בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון
16 בפברואר 2016
הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד תאי חיסון חניכיים לאפיון מעמיק של התגובות החיסוניות הקשורות לחסינות הפה ודלקת חניכיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חסינות הפה, כגון אילו גורמים תאיים מעורבים בפתוגנזה של דלקת חניכיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בכך שהיא מאפשרת הערכה של רשת תאי החיסון האוראלי ובידוד של מספיק תאים ברי קיימא לחקירות חוץ גופיות במורד הזרם.
כצעד ראשון בפרוטוקול זה, התחל בהנחת סיכות כדי לשתק את גוף העכבר ולפתוח את חללי בית החזה והבטן כדי לחשוף את הלב והאיברים הפנימיים. לאחר מכן, בצע חתך בווריד הנבוב, והשתמש במזרק של 3 מיליליטר, המצויד במחט בגודל 27, כדי להשקיע 3 מיליליטר PBS דרך החדר השמאלי. לאחר שכל הדם נשטף, הצמד את ראש העכבר למשטח ניתוח, כשהבטן פונה כלפי מעלה.
לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך כל קומיסורה של השפה לכיוון הצוואר, להפריד את העור המכסה את אזור הלסת התחתונה והצוואר, ולחשוף את הרקמות והשרירים הבסיסיים. חותכים בין החותכות התחתונות כדי להפריד בין שני צידי הלסת התחתונה. קבעו כל צד של הלסת התחתונה המופרדת בעזרת מחטים בגודל 25 כדי לגשת לחלל הפה.
לאחר זיהוי החיך, השתמש בלהב כירורגי מספר 10 כדי לבצע חתכים אנכיים ממש קדמיים לטוחנת הראשונה, ואחוריים לטוחנת השלישית. ואז לנתח את הרקמה הרחק מחלל האף, וגם לנתח את הבלוקים מהלסת התחתונה. לאחר מכן הסר את הרקמה העודפת מגבול החניכיים והעביר את הבלוקים הלסתיים והלסת התחתונה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר קולגנאז ו- DNase על קרח.
עכל את הרקמה באינקובטור שייקר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה, והוסף 50 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולארי במהלך חמש הדקות האחרונות. לאחר מכן הוסף 5 מיליליטר של מדיום DNase קר לרקמות, וערבב בעדינות את תוכן הצינור על ידי מערבולת. לאחר מכן, העבירו את ארבעת גושי הרקמה לצלחת פטרי.
ומכסים אותם ב -500 מיקרוליטר של מדיום DNase טרי. השתמש באזמל כדי להסיר את החניכיים מכל גוש רקמה. והעבירו את כל תכולת המנה למסננת תאים של 70 מיקרון על גבי צינור של 50 מיליליטר.
שוטפים את צלחת הפטרי והמסננים עם 3 עד 5 מיליליטר מדיום DNase טרי. ואז השתמש בבוכנה של מזרק סטרילי של 3 מיליליטר כדי לרסק את רקמת החניכיים כנגד רשת המסננת. שוטפים את המסננת עם 30 עד 35 מיליטרים של מדיום DNase קר, וצנטריפוגה את המסנן.
לאחר מכן השעו מחדש את החך במיליליטר אחד של מדיום שלם, וקבעו את מספר התאים הקיימאים. הבידוד והעיבוד של תאי מערכת החיסון כפי שהודגם זה עתה, מניב מספר מספיק של תאים כדי לבצע גירוי ex-vivo ואפיון של דפוסי הפרשת ציטוקינים של תאי חניכיים הן מבעלי חיים פראיים והן מבעלי חיים רגישים לדלקת חניכיים. ואכן, ניתן לנתח את הרכב תאי חיסון החניכיים של העכברים כפי שמודגם בתרשים צפיפות אלה המעריכים את תאי ה-t ותאי ההרג הטבעיים בעכברי נוקאאוט LFA רגישים לדלקת חניכיים.
באמצעות אסטרטגיות השער המתאימות, ניתן לקבוע גם את ייצור הציטוקינים התוך תאיים של תאי TCR beta CD4 חיוביים, TCR beta CD8 חיובי ו-TCR גמא דלתא חיוביים, כמו גם NK, ותאי לימפה מולדים. לאחר השליטה, ניתן לבודד את התאים תוך שלוש שעות לצביעה חיסונית אם הטכניקה מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשלים את כל השלבים ביעילות ובמהירות, תוך שמירה על התאים על הקרח בכל פעם שהם לא עוברים מניפולציה.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מיון תאים, כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לתפקוד של תת-קבוצות התאים הספציפיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג טכניקה לבידוד ואפיון תאי חיסון מחניכיים של עכבר. השיטה שואפת לשפר את ההבנה של חסינות דרך הפה ודלקת חניכיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה דרך הפה
- פריודונטולוגיה
רקע
- הבנת תגובות החיסון בחלל הפה חיונית להתמודדות עם מחלות חניכיים.
- תאי חיסון בחניכיים משחקים תפקיד משמעותי בחסינות דרך הפה.
- שיטות עכשוויות עשויות שלא לספק מספיק תאים בריאים לניתוח מפורט.
- טכניקה זו שואפת למלא את הפער על ידי אפשרות למחקרים פונקציונליים מעמיקים.
מטרת המחקר
- לבודד תאי חיסון מחניכיים לצורך אפיון.
- לחקור גורמים תאיים המעורבים בפתוגנזה של דלקת חניכיים.
- להעריך את רשת תאי החיסון דרך הפה.
שיטות ששימשו
- השבתת העכבר וחשיפת האיברים הפנימיים.
- חתך בווריד הנבוב לצורך שטיפת דם.
- שימוש בזריקה לשטיפת PBS דרך החדר השמאלי.
- הכנת העכבר לניתוח נוסף.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי חיסון בריאים מחניכיים.
- אפיון של תגובות חיסון הקשורות לבריאות הפה.
- תובנות לגבי הפתוגנזה של דלקת חניכיים.
- פוטנציאל לחקירות נוספות in-vitro.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת כלי חשוב לחקר חסינות דרך הפה.
- היא משפרת את ההבנה של הדינמיקה של תאי חיסון ברקמות החניכיים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל את השיטה הזו להבנה עמוקה יותר של מחלות חניכיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Precise isolation and functional profiling of gingival immune cells enables mechanistic de-risking in oral immunology and supports target validation for inflammatory disease research. This workflow provides high-viability cell populations for quantitative phenotyping and ex vivo functional assays, strengthening predictive confidence in early discovery and translational studies. The approach is positioned to inform portfolio decisions in immunology and oral health R&D by enabling robust interrogation of tissue-resident immune networks.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell subsets implicated in oral inflammatory pathogenesis.
- Supports functional target validation through ex vivo cytokine secretion assays.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying immune cell contributions to disease models.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers viable, phenotypically characterized immune cells for downstream assay development.
- Supports reproducible preparation of biological samples for standardized screening workflows.
- Enables quantitative readouts of immune function for compound evaluation.
- Improves scalability and assay readiness for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant oral models for translational continuity.
- Enables functional biomarker discovery in preclinical oral immunopathology studies.
- Supports risk-adjusted advancement of immunomodulatory strategies targeting oral tissues.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality immune cell preparations for both mechanistic studies and functional screening in oral disease models.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on immune cell roles in oral tissue homeostasis and pathology.
- Screening: Supplies reproducible, viable cell populations for assay development and compound testing.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cytokine secretion and immune cell phenotypes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in disease-relevant oral models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse oral immunology research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in oral immune research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable immune cell isolation for cross-study comparability.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of oral immunology assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and approaches in oral and mucosal immunology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and immune cell handling.
- Demands access to flow cytometry and ex vivo functional assay infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible cell isolation and analysis.
- Adaptation to other mucosal tissues may require protocol optimization.
- Cell viability and yield are sensitive to procedural timing and temperature control.
