התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS
April 13th, 2016
Size exclusion chromatography עם פלזמה מצומדת אינדוקטיבית - ספקטרומטריית מסה (ICP-MS) היא כלי רב עוצמה למדידת שינויים בשפע של מטאלופרוטאינים ישירות מדגימות ביולוגיות. כאן אנו מתארים קבוצה של תקני מטאלופרוטאין המשמשים להערכת המסה המולקולרית וכמות המתכת הקשורה לחלבונים לא ידועים.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא להיות מסוגל לכמת מטאלופרוטאינים שונים בתקנים מורכבים המבוססים על שימוש בתקני מטאלופרוטאין ידועים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידן של מתכות בביולוגיה. לדוגמה, כיצד משתנה מצב המתכת של חלבון במחלה?
יתרון מרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למדוד את מצב המתכת של חלבון במצבו המקורי. תדגים את הטכניקה אמבר לותיאן, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, רקמה הומוגנית, או דגימות תרבית תאים, על ידי הורדה ידנית או סוניקציה למשך חמש דקות באמצעות תמיסת מלח חוצצת Tris.
הבהירו הומוגנטים על ידי צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G, למשך חמש דקות. לאחר איסוף הסופרנטנט שנוצר, נרמל את הכמות הכוללת של החלבון על ידי קביעת ריכוזי החלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לחמם ולכוונן את ספקטרומטור הפלזמה המשולב באופן אינדוקטיבי, באמצעות פרוטוקולי היצרן.
לדלל את תקני המטאלופרוטאין כדי ליהנות מהנפילה בטווח של אפס עד 500 מיקרוגרם לליטר, תוך שימוש באחוז אחד של חומצה חנקתית. כדי להשיג סטנדרטים בטווח זה, אל תשתמש בדילולים העולים על אחד ו -20. הגדר את סדר ההזרקות על ידי ניתוח תחילה של שבע רמות הכיול.
ריכוזים הנעים בין אפס ל-500 מיקרוגרם לליטר, ואחריהם תקני המטאלופרוטאין. שבע רמות הכיול הן אפס, אחת, חמש, עשר, 50, 100 ו-500 מיקרוגרם לליטר. לאחר מכן, בחר אלמנטים מעניינים.
כאן, השתמש בברזל, נחושת, אבץ, קובלט ויוד. מכיוון שהם היסודות שתקני החלבון מחויבים אליהם. בחר את האלמנטים בשיטת הרכישה על ידי פתיחת לשונית בורר האלמנטים, והוספת האלמנטים ומסות האיזוטופים שלהם שיש לנתח.
לאחר מכן, בצע ניתוח מדגם עם המכשיר. תוכנת המכשיר יוצרת אוטומטית את עקומות הכיול עבור כל אחד מהאלמנטים המנותחים. השתמש בעקומות הכיול כדי לקבוע את ריכוז המתכת בדגימות הלא ידועות.
מתוצאות הניתוח בתפזורת, צור את תקני המטאלופרוטאין הכוללים את שלושת יסודות הקורט הנפוצים ביותר ברקמות יונקים באמצעות תערובת של נחושת, אבץ, סופראוקסיד דיסמוטאז ופריטין. נקה את הכרומטוגרפיה המהירה של hyperformance, או משאבות HPLC, עם מאגר אמוניום חנקתי של 200 מילי-מולרי למשך חמש דקות בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה. לאחר טיהור המערכת, הגדר את קצב הזרימה לנקודת אפס מיליליטר לדקה.
וחבר את עמודת ההרחקה של הצד. חבר את הקצה הנגדי של העמודה לגלאי UV, הגדר את ספיגת המדידה על 280 ננומטר, באמצעות צינורות שיא. הגדל בהדרגה את קצב הזרימה של העמודה במרווחים של נקודת אפס מיליליטר לדקה, עד להגעה לקצב זרימה סופי של נקודת אפס ארבעה מיליליטר לדקה.
בזמן שזה קורה, בדוק את חיבורי הצינורות לעמודה לאיתור נזילות. עקוב אחר הלחץ של מערכת זו כדי לוודא שהיא אינה חורגת מדרישות העמודה על ידי התבוננות בעקבות הלחץ על הכרומטוגרמה בתוכנה. השאר את העמודה לאיזון בקצב הזרימה הנדרש על פני חמישה עד 10 נפחי עמודות.
לאחר שיווי המשקל, חבר את המכשירים כדי לאפשר ניתוח דגימה. הגדר את שיטת HPLC לשאיבת מאגר A מעל העמודה בנקודת אפס ארבעה מיליליטר לדקה, למשך 15 דקות. הכנס את ה-ICPMS למצב המתנה לפני שינוי הגדרת החומרה.
ברגע שאתה במצב המתנה, כבה את התקשורת עבור הדגימה האוטומטית ושנה את מבוא הדגימה לאחר. השתמש בצינורות PEEK כדי לחבר את הזרימה מגלאי ה-UV ישירות לנבולייזר ב-ICPMS. הפעל את ה-ICPMS ואפשר למכשיר להתחמם במשך 10 עד 20 דקות.
לאחר שהפלזמה נדלקה, חבר את הכבל המרוחק מה-ICPMS לחלק האחורי של הדגימה האוטומטית של HPLC. עשה זאת לאחר שהפלזמה נדלקה. אחרת, מערכת ה-HPLC תיכבה אוטומטית, מכיוון שה-ICPMS אינו פועל.
שנה את שיטת ICPMS לאיסוף נתונים עבור LC ICPMS על ידי שינוי שיטת הרכישה מספקטרום לרכישת פתרון זמן. לאחר מכן, בחר את האלמנטים לניתוח. ברזל, נחושת, אבץ, קובלט, יוד, כמו גם כל מרכיב אחר מעניין, וקביעת זמני אינטגרציה.
לאחר בחירת האלמנטים המעניינים, התאם את זמן הרכישה כך שיתאים לזמן הריצה של הכרומטוגרפיה. כוונן ידנית את ה-ICPMS עבור רגישות וקצבי זרימת גז הליום של תאי התנגשות עם מאגר כרומטוגרפיה הזורם עם צזיום ואנטימון הכלולים במאגר. לאחר שספירת יוני המתכת התייצבה, וערכי סטיית התקן היחסיים נמוכים מחמישה אחוזים, המערכת מוכנה לשימוש.
צור רשימות הפעלה לדוגמה הן בתוכנות HPLC והן ב-ICPMS. רשימת ההפעלה לדוגמה מכילה את הסדר שבו יש להזריק כל אחת מהדגימות. כמו גם השם שלפיו יישמרו הנתונים.
בדוק שהמספר הכולל של הדגימות ברשימה תואם בין שתי התוכניות. התחל את אצווה הדגימה עבור ה-ICPMS לפני ה-HPLC, שכן הזרקת הדגימה על ידי ה-HPLC תפעיל את ה-ICPMS להתחיל לאסוף נתונים. אם זה לא נעשה בסדר הנכון, זה יגרום לנתונים חסרים.
צור נקודות עקומת כיול על ידי הזרקת נפחים משתנים של תקן מעורב סופראוקסיד דיסמוטאז ופריטין. נפחי ההזרקה נעים בין מיקרוליטר אחד ל-30 מיקרוליטר. לבסוף, נתח כל אחת מהדגימות הלא ידועות, כגון רקמה, פלזמה או תרבית תאים, לפני ניתוח הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
מוצגת אשליית הפריטין בטווח של 2000 עד 60,000 פיקוגרם של ברזל שהוזרקו על העמוד. ניתוח רגרסיה בוצע באמצעות שטח שיא. פרופילי האשליה עבור נחושת, אבץ, סופראוקסיד דיסמוטאז מוצגים הן עבור נחושת והן עבור אבץ.
ניתוחי הרגרסיה שנוצרו באמצעות אזורי שיא מוצגים גם הם. תוצאות ניתוח הרגרסיה משמשות להמרת הנתונים הגולמיים בספירות לשנייה לפיקוגרמות לשנייה. כך שניתן לקבוע את כמות המתכת הקשורה לחלבון באופן כמותי.
ניתן להשתמש בטכניקה זו לזיהוי מטאלופרוטאינים בדגימות ביולוגיות מורכבות. כאן, מוח אנושי מופרד על ידי SEC ICPMS. כל אחד מהם מייצג מתכת מעניינת אחרת.
כלומר, נחושת, אבץ או ברזל. מוצגים כאן, העקבות המתקבלים כאשר פלזמה אנושית נתונה לטכניקה זו. המורכבות והשפע של הדגימה ישפיעו על מספר הפסגות שנראות.
כצפוי, הפלזמה נשלטת על ידי כמה מטאלופרוטאונים, כולל סרולופלסמין וטרנספרין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר מכשיר, כדי למדוד את המצב המקורי של מטאלופרוטאינים בדגימות מורכבות. לאחר שליטה, ניתן ליישם טכניקה זו בהצלחה תוך שלוש עד ארבע שעות.
זה מאפשר לנתח 20 עד 36 דגימות ביום אחד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בתקני המטאלופרוטאין המתאימים, כגון נחושת אבץ SOD אם אתה מעוניין בנחושת ואבץ. כמו גם התקנים הפנימיים במאגר, כגון צזיום, המאפשרים לתקן כל סחיפה במכשיר לאורך זמן.
בעקבות הליך זה, אתה יכול גם ליישם צורות אחרות של ספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות חשובות. כגון, מהם המטאלופרוטאינים הקיימים בדגימה שלי? ניתן לעשות זאת על ידי נסיעות סטנדרטיות בעיכול וריצוף פפטידים של חלבון מפרט המוני.
או, על ידי ניתוח החלבונים בטקט, במצבם הטבעי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטאומיקה להבין את תפקידם של מטאלופרוטאינים במחלות, כמו מחלת אלצהיימר. אל תשכח שעבודה עם חומצה חנקתית מרוכזת, ודגימות קליניות.
יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לכימות מטלופרוטאינים באמצעות כרומטוגרפיה של הדרה גודלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה של פלזמה מצמדת אינדוקטיבית (ICP-MS). הטכניקה מאפשרת מדידת מצב המתכת בחלבונים מדגימות ביולוגיות, ומספקת תובנות לגבי תפקידיהם בתהליכים ביולוגיים שונים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- כימיה אנליטית
- פרוטאומיקה
רקע
- מטלופרוטאינים ממלאים תפקידים קריטיים במערכות ביולוגיות.
- הבנת מצב המתכת בחלבונים יכולה לחשוף תובנות לגבי מנגנוני מחלות.
- שיטות מסורתיות עשויות לא למדוד חלבונים במצבם הטבעי.
- ICP-MS מספק רגישות וספציפיות גבוהות לניתוח מתכות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לכימות מטלופרוטאינים.
- לבסס סטנדרטים להערכת מסה מולקולרית ותכולת מתכת.
- לנתח את מצב המתכת של חלבונים בדגימות ביולוגיות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת סטנדרטים של מטלופרוטאינים והומוגניזציה של דגימות.
- כרומטוגרפיה של הדרה גודלית להפרדת חלבונים.
- ספקטרומטריית מסה של פלזמה מצמדת אינדוקטיבית לכימות מתכות.
- עקומות כיול שנוצרו למדידה מדויקת של ריכוזי מתכות.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של מטלופרוטאינים מדגימות ביולוגיות שונות.
- בסיס עקומות כיול עבור מספר מתכות של עניין.
- הוכחת יכולת השיטה לנתח חלבונים במצבם הטבעי.
- תובנות לגבי תפקיד המתכות בתהליכים ביולוגיים ובמחלות.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לחקר מטלופרוטאינים.
- היא מספקת מסגרת למחקרים עתידיים על אינטראקציות מתכת-חלבון.
- יישומים נוספים יכולים לשפר את ההבנה של מטלופרוטאינים בבריאות ובמחלות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative metalloproteomic analysis using SEC-ICP-MS enables biopharma R&D to measure metal-protein interactions in native states, supporting target validation in neurodegenerative disease research. This approach provides predictive confidence by linking trace element imbalances to protein function, informing mechanistic de-risking in Alzheimer's and Parkinson's disease programs. The method facilitates portfolio triage through reproducible, quantitative outputs that clarify metalloprotein abundance changes across disease-relevant biological systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by quantifying metalloprotein abundances in disease versus control samples.
- Operational Value: Establish trace element-specific calibration curves using copper-zinc SOD and ferritin standards for iron, copper, and zinc quantification.
- Strategic Value: Enable biological de-risking through native-state metal status measurement, reducing uncertainty in target engagement assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated biological systems for downstream workflows by resolving metalloproteins via size exclusion prior to ICP-MS detection.
- Operational Value: Address assay standardization and reproducibility through internal standardization with cesium and antimony in chromatography buffer.
- Strategic Value: Highlight screening readiness and platform reuse by enabling 20-36 sample analyses per day after system equilibration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discuss disease relevance by analyzing human brain and plasma samples to identify metalloprotein peaks linked to copper, zinc, and iron.
- Operational Value: Describe continuity from discovery through preclinical validation by using peak area regression to convert raw counts to picograms per second for quantitative comparison.
- Strategic Value: Address risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative outputs that support go/no-go criteria in metalloprotein-targeted programs.
Pipeline & Workflow Integration
Position SEC-ICP-MS within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, where quantitative metalloprotein data informs target confidence and assay readiness.
- Discovery Biology: Explain how the method supports hypothesis testing by measuring metal status changes in proteins under disease conditions using calibrated trace element detection.
- Screening: Describe assay readiness through reproducible SEC separation and element-specific quantification enabled by external calibration curves.
- Analytics: Highlight measurements and readouts such as peak area conversion to picograms per second, enabling cross-sample comparison of metalloprotein abundance.
- Translational Research: Connect the method to preclinical continuity by demonstrating applicability to human brain and plasma samples for disease-relevant target validation.
- Enterprise Reuse: Frame the method as a reusable capability through standardized hardware setup, software acquisition methods, and sample run list synchronization between HPLC and ICPMS platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative metalloprotein analysis in native state.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via cesium-antimony internal standards and fixed flow rate protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by clarifying metal-protein relationships early in discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions supported by quantitative metalloprotein abundance data across biological systems.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in metalloprotein biochemistry, HPLC operation, and ICP-MS optimization for trace element analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including size exclusion column, UV detector at 280 nm, and ICP-MS with time-resolved acquisition mode.
- Cross-team standardization requirements for sample preparation, normalization by total protein concentration, and injection volume calibration from 1 to 30 microliters.
- Adaptation considerations across model systems such as tissue homogenization, cell culture preparation, and plasma analysis using appropriate metalloprotein standards.
- Practical limitations supported by source material including the need to avoid dilutions exceeding 1:20 for standards and monitor system pressure to prevent column damage during equilibration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Bulk Analysis of Metalloprotein Standards using Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (ICP-MS)
2:41
HPLC System Setup and Size Exclusion Chromatography Column Equilibration
4:00
Setting Up and Running Size Exclusion - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (SEC-ICP-MS)
6:41
Results: Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS
8:25
Conclusion
