בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון
16 בפברואר 2016
הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד תאי מערכת חיסון מהחניכיים לצורך אפיון מעמיק של התגובות החיסוניות הקשורות לחסינות הפה ולפריודונטיטיס. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של חסינות הפה, כגון אילו גורמים תאיים מעורבים בפתוגנזה של פריודונטיטיס. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת להעריך את רשת תאי המערכת החיסונית בפה ולבודד מספיק תאים חיוניים לבדיקות המשך in-vitro.
כשלב ראשון בפרוטוקול זה, התחל במיקום סיכות כדי לקבע את גופו של העכבר ופתח את חללי בית החזה והבטן כדי לחשוף את הלב ואת האיברים הפנימיים. לאחר מכן, בצע חתך ב-vena cava, והשתמש במזרק של 3-milliliter, המצויד במחט בדרגת 27-gauge, כדי להזרים 3 milliliters של PBS דרך ה-left ventricle. כאשר כל הדם הנדלק, קבע את ראש העכבר על משטח נתיחה, כאשר הבטן פונה כלפי מעלה.
לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לחתוך כל זווית של השפה לכיוון הצוואר, תוך הפרדת העור המכסה את הלסת התחתונה ואזור הצוואר, וחשיפת הרקמות והשרירים שמתחתיהם. חתכו בין השיניים החותכות התחתונות כדי להפריד את שני צדי הלסת התחתונה. קבעו כל צד של הלסת המופרדת באמצעות מחטים במידה 25-gauge כדי לאפשר גישה לחלל הפה.
לאחר זיהוי החך, השתמשו בלהב כירורגי מספר 10 כדי לבצע חיתוכים אנכיים קדמית לטוח השן הטוחנה הראשונה, ואחורית לטוח השן הטוחנה השלישית. לאחר מכן, השתחררו את הרקמה מחלל האף, וכן השתחררו את הבלוקים מהמדבולה. לאחר מכן, הסירו את עודפי הרקמה משולי החניכיים והעבירו את הבלוקים של הלסת העליונה והלסת התחתונה לתוך מבחנה קונית של 50-milliliter המכילה 5 milliliters של collagenase ו-DNase על קרח.
בצעו עיכול של הרקמה באינקובטור עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת, והוסיפו 50 µL של EDTA בריכוז 0.5 M במהלך חמש הדקות האחרונות. לאחר מכן, הוסיפו 5 mL של תווך DNase קר לרקמות, וערבבו בעדינות את תכולת המבחנה על ידי סיבוב. לבסוף, העבירו את ארבעת גושי הרקמה לצחנת פטרי.
כסו אותם ב-500 µL של מצע DNase טרי. השתמשו בסכין ניש तर (scalpel) כדי להסיר את החניכיים מכל גוש רקמה. העבירו את כל תכולת הצלחית למסנן תאים של 70 micron שמונח על גבי מבחנה של 50 mL.
שטפו את צלחת הפטרי ואת המסננת עם 3 עד 5 מיליליטר של מצע DNase טרי. לאחר מכן, השתמשו בבוכנה של מזרק סטרילי בנפח 3 מיליליטר כדי למעוך את רקמת החניכיים אל מול רשת המסננת. שטפו את המסננת עם 30 עד 35 מיליליטר של מצע DNase קר, וסובבו את התסנין בצנטריפוגה.
לאחר מכן, השביו את המשקע ב-1 milliliter של מצע מלא, וקבעו את מספר התאים החיים. הבידוד והעיבוד של תאי מערכת החיסון כפי שהודגמו כעת, מניבים מספר תאים מספיק לביצוע סטימולציה ex-vivo ואפיון של דפוסי הפרשת ציטוקינים של תאי החניכיים הן מבעלי טיפוס בר וגן (wild-type) והן מבעלי רגישות לדלקת חניכיים (periodontitis). למעשה, ניתן לנתח את הרכב תאי מערכת החיסון בחניכיים של עכברים כפי שמוצג בתרשימי הצפיפות הללו, המעריכים את תאי ה-t ותאי ה-natural killer בעכברי LFA knockout הרגישים לדלקת חניכיים.
באמצעות שימוש באסטרטגיות סינון (gating) מתאימות, ניתן לקבוע גם את ייצור הסייטוקינים התו-תאי של תאי T מסוג TCR beta CD4 positive, TCR beta CD8 positive, ו-TCR gamma delta positive, כמו גם של תאי NK ותאים לימפואידיים מולדים (innate lymphoid cells). לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבודד את התאים תוך שלוש שעות לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית, בתנאי שהתהליך מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשלים את כל השלבים ביעילות ובמהירות, ולהקפיד להשאיר את התאים על קרח בכל זמן שבו הם אינם בטיפול.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיון תאים, כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לתפקודם של תתי-אוכלוסיות תאים ספציפיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה לבידוד ואפיון של תאי חיסון מחניכיים של עכברים. שיטה זו נועדה להגביר את ההבנה של החסינות הפהית ושל מחלת הפריודונטיס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של הפה
- פריודונטולוגיה
רקע
- הבנת התגובות החיסוניות בחלל הפה היא קריטית לטיפול במחלות פריודונטליות.
- תאי חיסון בחניכיים ממלאים תפקיד משמעותי בחסינות הפה.
- שיטות נוכחיות עשויות שלא לספק מספיק תאים חיוניים לצורך ניתוח מפורט.
- טכניקה זו שואפת למלא פער זה על ידי מתן אפשרות למחקרים תפקודיים מעמיקים.
מטרת המחקר
- לבידוד תאי מערכת החיסון מהחניכיים לצורך אפיון.
- לבחינת גורמים תאיים המעורבים בפתוגנזה של פריודונטיטיס.
- להערכת רשת תאי מערכת החיסון בחלל הפה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע העכבר וחשיפת האיברים הפנימיים.
- ביצוע חתך ב-vena cava לצורך שטיפת דם.
- שימוש במזרק להזרקה נמרצת של PBS דרך החדר השמאלי.
- הכנת העכבר להמשך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי מערכת חיסון חיוניים מהחניכיים.
- אפיון של תגובות חיסוניות הקשורות לבריאות הפה.
- תובנות לגבי הפתוגנזה של מחלת פריודונטיטיס.
- פוטנציאל למחקרי in-vitro המשכיים.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת כלי בעל ערך לחקר החסינות הפהית.
- היא משפרת את ההבנה של דינמיקת תאי מערכת החיסון ברקמות החניכיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להגיע לתובנות עמוקות יותר לגבי מחלות פריודונטליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד מדויק ואפיון תפקודי של תאי חיסון מחניכיים מאפשרים הפחתת סיכונים מנגנונית באימונולוגיה פהית ותומכים בתיקוף מטרות למחקר של מחלות דלקתיות. תהליך עבודה זה מספק אוכלוסיות תאים בעלות חיוניות גבוהה לצורך פנוטיפיקה כמותית ובדיקות תפקודיות ex vivo, ובכך מחזק את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של גילוי ובמחקרים תרגומיים. הגישה נועדה לסייע בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח באימונולוגיה ובמחקר ופיתוח של בריאות הפה, על ידי מתן אפשרות לבחינה רבדית של רשתות חיסוניות תלויות-רקמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של תת-אוכלוסיות של תאי חיסון המעורבים בפתוגנזה דלקתית פומית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות בדיקות הפרשת ציטוקינים ex vivo.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת תרומתם של תאי חיסון למודלים של מחלות.
- מספק נתונים כמותיים לצורך תיעדוף תיק פיתוח מבוסס היפותזה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תאי חיסון חיוניים בעלי אפיון פנוטיפי לפיתוח בדיקות המשך.
- תומך בהכנה הדירה של דגימות ביולוגיות עבור תהליכי סריקה סטנדרטיים.
- מאפשר קריאות כמותיות של תפקוד חיסוני לצורך הערכת תרכובות.
- משפר את יכולת ההרחבה (scalability) ואת המוכנות של הבדיקה עבור פלטפורמות של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם את אפיוני התאיים החיסוניים עם מודלים אוראליים רלוונטיים למחלה לצורך רצף טרנסלציונלי.
- מאפשר גילוי של ביומרקרים תפקודיים במחקרי אימונופתולוגיה אוראלית פרה-קליניים.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של אסטרטגיות אימונומודולטוריות המכוונות לרקמות אוראליות.
- מספק תובנות מכניסטיות להנחיית בחירת מועמדים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת תכשירים באיכות גבוהה של תאי מערכת החיסון, הן למחקרים מכניסטיים והן לסריקה תפקודית במודלים של מחלות פה.
- ביולוגיה של גילוי: מקדם את בדיקת ההשערות לגבי תפקידי תאי מערכת החיסון בהומאוסטזיס ובפתולוגיה של רקמות הפה.
- סריקה: מספק אוכלוסיות תאים חיות וניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות ובדיקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה כמותית של הפרשת ציטוקינים ופנוטיפים של תאי מערכת החיסון לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי הגילוי לוולידציה פרה-קלינית במודלים של הפה הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית הניתנת להתאמה לתוכניות מחקר מגוונות באימונולוגיה של הפה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים של מערכת החיסון הפהית.
- ערך תפעולי: מספק בידוד סטנדרטי, הדיר וניתן להרחבה של תאי חיסון לצורך השוואה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וקידום יעיל של נכסי אימונולוגיה פהית תוך ניצול אופטימלי של ההון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מטרות וגישות בקווי פיתוח של אימונולוגיה פהית ורירית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של עכברים ובטיפול בתאי מערכת החיסון.
- נדרשת גישה לתשתית של ציטומטריית זרימה ובדיקות תפקודיות ex vivo.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח בידוד תאים ואנליזה ניתנים לשחזור.
- התאמה לרקמות ריריות אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- חיוניות התאים והתנובה רגישות לעיתוי הפרוטוקול ולבקרת הטמפרטורה.
