Name: בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: למדו לבודד ולאפיין תאי חיסון מחניכיים עכבריים לחקר מערכת החיסון הפהית ומחלות חניכיים. השיטה מאפשרת ניתוח תפקודי מעמיק של תאים חיים לחקירת מנגנוני מחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מומנו בחלקם על ידי התוכנית הפנימית של NIDCR (N.M.M) ונתמכו על ידי מלגת Wellcome Trust Stepping Stones (097820/Z/11/B to J.E.K) ועל ידי מענק של המרכז השיתופי של מנצ'סטר לחקר דלקת (ל-J.E.K). המחברים מודים לתרזה ויילד על הביקורת על כתב היד.

כל הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה בעקבות הנחיות נדרשות ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדה השתמשתי, NIDCR / NIH. 1. להכין מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת השלם: RPMI בתוספת 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל ו FBS 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת DNase: 50 מיליליטר של תקשורת RPMI השלים עם 7.5 מיקרוגרם DNase (הפוך טרי, לשמור על הקרח בכל עת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת Collagenase-DNase: 5 מ&quot;ל של התקשורת DNase בתוספת 3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של IV סוג Collagenase (הפוך טריים, לשמור על הקרח בכל עת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מגניב חיץ FACS: 0.5% FBS מדולל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות טרום מגניב עד 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממה שייקר חם 37 ° C. </li></ol> בידוד 2., Dissection, ובידוד התא מפני חניכיים בלוקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי חשיפה אותם ל- CO 2 בתא מתאים, על פי הנחיות AraC. </li> &lt;li&gt; פתח את חלל בית החזה והבטן כדי לחשוף את הלב ואיברים פנימיים. כדי perfuse, עושים חתך את הווריד הנבוב נחות perfuse 3 מ&quot;ל של PBS דרך החדר השמאלי באמצעות מזרק 3 מ&quot;ל עם מחט 27 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את הגוף ואת הראש של עכבר על הכרית עם בטן כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כל שליבה של השפה לכיוון הצוואר במספריים, הפרדת העור שמכסה באזור הלסת התחתונה והצוואר, חשיפת רקמות השרירים הבסיסית. לנתח את השפה התחתונה לחשוף את הלסת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך בין החותכות התחתונות להפריד משני צידי הלסת התחתונה ואת לשתק כל צד לגשת חלל הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו לנתח את החיך משם מחלל האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח אזורים באמצעות 10 להב וכוללים אזורי טוחנת בלסת העליונה mandibular עם הסובבים החניכיים (איור 1). ודא חתכים אנכיים רק קדמי טוחן ואת האחורי הראשונים הטוחן השלישי חתך אופקיהגבול של החניכיים (הצווארון הלבן של השיניים לרקמות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את לסתי וחוסם mandibular צינור חרוטי 50 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל Collagenase / DNase (לשמור על הקרח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ובמהלך הדגירה 5 דקות של האחרון להוסיף 50 μl של 0.5 מ &#39;EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של התקשורת DNase קר אל הצינור 50 מ&quot;ל עם רקמות בעדינות מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את 4 בלוקים של רקמות על צלחת פטרי ולכסות עם 500 μl של התקשורת DNase. סר חניכיימיים מכל גוש הרקמות, באמצעות סכין אזמל ומכוון את הלהב לתוך אזורי החניכיים ו-שיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמות ואת התקשורת מצלחת פטרי כמו גם בתקשורת DNase שהופעלה במהלך לנתיחה, לצינור חדש 50 מ&quot;ל דרך מסננת התא (70 מיקרומטר גודל). לשטוף עם התקשורת DNase (3-5 מ&quot;ל) כל המכשירים המשמשים ולסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בוכנה של מזרק 3 מיליליטר סטרילי, ומועך את הרקמה נגד המסננת,סינון עם התקשורת DNase קר (30 עד 35 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מסננת התא עם תקשורת DNase קרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 4 ° C, 314 XG במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, מחדש להשעות ב 1 מ&quot;ל של מדיה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים (סכום הצפוי צריך לנוע בין 8 x 10 5 כדי 1.2 x 10 6 תאים עם כדאיות של&gt; 80%) באמצעות דלפק תא אוטומטי. </li></ol> 3. גירוי ו FACS צביעת תאים חניכיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את ההשעיה תא בודד עם PMA (50 ng / ml) ו ionomycin (2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בנוכחות של 1 μl / מ&quot;ל ​​של Brefeldin א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 3.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה לשטוף עם PBS ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס; 314 XG במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאים באמצעות כתם כדאי בעקבות ההוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם על סמנים תאיים (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ או נמלהibodies בחירה) בעקבות הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם חיץ צנטריפוגות קר FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת לשבש את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם paraformaldehyde 2% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם חיץ FACS קר, צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות ו כתם ציטוקינים תאיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את צינורות FACS עם תמיסה של saponin 0.5% קר מדולל חיץ צנטריפוגות FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μl של פתרון saponin 0.5% אל צינורות FACS, דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס ואז צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאים עבור סמנים תאיים (IL-17A ו IFNγ או ציטוקינים בחירה) בעקבות הוראות יצרן. שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות saponin 0.5% ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו שוב עם FACSחיץ צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את התאים 300 μl של חיץ FACS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתחו את התוצאות על cytometer הזרימה. </li></ol> 4. ניתוח cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו תאים להיות מנותח על קדימה (FSC) ולפזר בצד (SCC) ושער להוציא פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תאים בודדים עם שטח פיזור קדימה (FSC-A) לעומת פרמטרים גובים (FSC-H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער תאים כי הם חיים (כפי שצוין על ידי מכתים כדאי) וחיוביים עבור + CD45 סמן hematopoietic לניתוח נוסף (איור 2 א ו 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ניתוח של סמנים ספציפיים כפי שמוצג באיור 2 ואיור 3. </li></ol>

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li>
<li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontitis%3A+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li>
<li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis%3A+Keystones%2C+Pathobionts%2C+And+Host+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li>
<li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States%3A+2009+And+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+Errors+In+Immunity%3A+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li>
<li>Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22Current+Protocols+In+Immunology%22">Current Protocols In Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).</li>
<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+Immune+Axis%3A+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

הטכניקה הנוכחית בהצלחה מניבה מספר רב של תאי מערכת חיסון (מתוך עכבר אחת) מתאים, לא רק לאפיון פנוטיפי, אלא גם עבור מחקרים פונקציונליים vivo לשעבר. קבוצה נוספת פרסמה בעבר פרוטוקול לבודד ולאפיין תאים בעכברי חניכיימיים חיסוניים והציגה את שווי השימוש ססגוני cytometry זרימה בחקר חניכיימיים במודלים של בעלי חי 9. בעקבות תקלות ניכר שינוי המפתח בפרוטוקול זה היה לכלול דיסקציה של בלוקים שלמים של רקמות על מנת לכלול בשני התחומים צווארון חניכיים ו החניכיים interdental ...

רקמות חניכיימיים המקיפות את האדם השיניים בעכברים ונחשפות כל זמן אל ביופילם המורכב של שן 1. רשת תא חיסון שיטור מכשול החניכיים היא חיונית לשמירה על שלמות רקמות, הבטחת הומאוסטזיס עם חיידקי commensal מקומיים, בעת ובעונה אחת, מתן חסינות יעיל נגד אתגר פתוגניים 2. כדי להשיג הומאוסטזיס, מערכת החיסונית מותאם בקפידה לסביבת חניכיימיים יצירת רשת תא חיסון בעלי התמחות גבוהה, עדיין קצת בפירוט ידוע של אוכלוסיות תאי חיסון חניכיימיים ותפקידם בשמירת רקמה חסינה 2. כאשר הומאוסטזיס חיסוני מופר על החניכיים, בין אם באמצעות רגישות מארחת מוגברת ו / או נוכחות של קהילות מיקרוביאלי dysbiotic, מצב דלקתי, חניכיימיים עולות 3 4. חניכיים היא מחלה דלקתית נפוצה, שמוביל לאובדן השן sמבני upporting. במקרים חמורים שלה הוא נתפס בתוך כ -10% מכלל אוכלוסיית 5. הביתור הגורמים המרכזיים המעורבים הרגישות חניכיים והתקדמות הוכיחה קשה 6. עם זאת, במודלים של בעלי החיים היו מאוד שימושיים בהבנת מנגנוני חניכת חניכיימיים והתקדמות 7. מודלים יכולים להיות מועסקים על מנת להגדיר את אוכלוסיות תאי מפתח ומתווכים מולקולריים כי הם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס חיסון ופיתוח כונן של מיסב שן. תובנה כזו תהפוך הבנתנו שליטת חניכיימיים הספציפיות של הומאוסטזיס חיסונית לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של בהיווצרות מחלה.

<table><tbody><tr><td>מספריים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל #3</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל #10</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטריליים רסיסים</td><td>אינטגרה Miltex</td><td>6-304</td><td></td></tr><tr><td>מחטים עם שיפוע רגיל&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td>27 גרם, אורך 12.7 מ"מ</td></tr><tr><td>מזרקי מונו-ג'קט</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Luer-lock, 3 מ"ל</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>ללא סידן ומגנזיום</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>לונזה</td><td>12-167F</td><td>ללא L-גלוטמין</td></tr><tr><td>DNase I מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג IV</td><td>ג'יבקו (מבית Life technologies)</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ג'מיני מוצרים ביולוגיים</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>ג'נטמיצין 50 מ"ג/מ"ל</td><td>איכות ביולוגית</td><td>120-098-661EA</td><td></td></tr><tr><td>עט סטרפטוקוקוס</td><td>ג'יבקו (מבית Life technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>ג'יבקו (מבית Life technologies)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ' EDTA pH 8.0</td><td>ביולוגי איכותי</td><td>351-027-721EA</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>352070</td><td>פוליפרופילן, סטרילי</td></tr><tr><td>70 &mu; מסננות תאים M</td><td>קורנינג</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>קורנינג</td><td>351029</td><td>סטריליות</td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות FACS</td><td>קורנינג</td><td>352052</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>מכיל תמיסת ברפלדין A פורבול</td></tr><tr><td>12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>מלח סידן יונומיצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909</td><td></td></tr><tr><td>Saponin מקליפת quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים</td> Aqua <td>Dead Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר גמא דלתא TCR FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5711-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר IL-17A APC</td><td>eBioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר IFN-&gamma; PE</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר NK1.1 PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD90.2 APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0902-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD3e FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD19 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11b FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11c FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר TCR beta FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Ly-6G FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Ly-6C FITC</td><td>BD פארמינגן</td><td>553104</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

רשתות תאי מערכת החיסון ברקמות ממלאות תפקיד חיוני בתיווך חסינות מקומית ובשמירה על הומאוסטזיס של רקמות, אך מעט ידוע על אוכלוסיות תאי החיסון השוכנות ברירית הפה ובחניכיים. הקמנו טכניקה לבידוד ומחקר של תאים חיסוניים מרקמות חניכיים של עכברים, אזור של חשיפה מיקרוביאלית מתמדת ואתר פגיע למחלה דלקתית נפוצה, דלקת חניכיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר אפיון פנוטיפי מפורט של אוכלוסיות תאי החיסון השוכנות בחניכיים, גם במצב יציב. ההליך שלנו מניב גם מספיק תאים עם כדאיות גבוהה לשימוש במחקרים פונקציונליים, כגון הערכת הפרשת ציטוקינים ex vivo. שילוב זה של אפיון פנוטיפי ותפקודי של רשת תאי חיסון החניכיים אמור לסייע בחקירת המנגנונים המעורבים בחסינות אוראלית ובהומאוסטזיס חניכיים, אך גם יקדם את הבנתנו את המנגנונים המעורבים באימונופתולוגיה מקומית.

כדי להמחיש יישום של פרוטוקול, אנו מציגים תוצאות נציג לבחינת הרשת התא החיסונית החניכיים של עכברים עם ובלי חניכיים (WT לעומת LFA - / -, איור 2 א - ג). מגרשי FACS נציג להראות תאי CD45 + hematopoietic חי החניכיים (איור 2 א, 2 ג). בידוד ועיבוד של תאי מערכת החיסון עם פרוטוקול זה מניב מספיק תאים כדי לבצע vivo לשעבר גירוי ואפיון דפוסי הפרשת ציטוקינים. כאן אנו...

הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד תאי מערכת חיסון מהחניכיים לצורך אפיון מעמיק של התגובות החיסוניות הקשורות לחסינות הפה ולפריודונטיטיס. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של חסינות הפה, כגון אילו גורמים תאיים מעורבים בפתוגנזה של פריודונטיטיס. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת להעריך את רשת תאי המערכת החיסונית בפה ולבודד מספיק תאים חיוניים לבדיקות המשך in-vitro.כשלב ראשון בפרוטוקול זה, התחל במיקום סיכות כדי לקבע את גופו של העכבר ופתח את חללי בית החזה והבטן כדי לחשוף את הלב ואת האיברים הפנימיים. לאחר מכן, בצע חתך ב-vena cava, והשתמש במזרק של 3-milliliter, המצויד במחט בדרגת 27-gauge, כדי להזרים 3 milliliters של PBS דרך ה-left ventricle. כאשר כל הדם הנדלק, קבע את ראש העכבר על משטח נתיחה, כאשר הבטן פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לחתוך כל זווית של השפה לכיוון הצוואר, תוך הפרדת העור המכסה את הלסת התחתונה ואזור הצוואר, וחשיפת הרקמות והשרירים שמתחתיהם. חתכו בין השיניים החותכות התחתונות כדי להפריד את שני צדי הלסת התחתונה. קבעו כל צד של הלסת המופרדת באמצעות מחטים במידה 25-gauge כדי לאפשר גישה לחלל הפה.לאחר זיהוי החך, השתמשו בלהב כירורגי מספר 10 כדי לבצע חיתוכים אנכיים קדמית לטוח השן הטוחנה הראשונה, ואחורית לטוח השן הטוחנה השלישית. לאחר מכן, השתחררו את הרקמה מחלל האף, וכן השתחררו את הבלוקים מהמדבולה. לאחר מכן, הסירו את עודפי הרקמה משולי החניכיים והעבירו את הבלוקים של הלסת העליונה והלסת התחתונה לתוך מבחנה קונית של 50-milliliter המכילה 5 milliliters של collagenase ו-DNase על קרח.בצעו עיכול של הרקמה באינקובטור עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת, והוסיפו 50 µL של EDTA בריכוז 0.5 M במהלך חמש הדקות האחרונות. לאחר מכן, הוסיפו 5 mL של תווך DNase קר לרקמות, וערבבו בעדינות את תכולת המבחנה על ידי סיבוב. לבסוף, העבירו את ארבעת גושי הרקמה לצחנת פטרי.כסו אותם ב-500 µL של מצע DNase טרי. השתמשו בסכין ניש तर (scalpel) כדי להסיר את החניכיים מכל גוש רקמה. העבירו את כל תכולת הצלחית למסנן תאים של 70 micron שמונח על גבי מבחנה של 50 mL.שטפו את צלחת הפטרי ואת המסננת עם 3 עד 5 מיליליטר של מצע DNase טרי. לאחר מכן, השתמשו בבוכנה של מזרק סטרילי בנפח 3 מיליליטר כדי למעוך את רקמת החניכיים אל מול רשת המסננת. שטפו את המסננת עם 30 עד 35 מיליליטר של מצע DNase קר, וסובבו את התסנין בצנטריפוגה.לאחר מכן, השביו את המשקע ב-1 milliliter של מצע מלא, וקבעו את מספר התאים החיים. הבידוד והעיבוד של תאי מערכת החיסון כפי שהודגמו כעת, מניבים מספר תאים מספיק לביצוע סטימולציה ex-vivo ואפיון של דפוסי הפרשת ציטוקינים של תאי החניכיים הן מבעלי טיפוס בר וגן (wild-type) והן מבעלי רגישות לדלקת חניכיים (periodontitis). למעשה, ניתן לנתח את הרכב תאי מערכת החיסון בחניכיים של עכברים כפי שמוצג בתרשימי הצפיפות הללו, המעריכים את תאי ה-t ותאי ה-natural killer בעכברי LFA knockout הרגישים לדלקת חניכיים.באמצעות שימוש באסטרטגיות סינון (gating) מתאימות, ניתן לקבוע גם את ייצור הסייטוקינים התו-תאי של תאי T מסוג TCR beta CD4 positive, TCR beta CD8 positive, ו-TCR gamma delta positive, כמו גם של תאי NK ותאים לימפואידיים מולדים (innate lymphoid cells). לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבודד את התאים תוך שלוש שעות לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית, בתנאי שהתהליך מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשלים את כל השלבים ביעילות ובמהירות, ולהקפיד להשאיר את התאים על קרח בכל זמן שבו הם אינם בטיפול.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיון תאים, כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לתפקודם של תתי-אוכלוסיות תאים ספציפיות.

isolation-characterization-functional-examination-gingival-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים פונקציונלי מהלב מספק אלטרנטיבה בשיטות המקובלות של collagenase העיכול, מה שגורם לתא רצויות הפעלת המערכת החיסונית, וכתוצאה מכך תגובה לירידה של תאים אלה. השיטה שלנו של בידוד התשואות תפקודית תאים חיסוניים לב על ידי הימנעות בעיות הקשורות עיכול אנזימטי.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

סרטון זה מדגים את הליך הבידוד של רשת תאי החיסון של חניכיים ממודל עכבר. העיכול האנזימטי משחרר את רקמת החניכיים מהשיניים והעצם המצורפות, אשר מתעכלת באופן מכני נוסף, ומשחרר תאים חיסוניים מהחניכיים. התאים המבודדים מוכנים לניסויים אימונולוגיים.

בידוד רשת תאי מערכת החיסון של חניכיים מחסימות שיניים מורין

מחקר זה מתאר טכניקה יעילה לבודד ולעבד את רקמות חניכיים מחלל הפה בעכבר על מנת לייצר תרבות מתא בודד. תאי כתוצאה מכך יכולים להיות בשימוש נוסף לניתוח cytometry זרימה ומחקרים מולקולריים.

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים: האחד למדידת חיידקים אנאירוביים שיכולים לפלוש ולשרוד בהצלחה בתוך המארח, והשני לדמיין חיידקים אנאירוביים מקיימים אינטראקציה עם תאים מארחים. ניתן ליישם מחקר זה על כל אנאירובי הניתן לעיבוד וכל סוג תא אוקריוטי.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית.

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

המטרה של הפרוטוקול היא לבנות מודל של דלקת חניכיים אנושי בתוך חוץ גופית. מודל זה רקמות מטפחת שיתוף שלושה סוגים של תאים אנושיים, HaCaT keratinocytes, fibroblasts חניכיים ו מקרופאגים THP-1, בתנאים תלת מימדי. מודל זה ניתן להחיל כדי לחקור מחלות חניכיים, כגון דלקת חניכיים, חניכיים.

תלת מימדי רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים באופן ברור מבני אדם בריאים שעברו ניתוח שקדים ניתוחים חלקיים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית.

בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal

כאן אנו מציגים שיטה מותאמת לבידוד ולתרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים על ידי הוספת מעכב הסלע, Y-27632, לשיטה המסורתית. שיטה זו קלה יותר, גוזלת פחות זמן, משפרת את תכונות תאי הגזע ומייצרת מספר גדול יותר של תאי אפיתל בעלי פוטנציאל גבוה הן עבור המעבדה והן עבור יישומים קליניים.

בידוד ותרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים ראשוניים באמצעות Y-27632

הפרוטוקול הנוכחי מציג שיטה מהירה, יעילה ועדינה לבידוד תאים בודדים המתאימים לניתוח RNA-seq חד-תאי משיניים שיניים חד-תאיות של עכבר, שיניים שיניים לבנות עכבר ושיניים אנושיות הגדלות ללא הרף.

בידוד מהיר של תאים בודדים מעכבר ושיניים אנושיות

תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 (ILC2s), המעורבים בדלקת מסוג 2, משתתפים בעיקר בתגובה לזיהום הלמינת'ס, מחלות אלרגיות, הומאוסטזיס מטבולי ותיקון רקמות. במחקר זה מודגם הליך לבידוד ILC2s מרירית האף וזיהוי הביטוי של CD226.

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

מטרת הפרוטוקול היא לספק גישה סטנדרטית להערכה כמותית של שלמות מחסום האפיתל החניכיים בעכברים על ידי יישום מקומי של דקסטרנים מסומנים בפלואורסצנציה בגדלים מולקולריים משתנים על פני החניכיים ב-vivo, ואחריהם הדמיה אקס-ביבו באמצעות מערכת מיקרוסקופיה של פוטון יחיד.

הערכה פונקציונלית של מחסום אפיתל חניכיים בעכברים באמצעות מעקבים פלואורסצנטיים

למדו לבודד ולאפיין תאי חיסון מחניכיים עכבריים לחקר מערכת החיסון הפהית ומחלות חניכיים. השיטה מאפשרת ניתוח תפקודי מעמיק של תאים חיים לחקירת מנגנוני מחלות.

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

גלה סרטונים נוספים