Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

המטרה הכוללת של זרימת עבודה זו המבוססת על מסנן יחיד היא לטהר בקלות וכמותית N-גליקנים וחלבונים במקביל מדגימות ביולוגיות מניתוח ספקטרומטריית מסה. המדרגיות, המהירות ויכולת השחזור האנליטית של שיטה זו הופכת אותה לנגישה ישירות ביחס למשאבים ומיומנויות למעבדות ספקטרומטריית מסה ביולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור גליקומיקה, תפוסת אתר גליקוזילציה ושאלות פרוטאומיקה בו זמנית במחקרים ביולוגיים בקנה מידה גדול בתפוקה גבוהה.

התגברנו על האתגרים של מדידות N-glycan על ידי צימוד שיטה זו לאסטרטגיית נגזרת מותאמת לספקטרומטריית מסה וכתוצאה מכך כימות מדויק ויחסי בין מצבי סרטן לבקרה. עם שונות אנליטית מופחתת ניתן להבהיר אינטראקציות ביולוגיות חדשות בין הגליקום לפרוטאום, מה שיניב תובנות מפתח לגבי מצבי מחלה והזדמנויות חדשות לגילוי סמנים ביולוגיים. כדי להתחיל, טען 2.5 מיקרוליטר פלזמה על מסנן.

לאחר מכן, הוסף 2 מיקרוליטר של תמיסת דיתיותרייטול 1M לכל דגימה במסנן. יש לדלל את הדגימה עם 200 מיקרוליטר של מאגר עיכול אמוניום ביקרבונט PNGase של 100 מ"מ. כסו את צינור דגימת המסנן ואת המערבולת הקלה, והקפידו לא להפריע למסנן ממושבו.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לנטרל את החלבונים והגליקופרוטאינים. כדי לאלקיל את הדגימות, הוסף 50 מיקרוליטר של 1M יודואצטמיד כדי לתת ריכוז סופי של כ-200 מ"מ. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

רכז את הגליקופרוטאין המפורק על המסנן על ידי צנטריפוגה של הדגימות ב-14,000 x גרם למשך 40 דקות לפני השלכת הזרימה. שוטפים את הדגימה עם 100 מיקרוליטר של מאגר עיכול PNGase. רכזו את הגליקופרוטאין על המסנן והשליכו את הזרימה.

חזור על שלב הכביסה והריכוז פעמיים בסך הכל שלוש פעמים, והניב תרכיז בנפח המת של המסנן. השליכו את כל הזרימה ואת בקבוקון האיסוף לאחר השלמת השטיפות. לאחר מכן, הוסף 2 מיקרוליטר של פפטיד נטול גליצרול N-glycosidase F או PNGase F למסנן לאחר העברתו לבקבוקון איסוף טרי.

הוסף 98 מיקרוליטר מאגר עיכול PNGase המביא את הנפח הכולל ל-100 מיקרוליטר, ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה על המסנן כדי לערבב. לפרוטוקול העיכול של העלייה בעיכול יש לדגור על הדגימות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. עובדים במהירות, מסירים את הדגימות ומכניסים פנימה 2 מיקרוליטר נוספים של PNGase F. מערבל קלות את הדגימות למשך 1 עד 2 שניות לערבוב.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות. לאחר התחמקות מגליקנים על ידי צנטריפוגה של הדגימה ב-20 מעלות צלזיוס, הוסף שוב 100 מיקרוליטר של מאגר עיכול PNGase למסנן ולצנטריפוגה. אסוף את הכביסה המכילה את כל הגליקן המקושר ל-N שנותר באותו בקבוקון איסוף כמו הנוזל.

לאחר חזרה פעמיים, הסר את המסנן והניח בבקבוקון איסוף חדש להכנת פרוטאומיקה. לאחר מכן, דגרו את דגימות הגליקן במקפיא של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות עד להקפאה. לאחר מכן, יבש עד להשלמה בטמפרטורת החדר ברכז ואקום למשך 4 עד 6 שעות.

שטפו את המסנן המכיל את הפפטידים המפורקים עם 400 מיקרוליטר של מאגר אוריאה 8M. מכסים את בקבוקון האיסוף ומערבולת קלות לערבוב. רכזו את הפפטידים על המסנן לפני שתשליכו את כל הזרימה.

לאחר חזרה על שטיפת חוצץ האוריאה פעמיים נוספות, שטפו את המסנן המכיל את הפפטידים המפורקים עם מאגר העיכול של טריפסין. מכסים את בקבוקון האיסוף ומערבולת קלות כדי לערבב לפני שמתרכזים שוב במסנן כמו קודם. יש להשליך את כל הזרימה ולחזור על הפעולה פעמיים נוספות עד לסך של 3 שטיפות חוצץ טריפסין.

אסוף את כל חומרי הכביסה והשטיפות העתידיים בבקבוקון איסוף חדש. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של טריפסין מהונדס בחזיר ביחס של 1:50 טריפסין לחלבון לגילוי פרוטאומיקה או יחס טריפסין לחלבון של 1:5 לניסויי פרוטאומיקה כמותיים. מכסים את בקבוקון האיסוף ומערבולת קלות לערבוב.

לאחר הדגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, עבדו במהירות כדי להסיר את הדגימות ולהעלות 50 מיקרוליטר נוספים של טריפסין ביחס טריפסין לחלבון המתאים. מערבבים קלות את הדגימות למשך 1 עד 2 שניות לערבוב. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות.

לאחר פליטת הפפטידים על ידי צנטריפוגה כמו קודם למשך 20 דקות, שטפו את הפפטידים הנותרים מהפילטר עם מאגר מרווה. הסר את המסנן על ידי צנטריפוגה כמו קודם למשך 15 דקות. לאחר כימות ריכוז הפפטידים בדגימות, דגרו את דגימות הפפטיד במקפיא של 80 מעלות צלזיוס עד להקפאה.

לאחר מכן, יבש עד להשלמה בטמפרטורת החדר ברכז ואקום למשך 4 עד 6 שעות. ואז החלבונים הטריפטיים ממש לפני ספקטרומטריית המסה של הכרומטוגרפיה הנוזלית או ניתוח LCMS בשלב נייד A לריכוז הרצוי. ריכוזי פפטידים טריפטיים מפלזמה של 2.5 מיקרוליטר נעים בין 100 ל-300 ננוגרם למיקרוליטר.

לפני ניתוח הגליקן, יש להרכיב מחדש את האיזוטופ היציב המיובש המסומן ריאגנטים 4-פנתיל בנזוהידרזיד, כמו גם את הריאגנטים המקוריים של P2GPN במיליליטר אחד של תמיסת נגזרת לריכוז סופי של 0.25 מיליגרם למיליליטר. ריאגנטים ייקח עד 10 דקות להסיס במלואם. מערבולת נרחבת כדי להבטיח מסיסות מלאה.

סמן את ה-N-גליקנים המיובשים עם 200 מיקרוליטר של מגיב P2GPN יציב עם תווית איזוטופ או מקורי. פיפטה למעלה ולמטה כדי לתלות מחדש את הגליקנים המיובשים. לאחר מכן, מערבל את הדגימות וסובב כלפי מטה למשך כ-5 שניות על צנטריפוגה עליונה על ספסל.

מגיבים את הגליקנים עם המגיב למשך 3 שעות בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס. העבירו מיד את הגליקנים מהחממה לרכז הוואקום וייבשו עד להשלמה בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך 3 עד 5 שעות. השעו מחדש את ה-N-גליקן המתויג ב-25 עד 50 מיקרוליטר מים ממש לפני כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרומטריית מסה.

פיפטה למעלה ולמטה כדי להבטיח ש-N-גליקנים מסיסים במלואם. לאחר דגימות צנטריפוגה כמו קודם למשך 5 דקות, הסר את הסופרנטנט, היזהר לא לתת לקצה הפיפטה לגעת בתחתית צינור הצנטריפוגה. שלב זוג דגימות מקוריות ויציבות המסומנות באיזוטופים ביחס של 1:1 לניתוח טנדם כימות יחסי.

הכן 2 שיטות LCMS שונות לתהליכי העבודה של פרוטאומיקה וגליקומיקה. לניתוח חלבון, הזרקו כ-400 ננוגרם חלבון על העמודה ב-NPA. הפעל את הדגימה במהירות של 300 ננוליטר לדקה, עם שיווי משקל קדם-עמודה של 1 מיקרוליטר ושיווי משקל עמודה אנליטי של 5 מיקרוליטר.

יינון החלבונים בתנאי הטרשת הנפוצה המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לניתוח גליקן, הזרקו 5 מיקרוליטר של דגימות P2GPN מתויגות מחדש עם תווית מקורית ואיזוטופית יציבה על העמודה. הפעל את הדגימה במהירות של 300 ננוליטר לדקה עם שיווי משקל קדם-עמודה של 2 מיקרוליטר ושיווי משקל עמודה אנליטי של 5 מיקרוליטר.

לאחר מכן, ייננו את הגליקנים בתנאי MS המפורטים בפרוטוקול הטקסט. פרוטוקול הטיהור מבוסס המסנן הושווה לשיטת מיצוי הפאזה המוצקה הסטנדרטית ושפע הגליקנים בפלזמה שזוהו בין 2 הפרוטוקולים לא היה שונה באופן משמעותי. בשתי השיטות, אותם גליקנים נמצאו קרוב לגבול הזיהוי שבו השונות עולה.

הוערכה ההשתנות עבור תערובות equiM של פלזמה מטוהרת על ידי פרוטוקול מיצוי שלב מוצק מבוסס מסנן או סטנדרטי. לשני הפרוטוקולים היו התפלגויות גאוס שממוצען לא היה שונה באופן משמעותי מאפס. 80 אחוז מהגליקנים נפלו בשינוי כפול.

התפלגות המשקל המולקולרי של הגליקנים שזוהתה בפרוטוקולי הטיהור החדשים והמסורתיים לא הייתה שונה באופן משמעותי וכיסה את אותו טווח. מבחינה איכותית, לא נצפתה הטיה בין גליקנים. חלבוני פלזמה הוכנו על ידי הכנת דגימות סטנדרטיות בעזרת פילטר ופרוטוקולים מרובים בשורה.

מספר החלבונים שזוהו היה דומה עבור הפרוטוקולים השונים. הפחתה לא ספציפית נשלטה בעיכול מיקרוגל ובפרוטוקולי הפרעות עיכול ספייק לפחות מ-10 אחוזים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שתפוסת אתר גליקוזילציה מדויקת מותנית במזעור החשיפה לחום ולזמן.

לאחר השליטה, ניתן להשלים את טיהור ה-N-גליקן המוטבע תוך יומיים. על ידי ביצוע הליך זה, ניתן לשלב ולעצב כימות מדויק של חלבון N-גליקן ותפוסת אתר גליקוזילציה באמצעות טכניקות סטטיסטיות מסדר גבוה יותר. טכניקה זו מאפשרת לקרוא במהירות את השפה המורכבת שהביולוגיה של הסרטן מדברת, להשוות כמותית הבדלים בטיפולי חלבון, ולחשוף באמת את חשיבות הגליקוזילציה בהקשר ביולוגי.