+Counts%3A+Microenvironmental+Regulation+of+Stem+Cells+by+Biophysical+and+Material.+Cues%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).</li>
<li>Segers, V. F., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+therapy+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell therapy for cardiac disease.</a> Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).</li>
<li>Hsieh, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+static-strain+stimulation+in+a+microfluidic+chip+for+3D+cellular+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment.</a> Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בנייר זה, מדווחים על גישה פשוטה כדי להשוות בהתנהגות התא יישור לאחר הידרוג הצורה והכוונה מתיחה מתיחה. קרום PDMS גמיש יוצר של עקמומיות בצורת כיפה ליצירת בגבהים שונים של hydrogels מעגלית קונצנטריים. לאחר שחרור הלחץ, קרום PDMS כוח מחיל באופן אוטומטי על hydrogels בדוגמת מיקרו ליצירת מעבר צבע למתח/התארכות, עם מקסימום במרכז, מינימום על הגבול החיצוני. היווצרות של המתח הדרגתי הוא תוכנן על ידי קרום PDMS גמיש והטיפול השבב fluidic, ישנם מספר פרמטרים חשובים, זה צריך להיות נוכחת כדי: (i) שליטה מדויקת על העובי של PDMS קרום הוא חיוני כד...

הגשה כחומר בלוק המחקה יליד microenvironment, הידרוג המכיל מטריצה חוץ-תאית (ECM) מחדש לבנות ביונים פיגומים רקמות כדי לתמוך צמיחת תאים. להחזיק את הפונקציות של רקמה, יישור תא מאורגנת היא מהדרישות. שונים 2D (קרי, תאים תרבותי על משטח), 3D (קרי, תאים במארז של הידרוג) יישורי הושגו על ידי culturing או לבצע התאים או על מצעים גמיש עם מיקרו- או ננו-דפוסי1. תא 3D היישור המיקרו-ארכיטקטורה הוא אטרקטיבי יותר, כמו microenvironment קרובה יותר רקמה מקורית לבנות2,3,4. גישה נפוצה אחת עבור יישור תא 3D הוא הסימן גיאומטרי של הידרוג-צורה-2,-3. בשל השטח מוגבל עבור התפשטות תאים כיוון קצר-ציר, תאים במטרה ליישר לאורך לכיוון ציר זמן ב- הידרוג בדוגמת מיקרו. גישה אחרת היא להחיל מתיחה מתיחה hydrogels כדי להשיג יישור תא במקביל כיוון מתיחה4,5.
גירוי ביופיזיקלי על hydrogels ECM, כגון זן compressive או שדה חשמלי, יכולים לווסת פונקציות תא השילוב הרקמה הנכונה, התפשטות של בידול1,2,3. מחקר רב נעשה על מנת לחקור התנהגות הסלולר על-ידי החלת תנאי זן אחד בכל פעם באמצעות מספר בקרה מכנית יחידות4,6,7,8,9. לדוגמה, השימוש מכני שלב מוטורס סחוט או שרוע על הידרוג קולגן אנקפסולציה תא תלת-ממד הייתה נפוצה לגשת7,10. עם זאת, ציוד שליטה כזה דורש שטח נוסף ופונה הנושא של מזהמים החממה7,9,11,12. בנוסף, המכשיר גדול לא יכול לתת סביבה שליטה מדויקת כדי לספק הפארמצבטית גבוהה13.
בהתחשב בכך כי עמוסי תא hydrogels בדרך כלל המועסקים על המיקרו-סולם ביו יישומים, זה יתרון לשילוב MEMS טכניקות כדי ליצור מגוון של זן/מתיחה גירוי לחקור בו זמנית תא התנהגויות ביונים 3D בונה במבחנה2,14,15,16,17,18. לדוגמה, באמצעות גז בלחץ כדי לעוות את הקרום PDMS צ ' יפס microfluidic יכולים להצמיח זנים שונים, נהיגה תאית התמיינות שושלות שונות9,16. עם זאת, ישנם אתגרים טכניים רבים, כגון תהליכי ייצור השבב מסובך חדר נקי ושילוב בקרת התוכנה של מנועים, משאבות, שסתומים, גזים דחוסים.
בעבודה זאת, נדגים בגישה פשוטה להשיג שבב microfluidic סטטי-זן הדרגתיות מתוספי על ידי העסקת דפוס הידרוג מעגלית קונצנטריים ו קרום PDMS גמיש. שלא כמו רוב הגישות הקיימות, הפלטפורמה שלנו הוא התקן נייד, חד פעמית מיניאטורי זה יכול להיות מפוברק מחוץ חדר צהוב, זה הנו עצמי יצירת זנים מעבר צבע על קונצנטריים אנקפסולציה תא hydrogels, ללא ציוד מכני חיצוניים במהלך הדגירה. 3T3 פיברובלסט תא התנהגויות השפיעו על ידי שילוב של הידרוג צורה, מגוון רחב של הדרכה מתיחה מתיחה רמזים היו הפגינו במהלך הצפיה תא היישור בתוך סביבות תלת-ממד ECM-מימטי בשבב מעבר צבע למתח במשך 3 ימים.

<table><tbody><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה שחור 1.5 מ"ל</td><td>ארגוס טכנולוגיות&nbsp;</td><td>03-391-161</td><td>ניתן להחליף את זה בצבע ניטרלי של צינור 1.5 מ"ל מכוסה בנייר אלומינון</td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56064C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 phalloidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>בדיקה מולקולרית</td><td>C1430</td><td>לתיוג תאים ברי קיימא</td></tr><tr><td>CCD</td><td>PCO. הדמיה</td><td>Pixelfly qe</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה מחלחלת קרום התא</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>0.5% Triton X-100 לחדירת קרום התא</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>מכתים את גרעין התא</td></tr><tr><td>קרום דיאליזה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>חיתוך משקל מולקולרי = 14,000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>סרט צד כפול</td><td>3M</td><td>8003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G2500</td><td>חוזק ג'ל 300, סוג A, מעור חזיר</td></tr><tr><td>מחולל קורונה אלקטרוני בתדר גבוה</td><td>מוצרים אלקטרוטכניים</td><td>דגם BD-20</td><td></td></tr><tr><td>מתאקריליק אנהידריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>276685</td><td></td></tr><tr><td>מזרק מיקרו</td><td>המילטון</td><td>80501</td><td>50 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>IX71</td><td>כולל שתי ערכות מסננים: LF405 / LP-B-000 ו- LF488 / LP-C-000 ממכונת</td></tr><tr><td>הפלזמה</td> של Semrock <td>Oxygen האריק פלזמה</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>לתיקון תא</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>DOW CORNING</td><td>Sylgard 184</td><td>תערובת לייצור יציקת שבב PDMS</td></tr><tr><td>עט-סטרפטוק</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>Photoinitiator</td><td>CIBA</td><td>Irgacure 2959</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>לתיוג תאים מתים</td></tr><tr><td>סינון סטרילית</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TMSPMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>לקיבוע הידרוג'ל</td></tr><tr><td>אולטראסוניקטור</td><td>דלתא</td><td>D150H</td><td>150W, 43kHz</td></tr><tr><td>אור UV</td><td>DAIHAN</td><td>WUV-L10</td><td></td></tr><tr><td>מייבש הקפאה</td><td>FIRSTEK</td><td>150311025</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3 (פיברובלסטים)</td> <td>מכון המחקר והפיתוח של תעשיית המזון (FIRDI)</td><td>08C0011</td><td></td></tr><tr><td>MOXI Z מיני מונה תאים אוטומטי</td><td>ORFLO</td><td>MXZ001</td><td></td></tr></tbody></table>

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

הדרכה מלאכותי יישור הסלולר היא נושא חם בתחום של הנדסת רקמות. רוב המחקרים הקודמים חקרה יחיד זן-induced הסלולר יישור הידרוג עמוסי התא באמצעות תהליכים מורכבים ניסיוני מסה למערכות שליטה, אשר יהיו משויכת בדרך כלל בעיות זיהום. לפיכך, במאמר זה, אנו מציעים גישה פשוטה לבניית מתח סטטי מעבר צבע באמצעות שבב fluidic עם כיסוי פלסטיק PDMS מצע זכוכית שקופה UV על הגירוי של התנהגות הסלולר הידרוג תלת-ממד. Prepolymer תא patternable-צילום להעמיס בבית הבליעה fluidic ניתן להפיק קמורה קרום PDMS מעוקל על השער. לאחר UV crosslinking, דרך micropattern מעגלית קונצנטריים תחת קרום PDMS מעוקל, מאגר הכביסה, microenvironment עבור תא חוקר התנהגויות תחת מגוון רחב של זנים הדרגתיות מעוגנת עצמית שבב fluidic יחיד, ללא מכשירים חיצוניים. NIH3T3 התאים היו הפגינו לאחר התבוננות לשינוי המגמה יישור הסלולר תחת הדרכתו גאומטריה, בשיתוף פעולה עם זן גירוי, אשר בין 15-65% על hydrogels. לאחר דגירה 3 ימים, הגיאומטריה הידרוג שלטה היישור תא בלחץ נמוך compressive, שבו תאים מיושרים לאורך כיוון התארכות הידרוג בלחץ גבוה compressive. בין אלה, התאים הראה היישור אקראי בשל פיזור של ההדרכה רדיקלית של הידרוג התארכות והדרכה הגיאומטריה של הידרוג בדוגמת.

כדי להשוות את הווריאציות מכני בין כל הידרוג מעגלית בשבב גירוי שהושלמו זן הדרגתיות, אנחנו נמדדים את רוחב הקו כל הידרוג מעגלית בשני שבבי זהה, עם הזרקת כרכים של 0 µL (איור 4a), 40 µL (איור 4b), בהתאמה. Elongations אחוז על כל עיגול היו מחושב על ידי חלוקה של elongations בשבב 40 הזריק µL רוחב הקו hydrogels המתאימה ב- 0 µL הזרקת השבב (איור 4 c). הידרוג היא חומר וחישובים, כך המתח קבלנות אנכי יהיה שווה ערך ל ...

מאמר זה מציג גישה פשוטה כדי מתן לא רציפה זנים סטטי מעבר צבע על הידרוג קונצנטריים עמוסי התא לווסת תא היישור עבור הנדסת רקמות.

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

המטרה הכוללת של שבב מתח שיפוע זה היא לספק גישה פשוטה ליצירת זנים סטטיים בשיפוע לא רציף על הידרוג'ל תלת מימדי לחקירת התנהגויות תאים בסדרה של תנאי מתח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-הנדסה כגון גירויים של התמיינות תאי גזע וויסות יישור תאים להתפתחות איברי רקמה מלאכותית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם זנים שונים על שכבת התא והידרוג'לים באותה סביבת מיקרו להשוואה של התנהגות התא.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכנת השבב מכיוון שהאור צריך להסתיים תוך שלוש עד ארבע שעות לבסיס הניסוי כדי להבטיח שונות תאים גבוהה. שוקלים 10 גרם אבקת ג'לטין ומוסיפים אותה לבקבוק זכוכית עם 100 מיליליטר של מי מלח פוספט של Dulbecco, או DPBS. הכניסו מוט ערבוב מגנטי לבקבוק והניחו את הבקבוק על צלחת חמה מערבבת.מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי מים. הגדר את טמפרטורת הפלטה החמה ל 50 עד 60 מעלות ואת המערבל על 100 סל"ד למשך שעה כדי להמיס את אבקת הג'לטין. לאחר שהג'לטין נמס, מוסיפים שמונה מיליליטר של אנהידריד מתאקרילי לאט מאוד בעזרת פיפטה.תן לו להגיב ב-60 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן הוסף DPBS מחומם מראש לבקבוק לנפח סופי של 500 מיליליטר. הניחו לתמיסה להתערבב היטב למשך 15 דקות כדי לעצור את התגובה.בינתיים חתכו קרום דיאליזה לכמה צינורות באורך 25 מילימטר. טבלו אותם במים נטולי יונים למשך 15 דקות. וצרו קשר כדי לסגור קצה אחד של צינורות הדיאליזה.טען את הכמות המתאימה של תמיסת הפולימר לתוך צינורות הדיאליזה וסגור את הקצה השני. לאחר מכן הניחו את הצינורות המלאים בכוס פלסטיק של חמישה ליטר עם מים נטולי יונים למשך שבוע. לחדש את המים נטולי היונים פעמיים ביום ולשמור על התמיסה בטמפרטורה של 40 עד 50 מעלות צלזיוס במהלך תהליך הדיאליזה.לאחר הדיאליזה יש לאסוף את התמיסה מהצינורות לבקבוק זכוכית של 500 מיליליטר. שופכים כ -450 עד 500 מיליליטר תמיסה לכוס פילטר של 500 מיליליטר. והחל ואקום כדי לאלץ את התמיסה לעבור דרך קרום המסנן לעיקור.לאחר מכן העבירו את הפולימר המעוקר למספר צינורות מעוקרים של 50 מיליליטר. מעבירים את הפולימר המעוקר למספר צינורות מעוקרים של 50 מיליליטר ומאחסנים אותם במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים. יש לייבש בהקפאה את הפולימר מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שבוע באמצעות מייבש הקפאה ליצירת GelMA אשר ניתן לאחסן במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.לייצור שבבים הכינו תחילה את הפולימתאקרילט או PMMA, מנוגנים ומעוצבים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הכן את מכסה ה-PTMS ואת תקע ה-PTMS על ידי ערבוב נכון של 30 גרם אלסטומר PTMS ושלושה גרם של חומר ריפוי PTMS. הסר את התערובת מתחת לתא ואקום למשך שעה.יצקו 1.8 עד שני גרם מהתערובת לתבנית PMMA לכיסוי ה-PTMS. השתמש גם בכמות המתאימה למילוי כל חלל עבור תבנית PMMA עבור תקע ה-PTMS. בנוסף, יצקו 10 גרם של תערובת PTMS לא נרפאה בצלחת פלסטיק ריקה של 10 סנטימטרים.הכניסו את התבניות הללו לתא ואקום להסרת גז למשך 30 דקות. רפאו את ה-PTMS במשך שעתיים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. לאחר קירור ה-PTMS הנרפא על התבנית, נתק את כיסויי ה-PTMS ואת תקעי ה-PTMS מתבניות ה-PMMA.לאחר מכן, אגרוף שני חורים בקוטר של כשלושה מילימטרים בקצות תעלות הזרימה של כיסויי ה- PTMS. חותכים את יריעת ה- PTMS המעוצבת מצלחת הפלסטיק של 10 סנטימטר לקוביות רבות של סנטימטר על סנטימטר אחד. ולנקב חור של שלושה מילימטר בכל קוביית PTMS.הדביקו שתי קוביות PTMS לא מעובדות סנטימטר על סנטימטר אחד על פתחי מכסה ה-PTMS כדי לשמש כמאגרים בינוניים ולסייע בתהליך הריפוי של דפוסי ההידרוג'ל המעגליים של השיפוע. לאחר מכן יש לרפא במשך שעה בחום של 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חבר את כיסויי ה-PTMS עם שני מאגרי ה-PTMS על שקופית מצופה TMSPMA.לשם כך, טפל מראש בצד ההדבקה של מכסה ה-PTMS ובהחלקה המצופה TMSPMA מתחת למכונת פלזמת חמצן למשך 90 שניות של טיפול בפלזמת חמצן. צור קשר עם המשטח המטופל בפלזמה של כיסויי ה-PTMS ושקופית ה-TMSPMA ולחץ עליהם בחוזקה להדבקה קבועה באמצעות היווצרות קשר סיליקון חמצן סיליקון. הדפס מסיכת צילום על-ידי הדפסת הפריסה שנקבעה על סרט צילום שקוף.לאחר מכן חותכים את מסכת הצילום המודפסת לגודל של 25 מילימטרים על 37.5 מילימטרים. שקלו 25 מיליגרם של GelMA מיובש בהקפאה לתוך 0.3 מיליליטר של מדיום תרבית תאים שחומם מראש בצינור מיקרו-צנטריפוגה שחור של 1.5 מיליליטר. הנח את צינור המיקרו-צנטריפוגה על פלטה חמה של מערבל מעבדה עד שה-GelMA מתמוסס במדיום.הוסף 50 מיליגרם של פוטו-יוזם למיליליטר אחד של DPBS בצינור מיקרו-צנטריפוגה. והכניסו אותו לתנור של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות או עד שהפוטו-יוזם נמס. הוסף 25 מיקרוליטר של הפוטו-יוזם 10% לצינור המיקרו-צנטריפוגה.פיפטה מספר פעמים לערבב היטב. לאחר מכן, ספרו שלושה מיליון תאי NIH3T3 באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר צנטריפוגה של התרחיף ב-200 גרם למשך חמש דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-175 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים.הוסף את תמיסת התא לצינור המיקרו-צנטריפוגה כדי לקבל תמיסת תא קדם-פולימר של 5% GelMA, 0.5% פוטו-יוזם וכשישה מיליון תאי 3T3 למיליליטר. לאחר הערבוב טען 100 מיקרוליטר של פרה-פולימר תאים למיקרו-מזרק של 100 מיקרוליטר. יישר ידנית חלק ממסכת הפוטו-סיכה על השקופית התחתונה של שבב המתח המעוקר של מעבר הצבע.ופשוט תקן את המיקום באמצעות טיפה קטנה של מים נטולי יונים בין לבין. חבר את המיקרו-מזרק בנפח 100 מיקרוליטר, עמוס בתמיסת תא פרה-פולימר לכניסת השבב. לאחר מכן הנח 50 מיקרוליטר של תמיסת תאים פרה-פולימריים בתעלת הזרימה באמצעות המיקרו-מזרק וחבר את השקע באמצעות תקע PTMS.הזרקו 40 מיקרוליטר נוספים של תמיסה ליצירת בליטה קמורה בקרום ה-PTMS העגול. העבר את השבב עם מסכת הצילום, המיקרו-מזרק ותקע ה-PTMS מתחת למנורת UV. וחשוף אותו למשך 30 עד 45 שניות כדי להצליב את ההידרוג'ל המעגלי הקונצנטרי בתא הנוזל.לאחר קישור צולב הסר את תקע ה-PTMS ואת המיקרו-מזרק כדי לשחרר את לחץ הנוזל. השתמש במזרק של מיליליטר אחד עמוס ב-DPBS מחומם מראש כדי לשטוף שרפים לא מקושרים שלוש פעמים על ידי שטיפה מהכניסה לשקע. לאחר מכן, מלאו את תעלת הזרימה בכ-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים.מניחים את הצ'יפס בצלחת תרבית מעוקרת ותרבית באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע. רענן את המדיום כל יום. צלם תמונות של שלושה שבבים ביום האפס לאחר ארבע שעות דגירה כקבוצת הביקורת.ושלושה שבבים ביום השלישי כאשר ערכת הניסוי משתמשת במיקרוסקופ עם מטרה פי 20. מדוד את רוחב הקו של כל הידרוג'ל מקו אחד עד שורה 12 באמצעות תוכנה לחישוב כתמי הדחיסה. מוצגות כאן תוצאות מייצגות של דפוסי הידרוג'ל עם אפס מיקרוליטר ו-40 מיקרוליטר בהזרקה, לאחר קישור צולב UV וארבע שעות דגירה.רוחב הקו של ההידרוג'ל התלת-ממדי בבקרת הזרקת היתר נראה אחיד כצפוי. עם זאת, דפוסי ההידרוג'ל עם הזרקה של 40 מיקרוליטר נותנים רוחב קו שיפוע של הידרוג'ל היורד מקו אחד לקו 12. לאחר שלושה ימים של דגירה, התאים בהידרוג'ל משתרעים לכיוונים שונים.התאים בשורה אחת מתיישרים לאורך הכיוון הרדיאלי עקב גירוי התארכות ההידרוג'ל. להיפך, התאים בשורה 12 מתיישרים לאורך צורת ההידרוג'ל שבה רמז הגיאומטריה שולט ביישור התאי. אין יישור תאים ספציפי בשורה 7 שבו שני רמזי היישור התאיים של קו 1 ושורה 12 מאזנים זה את זה.לאחר מדידת סביבת המיקרו של זני שיפוע על הידרוג'ל תלת מימדי יכולה להיעשות על ידי שבב מתח השיפוע תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקר את שבב מתח השיפוע לפני טעינת תמיסת הקדם-פולימר של התא. כמו כן, נגב היטב את פני השבב עם 75% אתנול לפני הכנסת השבבים לחממת תרבית התאים.לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה מאוד כיצד ליצור שבב מתח שיפוע כדי לחקור התנהגויות תאים תחת זנים שונים אימפריאליים.

gradient-strain-chip-for-stimulating-cellular-behaviors-cell-laden

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פרוטוקול עבור microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic כי ניתן להפיק הדרגתיים במרחב ובזמן ב microenvironment מוגדרים היטב. בגישה זו, המכשיר שיפוע מניבות microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד נדידת תאים מכוונת, embryogenesis, ריפוי פצעים, ועל גרורות סרטניות.

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את ייצור של מערך microactuator מכלל הודעות העקורים אנכית שבו הטכנולוגיה מבוססת, ואיך הטכנולוגיה הזו בסיס ניתן לשנות לנהל תפוקה גבוהה תרבית תאים דינמי מכנית בתרבות הן דו מימדי ותלת מימדי פרדיגמות.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

ביוסינתזה של מטריקס סחוסים ידי כונדרוציטים יכולה להיות מושפעת על ידי יישום של גירויים מכאניים. שיטה זו מתארת ​​את הטכניקה של החלת זני דחיסה דינמיים לכונדרוציטים גלומים במבני 3D וההערכה של Induced שינויים בחילוף חומרי chondrocyte.

גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose

התקנים מיקרו-מיוצרים המשולבים עם רכיבים נוזליים מספקים פלטפורמה במבחנה למחקרי תאים המחקים את המיקרו-סביבה in vivo. פיתחנו שבבים מיקרופלואידיים מבוססי פולימתיל-מתאקרילט לחקר תגובות תאיות תחת גירוי מתח כימי/חשמלי/גזירה יחיד או קיים.

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

השיטה המוצגת כוללת מתיחה חד-אקסיאלית של הידרוג'לים רכים תלת-ממדיים המוטמעים בגומי סיליקון תוך מתן אפשרות למיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. אפיון של זני הידרוג'ל חיצוניים ופנימיים, כמו גם יישור סיבים מודגמים. המכשיר והפרוטוקול שפותחו יכולים להעריך את התגובה של תאים למשטרי זנים שונים.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

כאן, אנו מספקים שבב microfluidic ומערכת מיקרופלואידית במחזור מבוקרת ויעילה מאוד באופן אוטומטי, כי מסכם את microenvironment הראשונית של neovascularization, המאפשר לתאי אנדותל (ECs) להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial, גורם צמיחה אנדותל כלי דם שונים (VEGF) הפצה בו זמנית.

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה ניסיונית להערכת ההשפעות של רמזים מכניים וביוכימיים על תגובות כימותרפיות של תאי גליובלסטומה שמקורם בחולה בתרביות מטריצה-מימטיות תלת-ממדיות באמצעות התקן תאורת UV מותאם אישית המאפשר פוטו-קרוסלינקינג בתפוקה גבוהה של הידרוג'לים עם תכונות מכניות הניתנות לכוונון.

מערכי הידרוג'ל מאפשרים תפוקה מוגברת לסינון השפעות של רכיבי מטריצה וטיפולים במודלים תלת-ממדיים של גידולים

אנו מתארים את הבידוד של cardiomyocytes בילוד והכנת התאים אנקפסולציה ב בונה הפיברין הידרוג'ל של הנדסת רקמות. אנו מתארים שיטות לניתוח רקמות מהונדסות שריר הלב לאחר תקופת התרבות כולל כוח פעיל שנוצר על גירוי חשמלי ואת הכדאיות התא מכתים immunohistological.

Encapsulation של cardiomyocytes ב Hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב

למדו כיצד לייצר שבב מעבר צבע למתח סטטי בהידרוגל תלת-ממדי עמוס בתאים לחקירת התנהגויות תאיות ויישור תאים בהנדסת רקמות.

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

גלה סרטונים נוספים