Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות תא-stroma הגידול בתוך גרורות ריאה, ניצול כתבים ניאון בעכברים. באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאים חיים לפחות 4 שעות ויכול להיות מותאם ללמוד תנאים ריאות דלקתיות אחרות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין אינטראקציות דינמיות של סטרומה של תאי גידול בתוך גרורות ריאה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גרורות סרטניות, כגון כיצד נוצרות גרורות.ואילו סוגי תאים בתוך המיקרו-סביבה מעורבים בתהליך זה? היתרון העיקרי שמציעה טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה מהירה וקלה להדמיית ריאות ex vivo המאפשרת הדמיה של תאים חיים למשך ארבע שעות לפחות. טכניקה זו עשויה לקדם את הבנתנו את מנגנוני הפעולה של טיפולים ממוקדים שונים לטיפול בגרורות ריאות. היה לנו רעיון לראשונה לשיטה זו כאשר בחנו גרורות על ידי הדמיית חתך ריאות ונאבקנו במוות תאים נרחב כתוצאה מהליך זה. כדי להכין את הריאות להדמיה חיה ex vivo, התחל בשיתוק העכבר על מכסה קצף פוליסטירן מכוסה בחתיכת ספוג ועיקר את החיה באתנול 70%. לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים בצע חתך אפיגסטרי רוחבי דרך העור, ואחריו חתך דומה דרך הצפק. לאחר מכן, הזזת לוח החיתוך למצב אנכי, חתכו את אבי העורקים היורד, כך שהדם יתאגד לתוך הבטן ולא לחלל החזה. גזור את הפתח הקטן בסרעפת כדי לשחרר את הוואקום. לאחר מכן, חתכו לאורך כלוב הצלעות כדי לכרות את הסרעפת ולדמיין את הריאות. בעזרת מספריים כירורגיים, חותכים את העור עד לקנה הנשימה מעל כלוב הצלעות ומשאירים את הצלעות שלמות. לאחר מכן, הפרד את העור מכלוב הצלעות, והסר את רקמת החיבור שמסביב כדי לחשוף את קנה הנשימה, תוך הקפדה לא לפגוע בקנה הנשימה עצמו. גזור פתח קטן בקוטר של כמילימטר בקנה הנשימה החשוף, במקביל לטבעות הסחוס קרוב ככל האפשר לגרון מבלי לחתוך לחלוטין את קנה הנשימה. לאחר מכן, הכנס בעדינות מחט בגודל 20 ארבעה עד חמישה מילימטרים לקנה הנשימה ללא כל כוח נגדי. קצה המחט צריך להיות גלוי דרך קנה הנשימה. מלאו מזרק ב -400 מיקרוליטר של 37 מעלות צלזיוס 2% טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז, ואז ייצבו את המחט בעזרת מלקחיים. תוך שמירה על לוח החיתוך אנכי, החדירו לאט לאט את כל כמות האגרוז החם דרך המחט לריאות. לאחר שהריאות מנופחות, נתק את המזרק תוך שמירה על המחט בתוך קנה הנשימה ושפך כ-50 מיליליטר של 20 מעלות צלזיוס PBS על הריאות כדי לעזור לקבע את האגרוז. כאשר האגרוז התמצק, הסר את המחט והשתמש במלקחיים כדי לסגור את קנה הנשימה כדי למנוע דליפה של כל אגרוז שאינו מוצק. כעת, פתח את החזה עוד יותר על ידי סטרנוטומיה ותפס את קנה הנשימה בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים, חתכו את קנה הנשימה לחלוטין. כדי להסיר את הריאות, משוך בעדינות את קנה הנשימה כלפי מעלה, חתוך את רקמת החיבור והוושט ומשוך את הריאות לחלוטין מחלל החזה. טבלו את הרקמה ב-37 מעלות צלזיוס RPMI 1640 כדי לשטוף את הדם העודף. בעזרת מספריים ומלקחיים חותכים את האונות