HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבחון כיצד העברת גנים בתיווך וירוס משפיעה על פנוטיפים התנהגותיים הדורשים הטרודימריזציה של קולטנים מצומדים לחלבון G במודלים של עכברים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-פרמקולוגיה והפסיכו-פרמקולוגיה. באופן ספציפי כיצד קולטנים מצומדים לחלבון g מתקשרים זה עם זה ברמה המולקולרית.

באמצעות שיטה זו אנו יכולים להבין כיצד אינטראקציה זו משפיעה על התנהגות במודלים של הפרעות פסיכיאטריות, כגון סכיזופרניה ודיכאון. באמצעות שיטה זו אנו הולכים להסתכל באופן ספציפי על סרטונין 2a וקולטן גלוטמט מטבוטרופי 2, ששניהם הוכחו כמעורבים במנגנון הפעולה של תרופות המשמשות לטיפול בחולי סכיזופרניה. התחל בהרדמה נכונה של העכבר על פי שיטות מאושרות.

ודא כי הושג מישור הרדמה כירורגי על ידי ביצוע צביטה בבוהן וציון היעדר תגובה. לאחר מכן יש למרוח ג'ל עיניים כדי להגן על העיניים. חבר את העכבר למסגרת הסטריאוטקטית, הקפד לכוונן את הטיית הראש כך שהגולגולת תהיה ישרה ושטוחה.

מרחו יוד פובידון על הקרקפת החשופה. בעזרת אזמל בצע חתך סגיטלי לאורך קו האמצע של הגולגולת בתוך האזור המגולח החשוף. לאחר מכן חבר מהדקי מחית לעור במקום החתך כדי לוודא שהגולגולת נשארת חשופה.

מרחו מי חמצן כדי להמיס את הפריאוסטאום, ולחשוף את תפרי הגולגולת. כעת, כשהברגמה והתפרים נראים לעין, הקפד להתאים את המסגרת הסטריאוטקטית כדי לוודא שהגולגולת ישרה. יישר את קצות המחט של המזרקים עם ברגמה ורשום את הקואורדינטות של ברגמה.

כדי להזריק דו-צדדית לקליפת המוח הקדמית, הוסף 1.6 מ"מ לקואורדינטת הברגמה הזנבית הרוסטרלית המתועדת ו-2.6 מ"מ לקואורדינטת הברגמה הצדדית האמצעית המוקלטת. סמן את אתרי ההזרקה על הגולגולת ולאחר מכן קדח חורים קטנים באתרי ההזרקה. בעזרת מוליך קצה כותנה, נגב את כל עודפי הדם או שברי העצם.

הביאו את המחט אל פני השטח של המוח, והורידו אותה לעומק הקואורדינטה הגחונית הגבית. לאחר מכן הזרקו לאט את תכולת המזרק על ידי סיבוב הבוכנה של המחט למתן 0.1 מיקרוליטר לדקה למשך חמש דקות, לזריקה של 0.5 מיקרוליטר. הניחו למזרק להישאר במקומו למשך חמש דקות.

לאחר הזמן המוקצב, הסר את החיה מהסטריאוטקסיס, סגור את החתך והניח על כרית חימום. יש לתת משככי כאבים לאחר הניתוח בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר שלך. בצע בדיקות התנהגותיות יומיים-שלושה לאחר הזרקה סטריאוטקטית של חלקיקים נגיפיים.

הרגילו את העכברים לחדר לפחות ארבע שעות לפני תחילת הניסוי. התחל בהמסת DOI לתמיסת מלח של 0.9 אחוז לשני מיליגרם לקילוגרם. הכינו כלוב ביתי ללא מצעים ובעזרת חצובה התאימו את המצלמה כך שתהיה ישירות מעל הכלוב הביתי.

כייל את המצלמה כך שכל כלוב הבית יהיה בשדה הראייה. שקלו את העכבר והזריקו תוך צפקית במינון המתאים של 0.9 אחוז מלח או DOI. החזר את העכבר לכלוב הביתי למשך עשר דקות.

לאחר עשר דקות, הנח את העכבר במרכז כלוב הבית הריק, וודא שאין כתמים עיוורים בשדה הראייה של המצלמה. לחץ על הקלטה במצלמת הווידאו וצא מהחדר. לאחר 30 דקות, הפסק את ההקלטה והנח את העכבר בחזרה בכלוב הביתי המקורי.

חזור על מבחן ההתנהגות בעכבר הבא. בקש מהשופט לבחון את הסרטונים עיוור לתנאי הניסוי. הקלט ידנית כל עווית ראש לאורך הסרטון.

עווית ראש מוגדרת כתנועת ראש רועדת מהירה המתבצעת על ידי עכבר. עבד את הנתונים כמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול. מוצגת כאן תמונה מייצגת של ביטוי טרנסגנים בתיווך HSV בקליפת המוח הקדמית.

HSV mGlu2 GFP הוזרק לקליפת המוח הקדמית וביטוי GFP התגלה על ידי אימונוציטוכימיה. סרגל קנה מידה זה מייצג 200 מיקרון. תמונה זו מציגה כתם מערבי של ביטוי טרנסגנים בתיווך HSV ותגובתיות אנטי-mGlu2 בקליפת המוח הקדמית של עכברי נוקאאוט mGlu2.

כאן מדדנו את הפעילות החיסונית של mGlu2 כמונומר. היסטוגרמה זו מראה כי ביטוי מתווך ויראלי של mGlu2, אך לא של mGlu2 כימרי בקליפת המוח הקדמית של עכברי נוקאאוט mGlu2 מציל באופן משמעותי את תגובת עווית הראש הנגרמת על ידי אגוניסט הקולטן ההזייתי סרטונין 2a DOI. השלבים הקריטיים ביותר בניסוי זה הם התזמון בין הזריקות הוויראליות, תגובת עווית הראש ומתי העכברים מוקרבים.

כל עיכוב יכול לשנות את תוצאות הניסוי או להכניס עמימות לנתונים. לאחר השליטה, ניתוח העכבר ייקח כ-30 דקות להזריק את הנגיף. ניסוי עווית הראש אמור להימשך גם כ-35 דקות לכל עכבר.

מומלץ לבצע ניתוחים מדהימים, או לנתח יותר מעכבר אחד בכל פעם. בדרך זו ניתן לשמור על ציר זמן המאפשר לבצע ניסויי עווית ראש בשלושה-ארבעה ימים לאחר הניתוח שהוא זמן הביטוי השיא של המבנה הנגיפי. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.