התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא להיות מסוגל לכמת מטאלופרוטאינים שונים בתקנים מורכבים המבוססים על שימוש בתקני מטאלופרוטאין ידועים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידן של מתכות בביולוגיה. לדוגמה, כיצד משתנה מצב המתכת של חלבון במחלה?

יתרון מרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למדוד את מצב המתכת של חלבון במצבו המקורי. תדגים את הטכניקה אמבר לותיאן, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, רקמה הומוגנית, או דגימות תרבית תאים, על ידי הורדה ידנית או סוניקציה למשך חמש דקות באמצעות תמיסת מלח חוצצת Tris.

הבהירו הומוגנטים על ידי צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G, למשך חמש דקות. לאחר איסוף הסופרנטנט שנוצר, נרמל את הכמות הכוללת של החלבון על ידי קביעת ריכוזי החלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לחמם ולכוונן את ספקטרומטור הפלזמה המשולב באופן אינדוקטיבי, באמצעות פרוטוקולי היצרן.

לדלל את תקני המטאלופרוטאין כדי ליהנות מהנפילה בטווח של אפס עד 500 מיקרוגרם לליטר, תוך שימוש באחוז אחד של חומצה חנקתית. כדי להשיג סטנדרטים בטווח זה, אל תשתמש בדילולים העולים על אחד ו -20. הגדר את סדר ההזרקות על ידי ניתוח תחילה של שבע רמות הכיול.

ריכוזים הנעים בין אפס ל-500 מיקרוגרם לליטר, ואחריהם תקני המטאלופרוטאין. שבע רמות הכיול הן אפס, אחת, חמש, עשר, 50, 100 ו-500 מיקרוגרם לליטר. לאחר מכן, בחר אלמנטים מעניינים.

כאן, השתמש בברזל, נחושת, אבץ, קובלט ויוד. מכיוון שהם היסודות שתקני החלבון מחויבים אליהם. בחר את האלמנטים בשיטת הרכישה על ידי פתיחת לשונית בורר האלמנטים, והוספת האלמנטים ומסות האיזוטופים שלהם שיש לנתח.

לאחר מכן, בצע ניתוח מדגם עם המכשיר. תוכנת המכשיר יוצרת אוטומטית את עקומות הכיול עבור כל אחד מהאלמנטים המנותחים. השתמש בעקומות הכיול כדי לקבוע את ריכוז המתכת בדגימות הלא ידועות.

מתוצאות הניתוח בתפזורת, צור את תקני המטאלופרוטאין הכוללים את שלושת יסודות הקורט הנפוצים ביותר ברקמות יונקים באמצעות תערובת של נחושת, אבץ, סופראוקסיד דיסמוטאז ופריטין. נקה את הכרומטוגרפיה המהירה של hyperformance, או משאבות HPLC, עם מאגר אמוניום חנקתי של 200 מילי-מולרי למשך חמש דקות בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה. לאחר טיהור המערכת, הגדר את קצב הזרימה לנקודת אפס מיליליטר לדקה.

וחבר את עמודת ההרחקה של הצד. חבר את הקצה הנגדי של העמודה לגלאי UV, הגדר את ספיגת המדידה על 280 ננומטר, באמצעות צינורות שיא. הגדל בהדרגה את קצב הזרימה של העמודה במרווחים של נקודת אפס מיליליטר לדקה, עד להגעה לקצב זרימה סופי של נקודת אפס ארבעה מיליליטר לדקה.

בזמן שזה קורה, בדוק את חיבורי הצינורות לעמודה לאיתור נזילות. עקוב אחר הלחץ של מערכת זו כדי לוודא שהיא אינה חורגת מדרישות העמודה על ידי התבוננות בעקבות הלחץ על הכרומטוגרמה בתוכנה. השאר את העמודה לאיזון בקצב הזרימה הנדרש על פני חמישה עד 10 נפחי עמודות.

לאחר שיווי המשקל, חבר את המכשירים כדי לאפשר ניתוח דגימה. הגדר את שיטת HPLC לשאיבת מאגר A מעל העמודה בנקודת אפס ארבעה מיליליטר לדקה, למשך 15 דקות. הכנס את ה-ICPMS למצב המתנה לפני שינוי הגדרת החומרה.

ברגע שאתה במצב המתנה, כבה את התקשורת עבור הדגימה האוטומטית ושנה את מבוא הדגימה לאחר. השתמש בצינורות PEEK כדי לחבר את הזרימה מגלאי ה-UV ישירות לנבולייזר ב-ICPMS. הפעל את ה-ICPMS ואפשר למכשיר להתחמם במשך 10 עד 20 דקות.

לאחר שהפלזמה נדלקה, חבר את הכבל המרוחק מה-ICPMS לחלק האחורי של הדגימה האוטומטית של HPLC. עשה זאת לאחר שהפלזמה נדלקה. אחרת, מערכת ה-HPLC תיכבה אוטומטית, מכיוון שה-ICPMS אינו פועל.

שנה את שיטת ICPMS לאיסוף נתונים עבור LC ICPMS על ידי שינוי שיטת הרכישה מספקטרום לרכישת פתרון זמן. לאחר מכן, בחר את האלמנטים לניתוח. ברזל, נחושת, אבץ, קובלט, יוד, כמו גם כל מרכיב אחר מעניין, וקביעת זמני אינטגרציה.

לאחר בחירת האלמנטים המעניינים, התאם את זמן הרכישה כך שיתאים לזמן הריצה של הכרומטוגרפיה. כוונן ידנית את ה-ICPMS עבור רגישות וקצבי זרימת גז הליום של תאי התנגשות עם מאגר כרומטוגרפיה הזורם עם צזיום ואנטימון הכלולים במאגר. לאחר שספירת יוני המתכת התייצבה, וערכי סטיית התקן היחסיים נמוכים מחמישה אחוזים, המערכת מוכנה לשימוש.

צור רשימות הפעלה לדוגמה הן בתוכנות HPLC והן ב-ICPMS. רשימת ההפעלה לדוגמה מכילה את הסדר שבו יש להזריק כל אחת מהדגימות. כמו גם השם שלפיו יישמרו הנתונים.

בדוק שהמספר הכולל של הדגימות ברשימה תואם בין שתי התוכניות. התחל את אצווה הדגימה עבור ה-ICPMS לפני ה-HPLC, שכן הזרקת הדגימה על ידי ה-HPLC תפעיל את ה-ICPMS להתחיל לאסוף נתונים. אם זה לא נעשה בסדר הנכון, זה יגרום לנתונים חסרים.

צור נקודות עקומת כיול על ידי הזרקת נפחים משתנים של תקן מעורב סופראוקסיד דיסמוטאז ופריטין. נפחי ההזרקה נעים בין מיקרוליטר אחד ל-30 מיקרוליטר. לבסוף, נתח כל אחת מהדגימות הלא ידועות, כגון רקמה, פלזמה או תרבית תאים, לפני ניתוח הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מוצגת אשליית הפריטין בטווח של 2000 עד 60,000 פיקוגרם של ברזל שהוזרקו על העמוד. ניתוח רגרסיה בוצע באמצעות שטח שיא. פרופילי האשליה עבור נחושת, אבץ, סופראוקסיד דיסמוטאז מוצגים הן עבור נחושת והן עבור אבץ.

ניתוחי הרגרסיה שנוצרו באמצעות אזורי שיא מוצגים גם הם. תוצאות ניתוח הרגרסיה משמשות להמרת הנתונים הגולמיים בספירות לשנייה לפיקוגרמות לשנייה. כך שניתן לקבוע את כמות המתכת הקשורה לחלבון באופן כמותי.

ניתן להשתמש בטכניקה זו לזיהוי מטאלופרוטאינים בדגימות ביולוגיות מורכבות. כאן, מוח אנושי מופרד על ידי SEC ICPMS. כל אחד מהם מייצג מתכת מעניינת אחרת.

כלומר, נחושת, אבץ או ברזל. מוצגים כאן, העקבות המתקבלים כאשר פלזמה אנושית נתונה לטכניקה זו. המורכבות והשפע של הדגימה ישפיעו על מספר הפסגות שנראות.

כצפוי, הפלזמה נשלטת על ידי כמה מטאלופרוטאונים, כולל סרולופלסמין וטרנספרין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר מכשיר, כדי למדוד את המצב המקורי של מטאלופרוטאינים בדגימות מורכבות. לאחר שליטה, ניתן ליישם טכניקה זו בהצלחה תוך שלוש עד ארבע שעות.

זה מאפשר לנתח 20 עד 36 דגימות ביום אחד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בתקני המטאלופרוטאין המתאימים, כגון נחושת אבץ SOD אם אתה מעוניין בנחושת ואבץ. כמו גם התקנים הפנימיים במאגר, כגון צזיום, המאפשרים לתקן כל סחיפה במכשיר לאורך זמן.

בעקבות הליך זה, אתה יכול גם ליישם צורות אחרות של ספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות חשובות. כגון, מהם המטאלופרוטאינים הקיימים בדגימה שלי? ניתן לעשות זאת על ידי נסיעות סטנדרטיות בעיכול וריצוף פפטידים של חלבון מפרט המוני.

או, על ידי ניתוח החלבונים בטקט, במצבם הטבעי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטאומיקה להבין את תפקידם של מטאלופרוטאינים במחלות, כמו מחלת אלצהיימר. אל תשכח שעבודה עם חומצה חנקתית מרוכזת, ודגימות קליניות.

יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.