HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבחון כיצד העברה של גנים באמצעות נגיפים משפיעה על פנוטיפים התנהגותיים הדורשים הטרו-דימריזציה של קולטנים מצומדי חלבון G במודלים של עכברים. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הנוירו-פארמקולוגיה והפסיכו-פארמקולוגיה, ובאופן ספציפי, כיצד קולטנים מצומדי חלבון G מקיימים אינטראקציה זה עם זה ברמה המולקולרית.

באמצעות שימוש בשיטה זו נוכל להבין כיצד אינטראקציה זו משפיעה על ההתנהגות במודלים של הפרעות פסיכיאטריות, כגון סכיזופרניה ודיכאון. באמצעות שיטה זו נבחן באופן ספציפי את seratonin 2a ואת metabotropic glutamate receptor 2, ששניהם נמצאו כמעורבים במנגנון הפעולה של תרופות המשמשות לטיפול בחולי סכיזופרניה. התחילו בהרדמה נאותה של העכבר בהתאם לשיטות המאושרות.

יש לוודא שהושגה הרדמה במישור כירורגי על ידי ביצוע צביטה בבוהן וסימון היעדר תגובה. לאחר מכן, יש למרוח ג'ל אופתלמי להגנה על העיניים. חברו את העכבר למסגרת הסטריאוטקטית, וודאו שאתם מכוונים את נטיית הראש כך שהגולגולת תהיה מאוזנת ושטוחה.

מרחו פובידון יוד על הקרקפת החשופה. בעזרת סכין מנתחים, בצעו חתך סגיטלי לאורך קו האמצע של הגולגולת בתוך האזור הגולח החשוף. לאחר מכן, הצמידו תפסני pureit לעור באתר החתך כדי להבטיח שהגולגולת תישאר חשופה.

יש למרוח מי חמצן כדי להמיס את הפריאוסטאום (קרום העצם) ולחשוף את התפרים של הגולגולת. כעת, לאחר שהברגמה והתפרים נראים, יש לוודא את כיוונו של המסגרת הסטריאוטקסטית כדי להבטיח שהגולגולת נמצאת במנח מאוזן. יש ליישר את קצות המחטים של המזרקים עם הברגמה ולרשום את קואורדינטות הברגמה.

להזרקה דו-צדדית לקורטקס הפרונטלי, הוסיפו 1.6 mm לקואורדינטת ה-bregma במישור ה-rostral caudal, ו-2.6 mm לקואורדינטת ה-bregma במישור ה-medial lateral. סמנו את נקודות ההזרקה על הגולגולת ולאחר מכן קדחו חורים קטנים בנקודות אלו. בעזרת מקלון צמר, נגבו דם עודף או רסיסי עצם.

הביאו את המחט אל פני השטח של המוח, והורידו אותה לעומק של קואורדינטת ה-dorsal ventral. לאחר מכן, הזרקו באיטיות את תכולת המזרק על ידי סיבוב בוכנת המחט כדי להחדיר 0.1 µL לדקה למשך חמש דקות, להזרקה של 0.5 µL. השאירו את המזרק במקומו למשך חמש דקות.

בתום הזמן שנקצב, הוצא את החיה מהסטראאוטקסיס, סגור את החתך והנח אותה על פד חימום. ניתן אלגזיה לאחר הניתוח בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר שלך. בצע בדיקות התנהגותיות יומיים עד שלושה ימים לאחר ההזרקה הסטראאוטקטית של החלקיקים הוויראליים.

הרגילו את העכברים לחדר למשך ארבע שעות לפחות לפני תחילת הניסוי. התחילו בהמסה של DOI בתוך תמיסת סלין 0.9% בריכוז של 2 mg/kg. הכינו כלוב בית ללא מצע, והשתמשו בחצובה כדי לכוון מצלמה כך שתהיה ממוקמת ישירות מעל כלוב הבית.

כוון את המצלמה כך שכל כלוב המחיה יהיה בשדה הראייה. שקול את העכבר והזרק לו באופן תוך-פריטוניאלי את המינון המתאים של תמיסת מלח 0.9% או DOI. החזר את העכבר לכלוב המחיה למשך עשר דקות.

לאחר עשר דקות, הניחו את העכבר במרכז כלוב הבית הריק, וודאו שאין נקודות עיוורות בשדה הראייה של המצלמה. לחצו על כפתור ההקלטה במצלמה וצאו מהחדר. לאחר 30 דקות, הפסיקו את ההקלטה והחזירו את העכבר לכלוב הבית המקורי.

חזור על הבדיקה ההתנהגותית בעכבר הבא. בקש מהבורר לסקור את הסרטונים באופן עיוור לתנאי הניסוי. רשום ידנית כל תנועת ראש (head twitch) לאורך הסרטון.

רעידת ראש מוגדרת כתנועת ראשה רפידה ומהירה המבוצעת על ידי עכבר. יש לעבד את הנתונים כפי שמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול. מוצגת כאן תמונה מייצגת של ביטוי טרנסגן בתיווך HSV בקורטקס הפרונטלי.

HSV mGlu2 GFP הוזרק לקליפה הפרונטלית וביטוי ה-GFP נחשף באמצעות אימונוציטוכמיה. סרגל קנה מידה זה מייצג 200 מיקרון. תמונה זו מציגה Western blot של ביטוי טרנסגן המתווך על ידי HSV ותגובתיות anti-mGlu2 בקליפה הפרונטלית של עכברי mGlu2 knockout.

כאן מדדנו את התגובתיות החסונית של mGlu2 כמונומר. היסטוגרמה זו מראה כי ביטוי של mGlu2 בתיווך ויראלי, אך לא ביטוי של mGlu2 כימרי בקליפת המוח הפרונטלית של עכברים עם נוק-אאוט ל-mGlu2, מציל באופן משמעותי את תגובת רעידות הראש המושרה על ידי DOI, אגוניסט של קולטן סרוטונין 2a בעל השפעה הזיית. השלבים הקריטיים ביותר בניסוי זה הם התזמון בין ההזרקות הוויראליות, תגובת רעידות הראש והמועד שבו מקריבים את העכברים.

כל עיכוב עלול לשנות את תוצאות הניסוי או להכניס עמימות לנתונים. לאחר רכישת המיומנות, ניתוח העכבר יארך כ-30 דקות להזרקת הווירוס. ניסוי רעידות הראש אמור לארוך גם הוא כ-35 דקות לכל עכבר.

מומלץ לבצע את הניתוחים במרווחי זמן, או לנתח יותר מעכבר אחד בכל פעם. בדרך זו ניתן לשמור על לוחות זמנים המאפשרים ביצוע של ניסויי רעידות הראש שלושה עד ארבעה ימים לאחר הניתוח, שהוא שיאו של זמן הביטוי של המבנה הוויראלי. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.