Name: HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: חקור השפעת העברת גנים באמצעות נגיף HSV על התנהגות עכברים בקשר להטרודימריזציה של קולטני GPCR. השיטה מאפשרת לבחון את הקשר בין קומפלקס 5-HT2A-mGlu2 להתנהגויות הקשורות לפסיכוזה במודלים של מחלות נפשיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH R01MH084894 השתתף במימון מחקר זה. ברצוננו להודות בני זוג. יסמין הרד וסקוט רוסו בהר סיני הספר לרפואה על התרומה של עכברי השימוש במתקני הניתוח והתנהגותם במהלך הצילומים של עבודה זו.

הערה: כל הנהלים לרבייה החי אכפת נערכו על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הסדרת אייקן הספר לרפואה הר סיני. הקפד להשתמש בכפפות סטריליות לאורך כל ההליך. תרופות וירוסים 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרופות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 15.0 מ&quot;ל קטמין / xylazine הרדמה ידי המסת 1.35 מ&quot;ל של 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קטמין ו 0.75 מ&quot;ל של 20 מ&quot;ג / xylazine מ&quot;ל ב 12.9 מ&quot;ל של תמיסת מלח 0.9%. לערבב ביסודיות פתרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את mGlu2 ו mGlu2ΔTM4N בונה לתוך וירוס הרפס סימפלקס bicistronic (HSV) וקטור בא פרוטוקולים סטנדרטיים שתוארו לעיל 6. ארוז את חלקיקים נגיפיים כפי שתואר לעיל 6,13,14. חילוף של שאריות עלא-677 4.40, עלא-681 4.44 ואת Ala685 4.48 ב mGlu2 עבור Ser686 4.40, Ph4.44 e690 ו גלאי-694 4.48 ב mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) תוארו בעבר 6. הערה: זה הודגם בעבר שהמבנה כימרי HA-mGlu2ΔTM4N מתבטאת קרום הפלזמה עם שלם G חלבון תלוי איתות 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן וקטורים ויראליים ב -80 ° C כאשר אינו בשימוש. וקטור ויראלי להפשיר על הקרח, ולאחר מכן aliquot לתוך 10 aliquots μl. עבור ההליך הכירורגי, ולשמור על הקרח. </li></ol></li></ol> 2. כירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חדר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול עכבר להזריק עכבר עם מינון מתאים של קוקטייל קטמין / xylazine (לפרטים ראה 1.1.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק עכבר כדי לראות אם מורדם כראוי, לסחוט רגל וזנב לתגובת כאב, אם אין אפשרות לבצע לעורר תגובה, העכבר הוא מורדם כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח עכבר ראש מבסיס הגולגולת עד קצה האף באמצעות קוצץ. החל ג&#39;ל עיניים אל af העכברterward למנוע עיוורון של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מזרק אחד על מסגרת stereotaxic. ואז להטות חלק בניצב של כל זרוע של המסגרת stereotaxic כך שהם 10 מעלות מן הרגיל. ודא כי הזרועות מוטות, כך המחטים זה מול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה מזרק אחד על ידי מילוי את המחט עם אתנול 70%. מלא את המחט לפחות שלוש פעמים כדי לוודא כי המזרק נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המחט נוקתה, לשטוף את המחט על ידי מילוי את המחט עם כפול מזוקקי H 2 O. לאחר סמוק, ממלא כל מחט עם 1.3 μl של H המזוקק פעמים 2 O. לסובב את הבוכנה של המזרק כדי לשחרר 0.3 μl של H המזוקק פעמים 2 O. אם חרוזי מים על קצה המחט, בזהירות לנגב מים. אם שום דבר לא יוצא של המזרק, לדחוף את הבוכנה לגמרי למטה ולאחר מכן חזור על ניקוי של מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מילוי עם מים, ואז למשוך את המזרק ממלא את המזרק עם0.5 μl של אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהאוויר והמים הם בתוך המזרק, למלא את המזרק בזהירות עם 1.3 μl של פתרון וירוס. בשלב זה להבטיח כי הנפח הכולל בתוך המזרק הוא 2.8 μl. שוב לסובב את קצה המזרק לשחרר 0.3 μl של הנגיף. אם חרוזי נזילות קצה המחט, בזהירות למחות נוזלי. אם שום דבר לא יוצא של המזרק, לדחוף את הבוכנה לגמרי למטה ולאחר מכן חזור על ניקוי של מזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כִּירוּרגִיָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העכבר על מסגרת stereotaxic, והקפד להתאים את מסגרת stereotaxic כך הגולגולת היא ברמה ושטוחה. החל povodine-יוד על הקרקפת החשופה. באמצעות אזמל, לעשות חתך sagittal לאורך קו האמצע של הגולגולת בתוך האזור המגולח החשוף. ואז לצרף את מהדק buret על העור במקום החתך לוודא כי הגולגולת נשאר חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש H 2 O 2 כדי לפזר משם את periosteum לחשוף את התפרים שלגולגולת. עכשיו כי גבחת והתפרים גלויות, הקפד להתאים את מסגרת stereotaxic לוודא כי הגולגולת היא ברמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הטיפים מחט של מזרקים עם גבחת ולהקליט את הקואורדינטות של גבחת. לחשב את הקואורדינטות של איפה מחטים הולכים להיות מוכנס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המטוס המקורי-Cauldal (RC), להוסיף 1.6 מ&quot;מ לקואורדינטות גבחת RC רשמו (1.6 מ גבחת). עבור המטוס הגבי-הגחון (DV), לחסר 2.4 מ&quot;מ מן הקואורדינטות גבחת DV רשמה (-2.4 מ גבחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, עבור לרוחב המדיאלי (ML) מטוס, להוסיף 2.6 מ&quot;מ לקואורדינטות גבחת ML רשמה (2.6 מ גבחת). עבור כל הקואורדינטות הקפידו להקליט הן קואורדינטות על ימין ועל שמאל, שכן פעולה זו מהווה הזרקה דו-צדדית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את המחטים לקואורדינטות הרצויות. סמן את המקומות היכן המחטים הולכות להיות מוכנסות עם מקדחה, לקדוח באזורים המסומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם wi המוליך כותנה טיפpe משם כל שבר דם או עצם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את המחטים לגולגולת שבו קצות המחטים נגיעת פני השטח של המוח. ואז להוריד את המחטים לקואורדינטות הרצויות הורידו אותם לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המחטים נמצאות הקואורדינטות הרצויות, לאט להזריק את תכולת המזרק על ידי סיבוב הבוכנה של 0.1 μl המחט לדקה במשך 5 דקות (ב 0.5 μl בסך הכל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה נעשתה לעזוב את המזרק בקורטקס לעוד 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת השכמה / טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחטים מהקורטקס עכבר בהתמדה ובאיטיות. ואז להסיר את העכבר מהמסגרת stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל cyanoacrylate (דבק עורי) אל דשי בסיס של העור מפני חתך ולאחר מכן עם מלקחיים לתפוס את קפלי עור ומניחים אותם יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר cyanoacrylate להתייבש. מניח את העכבר בכלוב על כרית חימום (כרית חימום היא אופציונלית אם Surgחבילת iCal נשמרת תחת RT של 37 מעלות צלזיוס - אחרת לא הכרחי). הקפידו למקם את העכבר על מגבת נייר כדי לוודא כי מצעים לא לדבוק באתר כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לאורך של ההליך הכירורגי, להבטיח כי העכברים הם מהרדמה בתוך 30 - 60 דקות לאחר הליך. לאחר הניתוח, החיה מושם בכלוב משלה במעקב עד שהוא הופך מודע לפני החזרה לחדר שלה להתאושש. אין משככי כאבים משמשים שלאחר ניתוח, משום שהם עשויים לשנות את התוצאות של הניסויים שלנו על ידי שינוי חלק הביוכימיים במוח. עם זאת, בעלי חיים מנוטרים עד שהם להתאושש מן ההרדמה ביום הניתוח, ופוסט מבצע יומי סימנים של זיהום והערכה של כאב / מצוקה. </li></ol></li></ol> 3. ניסוי תגובת עווית הראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל בדיקות התנהגותיות 10:00-14:00, 2 - 3 ימים לאחר stereotaהזרקת ctic של חלקיקים נגיפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים (±) -1- (2,5-dimethoxy-4-iodophenyl) hydrochloride -2-aminopropane (DOI) לתוך תמיסת מלח 0.9% עד 2.0 מ&quot;ג / ק&quot;ג. כמו כן להכין תמיסת מלח 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו בכלוב בבית (28 x 18 x 15 ס&quot;מ) ללא כל המצעים ושימוש-pod תלת, התאמת המצלמה כך שהנוף מצלמת וידאו היא ישירות מעל לכלוב בבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרגיל העכברים לחדר לפחות 4 שעות לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מצלמת וידאו כדי להקליט את עווית הראש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְנַסוֹת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המצלמה כך שזה בדיוק מעל כלוב הביתה. כייל את המצלמה כך את הכלוב הביתה כולו נמצא בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול העכבר להזריק עכבר intraperitoneally עם המינון המתאים של תמיסת מלח או 0.9% או DOI (0.01 מ&quot;ל / g). הערה: אם עכבר שוקל 25 גרם, לנהל המינון כדי בהיקף כולל של 0.25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל עכבר לכלוב ביתם FOr 10 דקות. לאחר 10 דקות, העכבר במקום למרכז את הכלוב הביתה בידיים ולאמת שאין כתמים עיוורים בתחום הראייה של המצלמה. שיא לחץ על מצלמת וידאו. עזוב את החדר. הערה: תנועות עכבר ותגובות התנהגותיות שונות בה (... הראש להתעוות, שריטת אוזן, וכו &#39;עיין נוסף לנתונים בטבלה 1 של גונזלס-Maeso ואח 2007 רשימה מלאה של תגובות התנהגותיות מושרה על ידי DOI) 3, יתועד עבור 30 דק &#39;. לכן, חשוב אין כתמים עיוורים בתחום המבט המוקלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות לעצור את ההקלטה על העכבר המצלם ומקום לכלוב בית המקורי. חזור על תהליך זה עבור כל עכבר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש כל בחינת שופט הקלטות עיוורות תנאי הניסוי של עכבר (כלומר., תרופות המשמשות במהלך הראש להתעוות ניסוי או וירוס שימוש במהלך הזרקה תוך גולגולתי)). ידני להקליט כל ראש להתעוות througHout הוידאו. הערה: ראש-עווית מוגדרת כתנועת ראש הטלטול מהירה שערכה עכבר (וידאו משלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל עכבר, ממוצע תגובת HTR הסופית משלושת הסיכומים של השופטים העיוורים. לאחר מכן קבץ ערכים אלה על ידי תנאי הניסוי ולבצע ניתוח סטטיסטי (כלומר., מבחן t או ANOVA). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fribourg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+Signaling+of+a+GPCR+Heteromeric+Complex+Reveals+a+Unifying+Mechanism+of+Action+of+Antipsychotic+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding the Signaling of a GPCR Heteromeric Complex Reveals a Unifying Mechanism of Action of Antipsychotic Drugs.</a> Cell. 147 (5), 1011-1023 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+serotonin%2Fglutamate+receptor+complex+implicated+in+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a serotonin/glutamate receptor complex implicated in psychosis.</a> Nature. 452 (7183), 93-97 (2008).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+Recruit+Specific+Cortical+5-HT%282A%29+Receptor-Mediated+Signaling+Pathways+to+Affect+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens Recruit Specific Cortical 5-HT(2A) Receptor-Mediated Signaling Pathways to Affect Behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+fingerprints+distinguish+hallucinogenic+and+nonhallucinogenic+5-hydroxytryptamine+2A+receptor+agonist+effects+in+mouse+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome fingerprints distinguish hallucinogenic and nonhallucinogenic 5-hydroxytryptamine 2A receptor agonist effects in mouse somatosensory cortex.</a> J Neurosci. 23 (26), 8836-8843 (2003).</li>
<li>Moreno, J. L., Holloway, T., Albizu, L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+mGlu2+receptor+is+necessary+for+the+pharmacological+and+behavioral+effects+induced+by+hallucinogenic+5-HT2A+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate mGlu2 receptor is necessary for the pharmacological and behavioral effects induced by hallucinogenic 5-HT2A receptor agonists.</a> Neurosci Lett. 493 (3), 76-79 (2011).</li>
<li>Moreno, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Three+Residues+Essential+for+5-HT2A-mGlu2+Receptor+Heteromerization+and+its+Psychoactive+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Three Residues Essential for 5-HT2A-mGlu2 Receptor Heteromerization and its Psychoactive Behavioral Function.</a> J Biol Chem. 287, 44301-44319 (2012).</li>
<li>Geyer, M. A., Vollenweider, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+research%3A+contributions+to+understanding+psychoses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Serotonin research: contributions to understanding psychoses.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (9), 445-453 (2008).</li>
<li>Nichols, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens.</a> Pharmacol Ther. 101 (2), 131-181 (2004).</li>
<li>Hanks, J. B., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+serotonergic+psychedelics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models of serotonergic psychedelics.</a> ACS Chem Neurosci. 4 (1), 33-42 (2013).</li>
<li>Fiorella, D., Rabin, R. A., Winter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+the+stimulus+effects+of+hallucinogenic+drugs.+II%3A+Reassessment+of+LSD+false+positives%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Role of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in the stimulus effects of hallucinogenic drugs. II: Reassessment of LSD false positives.</a> Psychopharmacology (Berl). 121 (3), 357-363 (1995).</li>
<li>Vollenweider, F. X., Vollenweider-Scherpenhuyzen, M. F., Babler, A., Vogel, H., Hell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psilocybin+induces+schizophrenia-like+psychosis+in+humans+via+a+serotonin-2+agonist+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Psilocybin induces schizophrenia-like psychosis in humans via a serotonin-2 agonist action.</a> Neuroreport. 9 (17), 3897-3902 (1998).</li>
<li>Moreno, J. L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptors+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptors and schizophrenia.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (23), 3777-3785 (2009).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC2+regulates+atypical+antipsychotic+responses+through+the+modulation+of+mGlu2+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC2 regulates atypical antipsychotic responses through the modulation of mGlu2 promoter activity.</a> Nat Neurosci. 15 (9), 1245-1254 (2012).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressive+Epigenetic+Changes+at+the+mGlu2+Promoter+in+Frontal+Cortex+of+5-HT2A+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Repressive Epigenetic Changes at the mGlu2 Promoter in Frontal Cortex of 5-HT2A Knockout Mice.</a> Mol Pharmacol. 83 (6), 1166-1175 (2013).</li>
<li>Rives, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+GABAB+and+mGlu1a+receptors+reveals+new+insight+into+GPCR+signal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between GABAB and mGlu1a receptors reveals new insight into GPCR signal integration.</a> Embo J. 28 (15), 2195-2208 (2009).</li>
<li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prevalence%2C+Maintenance+and+Relevance+of+GPCR+Oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Prevalence, Maintenance and Relevance of GPCR Oligomerization.</a> Mol Pharmacol. (84), Epub ahead of print 158-169 (2013).</li>
<li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited%3A+functional+and+pharmacological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacol Rev. 66 (2), 413-434 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+oligomers+in+pharmacology+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">GPCR oligomers in pharmacology and signaling.</a> Mol Brain. 4 (1), 20(2011).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Family+a+GPCR+heteromers+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Family a GPCR heteromers in animal models.</a> Front Pharmacol. 5, 226(2014).</li>
<li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28BRET%29+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 12060-12065 (2011).</li>
<li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li>
<li>Fonseca, J. M., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+a+class+a+G+protein-coupled+receptor+oligomer+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Instability of a class a G protein-coupled receptor oligomer interface.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1296-1299 (2009).</li>
<li>Hern, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+dissociation+of+M1+muscarinic+receptor+dimers+seen+by+total+internal+reflection+fluorescence+imaging+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2693-2698 (2010).</li>
<li>Hlavackova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+inter-+and+intrasubunit+rearrangements+during+activation+of+dimeric+metabotropic+glutamate+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Sequential inter- and intrasubunit rearrangements during activation of dimeric metabotropic glutamate receptor 1.</a> Sci Signal. 5 (237), 59(2012).</li>
<li>Irannejad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+biosensors+reveal+GPCR+signalling+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational biosensors reveal GPCR signalling from endosomes.</a> Nature. 495 (7442), 534-538 (2013).</li>
<li>Calebiro, D., Nikolaev, V. O., Persani, L., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+internalized+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling by internalized G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (5), 221-228 (2010).</li>
<li>Celada, P., Puig, M. V., Diaz-Mataix, L., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallucinogen+DOI+reduces+low-frequency+oscillations+in+rat+prefrontal+cortex%3A+reversal+by+antipsychotic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The hallucinogen DOI reduces low-frequency oscillations in rat prefrontal cortex: reversal by antipsychotic drugs.</a> Biol Psychiatry. 64 (5), 392-400 (2008).</li>
<li>Béïque, J. -C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (23), 9870-9875 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יחד עם ממצאים קודמים mGlu2-KO עכברים 5, את התוצאות עם mGlu2 ו mGlu2 / mGlu3 בונה כימרי כי לא יוצרים במתחם הקולטן 5-HT 2A -mGlu2 בתאים בתרבית מראים כי 2A 5-HT -mGlu2 מורכב קולטן heteromeric ב קליפת המוח הקדמית העכבר יש צורך להשרות התנהגות ראש עווית על ידי אגוניסטים לקולטן 2A 5-HT הזיה דמויי LSD. הגבלה של שיטה זו היא שהיא אינה מודדת קרובה קרבה מולקולרית ברמת subcellular ברקמת ילידים. בנוסף, יש נקודות קריטיות שונות שיירשמו. בגלל העכברים מוז...

הזיה, כגון LSD, פסילוסיבין מסקלין לגרום לשינויים משמעותיים בתודעה האנושית, קוגניציה ורגש 7-9. איון של איתות קולטן הסרוטונין 5-HT 2A באמצעות גישות גנטיות או תרופתיות גורם נחלש במידה ניכר תגובות התנהגותיות הזיה בשני המודלים המכרסמים 3,10 ובני אדם 11. למרות הזיה לאגד תת קולטן אחר 8, הקולטן 2A 5-HT נחשב הכרחי לפעילות התנהגותי הייחודית של הכימיקלים האלה. קבוצת II קולטני גלוטמט metabotropic (כלומר., MGlu2 ו mGlu3) היה היעד של תשומת לב רבה לגבי המנגנון המולקולרי של הזיה לבין התפקיד האינטגרלי שלהם שבבסיס פסיכוזה 12. בעבר, הוכח כי עכברים ללא ביטוי של חלבון mGlu2 (mGlu2-KO עכברים) אינם רגישים להשפעות הסלולר והתנהגותיים של האלlucinogens 5. כמו כן הוצע כי 2A 5-HT ואת קולטני mGlu2 צורה מורכבת heteromeric ספציפי שדרכו הליגנדים סרוטונין גלוטמט לווסת את דפוס של צימוד חלבון G בתאים חיים 1,2. מבחינה מבנית, הטרנסממברני (TM) תחומים 4 ו -5 של mGlu2 לשחק תפקיד מהותי במבנה heteromeric עם קולטן 5-HT 2A 5. בנוסף, בדיקה נוספת הוכיחה כי שלוש שאריות הממוקמות בקצה התאי של TM4 של mGlu2 נחוצות כדי ליצור את heterocomplex הקולטן 5-HT 2A -mGlu2 בתאים חי 6. בהתבסס על ממצאים אלו נצפו במערכות ביטוי Heterologous, כאן אנו מתארים את השימוש בביטוי HSV בתיווך של mGlu2 wild-type mGlu2 / mGlu3 בונה כימרי בקליפת המוח הקדמית של עכברים mGlu2-KO לבחון האם היווצרות heteromeric בין 5-HT 2A ו mGlu2 הכרחיראש עווית התנהגות מושרה על ידי אגוניסטים לקולטן הזית 5-HT 2A.

<table><tbody><tr><td>mGlu2 וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV)&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף ניתן לפנות למנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta; TM4N וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV)&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף, אנא צרו קשר עם מנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>GFP וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV)&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף ניתן לפנות למנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>קסילזין&nbsp;</td><td>רשימת לויד</td><td>מס' 4811-20 מ"ל, NADA #139-236, קוד NDC: 61311-481-10</td><td>1.35 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל) + 0.75 מ"ל קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) מדוללים ב-12.0 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%</td></tr><tr><td>קטמין&nbsp;</td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA #200-029, קוד(ים) NDC: 50989-161-06</td><td>1.35 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל) + 0.75 מ"ל קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) מדוללים ב-12.0 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%</td></tr><tr><td>ג'ל עיניים</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Burret clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9268369</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי נוצות</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9032736</td><td></td></tr><tr><td>מימן מי חמצן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-898-919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&trade; מחטים נשלפות רכזת קטנה (33 Ga)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14816206</td><td></td></tr><tr><td>אלחוטי מיקרו מקדחה</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond דבק עורי</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42203-78-1</td><td>מומס בתמיסת מלח של 0.9% לריכוז של 2.0 מ"ג/ק"ג</td></tr></tbody></table>

hsv בתיווך ביטוי transgene של מבנים chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של heteromers gpcr עכברים

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

קומפלקס הקולטנים ההטרומרי בין 5-HT2A ל-mGlu2 היה מעורב בחלק מהפנוטיפים ההתנהגותיים במודלים של פסיכוזה בעכברים1,2. כתוצאה מכך, חקירת פרטים מבניים של האינטראקציה בין 5-HT2A ו-mGlu2 המשפיעים על התנהגויות הקשורות לסכיזופרניה מייצגת כלי תרגומי רב עוצמה. כפי שהוצג קודם לכן, תגובת עווית הראש (HTR) בעכברים נגרמת על ידי סמי הזיה ותגובה התנהגותית זו נעדרת בעכברי נוקאאוט 5-HT2A (KO)3,4. בנוסף, על ידי ביטוי מותנה של קולטן 5-HT2A רק בקליפת המוח, הוכח כי מסלולי איתות תלויי קולטן 5-HT2A על נוירונים פירמידליים בקליפת המוח מספיקים כדי לעורר התנהגות של עווית ראש בתגובה לתרופות הזיה3. לבסוף, הוכח כי התגובה ההתנהגותית של עווית הראש הנגרמת על ידי סמי ההזיה DOI וחומצה ליסרגית דיאתילאמיד (LSD) מופחתת באופן משמעותי בעכברי mGlu2-KO5. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-mGlu2 נחוץ לפחות בחלקו להשפעות התנהגותיות דמויות פסיכוזה תלויות בקולטן 5-HT2A הנגרמות על ידי סמים דמויי LSD. עם זאת, זה לא מספק ראיות האם קומפלקס הקולטן 5-HT 2A-mGlu2 נחוץ לפנוטיפ התנהגותי זה. כדי לענות על שאלה זו, נעשה שימוש במבנים של וירוס הרפס סימפלקס (HSV) כדי לבטא mGlu2 או mGlu2ΔTM4N (מבנה כימרי mGlu2/mGlu3 שאינו יוצר את קומפלקס הקולטן 5-HT2A-mGlu2) בקליפת המוח הקדמית של עכברי mGlu2-KO כדי לבחון אם קומפלקס הטרומרי GPCR זה נחוץ להשפעות ההתנהגותיות הנגרמות על ידי תרופות דמויות LSD6.

ממצאים קודמים מראים כי ראש-עווית תגובה התנהגותית בעכברים הוא באמינות וחסונה שהושרו על ידי הזיה, והיא נעדרת 5-HT 2A -KO עכברים 3. יתר על כן, הוכיח כי תגובת ראש העווית שהושרה על ידי אגוניסטים 2A 5-HT הזית DOI ו LSD ירדה משמעותית mGlu2-KO עכברים 5. עם זאת, למרות ממצאים קודמים משכנעים להוכיח כי 5-HT 2A ו mGlu2 מורכבים כמתחם heteromeric במבחנה בתאים transfected 1,2,15, אם סדר מבנ...

מאמר זה מתאר כיצד להזריק וקטורים ויראליים לתוך קליפת המוח הקדמית בעכבר כדי לבדוק מבחני התנהגות הדורשים heteromeric היווצרות GPCR.

HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבחון כיצד העברה של גנים באמצעות נגיפים משפיעה על פנוטיפים התנהגותיים הדורשים הטרו-דימריזציה של קולטנים מצומדי חלבון G במודלים של עכברים. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הנוירו-פארמקולוגיה והפסיכו-פארמקולוגיה, ובאופן ספציפי, כיצד קולטנים מצומדי חלבון G מקיימים אינטראקציה זה עם זה ברמה המולקולרית.באמצעות שימוש בשיטה זו נוכל להבין כיצד אינטראקציה זו משפיעה על ההתנהגות במודלים של הפרעות פסיכיאטריות, כגון סכיזופרניה ודיכאון. באמצעות שיטה זו נבחן באופן ספציפי את seratonin 2a ואת metabotropic glutamate receptor 2, ששניהם נמצאו כמעורבים במנגנון הפעולה של תרופות המשמשות לטיפול בחולי סכיזופרניה. התחילו בהרדמה נאותה של העכבר בהתאם לשיטות המאושרות.יש לוודא שהושגה הרדמה במישור כירורגי על ידי ביצוע צביטה בבוהן וסימון היעדר תגובה. לאחר מכן, יש למרוח ג'ל אופתלמי להגנה על העיניים. חברו את העכבר למסגרת הסטריאוטקטית, וודאו שאתם מכוונים את נטיית הראש כך שהגולגולת תהיה מאוזנת ושטוחה.מרחו פובידון יוד על הקרקפת החשופה. בעזרת סכין מנתחים, בצעו חתך סגיטלי לאורך קו האמצע של הגולגולת בתוך האזור הגולח החשוף. לאחר מכן, הצמידו תפסני pureit לעור באתר החתך כדי להבטיח שהגולגולת תישאר חשופה.יש למרוח מי חמצן כדי להמיס את הפריאוסטאום (קרום העצם) ולחשוף את התפרים של הגול

hsv-mediated-transgene-expression-chimeric-constructs-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מציגים פרוטוקול לייצר אנטיגן ספציפי עכבר מתאי T באמצעות התמרה...

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

תוך ניצול אסטרטגיה גנטית בינארית אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב אחר מעגלים עצביים בעכברים המבטאים עוקבים טרנס-סינפטיים משלימים לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. מכיוון שייצור עוקבים ספציפיים לתא מקודד גנטית, הגישה הניסיונית שלנו מתאימה לחקור את היווצרותם והתבגרותם של מעגלים עצביים במהלך התפתחות המוח העוברי של עכברים ברזולוציית תא בודד.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

מערכת העצבים המעי נוצרת על ידי תאי פסגה עצבית שמתרבים, נודדים ומתיישבים במעיים. תאי פסגה עצבית מתמיינים לנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ המוליך העצבי שלהם. פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח, קיבוע וצביעה חיסונית של מערכת העיכול העוברית של העכברים כדי להמחיש ביטוי נוירוטרנסמיטר של מערכת העצבים המעי.

Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

המשלב בפרוטוקול הנוכחי לתא בודד לזווג אדם TCR אלפא, ביתא שרשרת רצף עם אווירודינמית דור תואם במבחנה ויוו TCR והביטוי retroviral וקטורים.

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) מערכת מספקת כלי מבטיח עבור הנדסה גנטית, ופותחת לו את האפשרות של שילוב יישוב של transgenes. אנו מתארים קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה עבור DNA יעיל ממוקד אינטגרציה ויוו , ממוקד ג'ין טיפולים באמצעות CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

תוך הזרקה של recombinase תלויה רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV) ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סוג התא גנטית שכותרתה בחוט השדרה. כאן נתאר כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני. טכניקה זו מאפשרת פונקציונלי חקירתו של המשנה נוירון מניפולציה.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

מוצג כאן היא פלטפורמה מיקרוסקופית multiphoton עבור הדמיית פני השטח עינית עכבר חי. עכבר טרנסגני פלורסנט מאפשר הדמיה של גרעין התא, קרום התא, סיבי עצב ונימים בתוך פני השטח עינית. אותות לא ליניאריים של הדור ההרמוני השני הנגזרים ממבנים קולגניים מספקים הדמיה ללא תוויות עבור ארכיטקטורות סטרומה.

פלטפורמת מיקרוסקופי מרובה-פוטונים מותאמת אישית להדמיה חיה של קרנית עכבר ולחמית

אנו מציגים פרוטוקולים משופרים להתמרה רטרו-ויראלית של קולטני סחר וביות תחרותי כדי לחקור מיקום לימפוציטים ספציפיים לאיברים ומיקרו-סביבה בתיווך קולטנים. שיטה זו מציעה תובנות חשובות לגבי מנגנוני סחר בתאי חיסון ויש לה יישומים פוטנציאליים במחקר בסיסי וטיפולי עתידי.

התמרה רטרו-ויראלית יעילה וביות תחרותי לחקירת לוקליזציה של תאי T בתיווך GPCR במיקרו-סביבות רקמה מגוונות

חקור השפעת העברת גנים באמצעות נגיף HSV על התנהגות עכברים בקשר להטרודימריזציה של קולטני GPCR. השיטה מאפשרת לבחון את הקשר בין קומפלקס 5-HT2A-mGlu2 להתנהגויות הקשורות לפסיכוזה במודלים של מחלות נפשיות.

HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים

גלה סרטונים נוספים