ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה
16 במרץ 2016
טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע תצפיות ניתנות לכימות של ההתרחשות הזמנית והמרחבית של פושיון שלפוחית אקסוציטית עצבית והסתעפות אקסון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון מתי והיכן איחוי שלפוחית מחדיר חומר ממברנה לקרום הפלזמה המתרחב במהלך התפתחות העצבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת הדמיית תאים חיים כדי לרכוש רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בתאים בודדים וגישות ביוכימיות לרכישת מידע מבוסס אוכלוסייה.
לאחר תרבית והדמיה של נוירונים בקליפת המוח עם Netrin-1 או בקרה על פי טקסט הפרוטוקול. שאפו PBS מהבאר הראשונה של מצב והחליפו ב-250 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה. דגירה על קרח במשך חמש דקות, ולאחר מכן באמצעות מרים תאים, הומוגניזציה של התאים על הקרח.
שאפו את ה-PBS מהבאר הבאה באותו מצב והוסיפו לבאר את התערובת ההומוגנית לאחרונה שתגדיל את ריכוזי החלבון. לאחר מכן, העבירו את התמיסה ההומוגנית לצינור מיקרופוגה מקורר מראש של 1.6 מיליליטר על קרח, והוסיפו 20% טריטון X-100 כדי להגיע לריכוז סופי של 1%ואז עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, טריטו את התערובת עשר פעמים תוך מזעור בועות. דגרו את הצינורות על קרח למשך שתי דקות כדי להמיס את החלבונים.
לאחר מכן צנטריפוגה ב-6, 010 RCF ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לגלול את החומר הלא מסיס. העבירו את חומר העל לתוך צינור צונן חדש של 1.6 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, השתמש במבחן ברדפורד כדי לקבוע את ריכוז החלבון.
לאחר מכן, השתמש במאגר הומוגניזציה עם 1% Triton X-100 ומאגר דגימה 5X בתוספת BME כדי לדלל את הדגימות לריכוז סופי של 3-5 מיליגרם למיליליטר. חלקו כל דגימת ניסוי באופן שווה לשני צינורות. לאחר מכן דגרו דגימה אחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, והשנייה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הפוך את הצינורות לסירוגין כדי לשמור דגימות בתמיסה. לאחר מכן בצע את דף SDS ואת הכתמים המערביים על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר הגדרת מיקרוסקופ ה-TIRF והדגימה ומציאת מישור מוקד עצבי על פי פרוטוקול הטקסט.
הפעל את תוכנת הלייזר והתחבר לתוכנת בקרת הלייזר. הגדר את התאורה לשדה רחב ובחר את המטרה. לאחר מכן הגדר את מקדם השבירה של הדגימה והתאם את עוצמת הלייזר על ידי ביטול הסימון של TTL עבור לייזר 491.
אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה חשובה במהלך הדמיה של שלפוחיות אקסוציטיות שלמות ברצפה כדי למנוע סחיפה של מיקוד ופוטוטוקסיות תוך הפקת תמונות של יחס אות לרעש גבוה המספיק לניתוח. התאם את המחוון ל- 100 ולאחר מכן הורד אותו בחזרה לערך שבין 20 ל- 40. לאחר מכן בדוק שוב את TTL.
לאחר מכן, התמקדו שוב בדגימה בתאורת אור משודרת. לאחר מכן, בתוכנת ההדמיה, בחר את תאורת הלייזר 491 ופתח את התריס. הנח את המעבה הפוך על הספסל האופטי כדי לא לשרוט את העדשה.
כוונן בסדר את נקודת המוקד של הלייזר על התקרה וכאשר הקבל הוסר, מרכז את הנקודה למרכז דיאפרגמת השדה הסגור. לאחר מכן החלף את המעבה ובתוכנת TIRF שלח את עומק החדירה ל -110 ננומטר. לאחר מכן עבור מתאורת שדה רחב למצב תאורת TIRF להדמיה.
כעת, באמצעות אפיפלואורסצנציה בשדה רחב מצא תאים המבטאים פלואורנט VAMP2 דרך העיניים. לאחר מכן, כדי להפחית את ההלבנה והפוטוטוקסיות, התאם את פרמטרי ההדמיה כדי למקסם את יחס האות לרעש ואת הטווח הדינמי באמצעות זמן חשיפה מינימלי ועוצמת לייזר. הגדר מיקוד אוטומטי רציף לכל תא.
לאחר מכן רכוש סט תמונות זמן-lapse עם רכישה המתרחשת כל 0.5 שניות למשך חמש דקות. למצב המעורר Netrin-1 במכסה זרימה למינרית, יש להוסיף לריכוז סופי של 500 ננוגרם למיליליטר של Netrin-1 לצלחת תאים ולהחזיר את המנה לאינקובטור למשך שעה לפני ההדמיה. לכמת את תדירות האירועים האקסוציטיים המנורמלים לפי שטח תא וזמן.
ב- ImageJ, פתח אוספי תמונות על-ידי גרירת הקובץ לחלון או על-ידי בחירה באפשרות File, Open, file name. להסרת אותות פלואורסצנטיים יציבים שאינם מייצגים אירועי היתוך שלפוחית, השתמש ב-Image, Stack, Z Project, Projection type Average Intensity. כדי ליצור הקרנת Z ממוצעת של כל הערימה.
הפחיתו את התמונה הממוצעת המתקבלת מכל תמונה בהילוך מהיר באמצעות תהליך, מחשבון תמונה, תמונה 1 הערימה שלך, פעולה הפחת תמונה שתיים. התוצאה היא הקרנת Z חדשה שנוצרה. זה ידגיש אירועים אקזוציטיים.
כעת בעין, ספור אירועי פושיון אקסוציטיים, שניתן לזהות ככתמים של אותות פלואורסצנטיים מוגבלים עקיפה המתפזרים במהירות כאשר VAMP2 פלואורן מתפזר בתוך קרום הפלזמה. סמן את התמונה הראשונה באמצעות תמונה, התאמה, סף והתאם את המחוון עד שהתא כולו יסומן בסף. לאחר מכן, תחת ניתוח, בחר הגדר מידות ובדוק את האזור ואת תווית התצוגה.
בעזרת כלי מעקב השרביט, הגדר את האזור הסלולרי הסף ולחץ על M כדי למדוד. העבר את הנתונים שנאספו לגיליון אלקטרוני בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר יומיים במבחנה, הנח את צלחת ההדמיה בתחתית הזכוכית המכילה נוירונים לא מועברים בתא סביבתי לח שחומם מראש.
השתמש במיקרוסקופ המצויד בעדשת אובייקטיבית אפוכרומט 1.4 NA DIC בתוכנית DX ומעבה צמצם מספרי גבוה לאיכות התמונה והרזולוציה הטובות ביותר. לאחר מכן, עם תאורת אור מועברת, התאם את מישור המוקד כדי למצוא נוירונים דרך עיניים. עבור הדמיית DIC של הסתעפות אקסונים, הגדרה נכונה של תאורה קרירה יותר תהיה חלק בלתי נפרד מאופטימיזציה של התמונה והיא קריטית להפקת תוצאות ניתנות לניתוח.
לאחר מכן, כאשר הנוירונים המעניינים נמצאים בשדה הראייה, השתמשו בפונקציית הרכישה הרב-אזורית בתוכנת ההדמיה כדי למצוא ולשמור את מיקומי ה-XYZ של לפחות שישה תאים. כעת, הוסף לריכוז סופי של 250 ננוגרם למיליליטר של Netrin-1 או גורם מעניין אחר כדי לדמות את התאים ולחץ על התחל רכישה מרובת אזורים. רכוש תמונות ברצף בכל מיקום כל 20 שניות למשך 24 שעות.
השהיית הרכישה ומיקוד מחדש לפי הצורך. בתוך תוכנת ההדמיה, סקור תמונות על-ידי בחירה באפליקציות, סקור נתונים רב-ממדיים ופתח את הקובץ הרצוי. זהה ענפי אקסון יציבים שנוצרו במהלך הפעלת ההדמיה.
השתמשו בכלי אזור העקיבה למדידת ענף אקסון יציב מבסיס האקסון ועד לקצה. לאחר טיפול בתאי עצב עם רעלן נטרין ובוטולינום וקיבוע וצביעה חיסונית, וצביעה חיסונית לבטא-3 טובולין ואקטין לפי פרוטוקול הטקסט. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לאסוף תמונות אפיפלואורסצנטיות בשדה רחב.
פתח ערימת תמונות ב-ImageJ וכדי לנתח ידנית את קו ההסתעפות, השתמש בקו, קו מפולח ועקוב אחר האקסון המוגדר כנויריט הארוך ביותר המשתרע מהסומה. עם ניתוח, כלים, מנהל החזר ROI, שמור את מעקב האקסונים כאזור עניין. לאחר מכן עקבו ושמרו כל ענף אקסון, המוגדר כנויריט גדול או שווה באורך של 20 מיקרומטר.
כלול רק ענפים ראשוניים בניתוח. מוצג כאן כתם מערבי לאחר השלמת בדיקת קומפלקס SNARE עמיד ל-SDS. נבדק עבור SNAP25, Syntaxin 1A ו-VAMP2.
חלבוני SNARE בקומפלקס, מונומרים הניתנים לזיהוי מוצגים כאן. דוגמה לאירוע אקסוציטי בתיווך VAMP2 fluroen המתרחש לאורך זמן בנוירון קליפת המוח מוצגת כאן. השיבוצים המוגדלים מציינים את הסומה, ענף אקסון וחרוט גידול אקסונלי המראים את התועלת המרחבית של בדיקה זו.
מעגלים מפוצצים אירועי היתוך אקסוציטי בודדים, אותם ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ TIRF. הדמיית DIC זו של זמן-lapse מראה את היווצרות ענף אקסון מגורה של Netrin בזמן אמת. מיקומים אלה מציינים את הבליטה הראשונית מאתר סניף.
אלה מייצגים ענפים יציבים שנוצרו במלואם של לפחות 20 מיקרומטר שנמדדו מהאקסון הראשי לקצה הענף. בניסוי זה, נוירונים בקליפת המוח ב-3 DIV טופלו ב-Netrin-1, הממריץ הסתעפות או רעלן בוטולינום A, המבקע את SNAP25, מרכיב של קומפלקס SNARE וחוסם אקסוציטוזיס. התוצאות מדגימות כי אקסוציטוזיס בתיווך SNARE נדרש להסתעפות תלויה ב-Netrin.
לאחר השליטה, ניתן להשלים את הדמיית ה-DIC בפגישת הדמיה אחת של לילה. ניתן לנהל הדמיית TIRF של אירועים אקסוציטיים בודדים תוך 4-5 שעות. ניתן לבצע את פרוטוקול הביוכימיה של היווצרות מורכבת SNARE תוך שעתיים.
בזמן שאתה מנסה את ההליכים הללו, חשוב לזכור להגביר את הקצב ולא למהר אף צעד. כל הליך דורש תשומת לב וסבלנות לקבלת התוצאות הטובות ביותר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו העברה משותפת של רכיבי שלפוחית מתויגים עם מטענים מועמדים מתויגים כדי לענות על שאלות נוספות.
כמו מהו המטען של השלפוחיות האקזוציטיות? לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור נויריטוגנזה, הסתעפות אקסונים ושלבים אחרים במורפוגנזיס בכל תרבית עצבית מנותקת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתבונן ולכמת את האופי המרחבי והטמפורלי של אירועי היתוך שלפוחית אקסוציטית עצבית המתאימים לשינויים במורפוגנזיס העצבי
.אל תשכח שעבודה עם רעלן בוטולינום או לייזרים בעלי עוצמה גבוהה עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת בגדי בטיחות מתאימים ושימוש במנגנון נעילת הבטיחות של המיקרוסקופ בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה משתמש בטכניקות מיקרוסקופיה בהירה ובניתוחים ביוכימיים כדי לחקור אקסוציטוזה מתווכת SNARE בהסתעפות אקסונים תלויה בנטרין. שילוב של שיטות אלו מאפשר זיהוי מנגנונים מולקולריים המווסתים את הסתעפות האקסונים ושינויים בצורת התא.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה תאית
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- הבנת הסתעפות האקסונים חיונית להתפתחות נוירונים.
- חלבוני SNARE ממלאים תפקיד משמעותי במיזוג שלפוחיות במהלך אקסוציטוזה.
- נטרין-1 הוא גורם מרכזי המשפיע על הכוונת האקסונים והסתעפותם.
- הדמיה של תאים חיים מספקת תובנות לגבי תהליכים תאיים דינמיים.
מטרת המחקר
- לצפות בתזמון ובמיקום של מיזוג שלפוחיות אקסוציטיות של נוירונים.
- לקבוע כיצד מיזוג שלפוחיות תורם להסתעפות האקסונים.
- לשלב הדמיה חיה עם ניתוחים ביוכימיים לצורך ניתוח מקיף.
שיטות בהן נעשה שימוש
- הדמיה של תאים חיים להבחנה מרחבית זמנית גבוהה.
- ניתוחים ביוכימיים לאיסוף נתונים ברמת האוכלוסייה.
- גידול וגירוי של נוירונים קליפת המוח עם נטרין-1.
- הומוגניזציה של תאים לצורך ניתוח נוסף.
תוצאות עיקריות
- זיהוי תפקיד האקסוציטוזה המתווכת SNARE בהסתעפות אקסונים.
- הוכחת הדינמיקה המרחבית והזמנית של מיזוג שלפוחיות.
- תובנות לגבי שילוב חומר הממברנה במהלך התפתחות נוירונים.
- ביסוס שיטה לתצפיות ניתנות לכימות במחקר מדעי העצב.
מסקנות
- המחקר משפר את ההבנה של מנגנוני הסתעפות האקסונים.
- שילוב של טכניקות הדמיה וטכניקות ביוכימיות יעיל למחקר מדעי העצב.
- הממצאים עשויים להודיע על מחקרים עתידיים על התפתחות ופונקציה של נוירונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding the spatiotemporal regulation of plasma membrane delivery during axon branching provides mechanistic insights into neuronal morphogenesis relevant to neurodevelopmental disorder modeling. This combined methodology enables de-risking of target validation by linking SNARE-mediated exocytosis to structural plasticity in neuronal networks. The approach supports predictive confidence in early discovery by quantifying vesicle fusion dynamics as a functional readout of guidance cue signaling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the role of SNARE complex formation in netrin-1-dependent axon branching to validate vesicle fusion as a mechanistic node in neuritogenesis.
- Operational Value: Enables correlation of single-vesicle exocytic events with population-level SNARE biochemistry for multi-scale target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes TIRF microscopy of VAMP2-pHluorin as a quantitative assay for netrin-1-stimulated exocytic frequency normalized to cell area and time.
- Operational Value: Provides a standardized imaging protocol to detect changes in vesicle fusion kinetics upon pharmacological or genetic perturbation of SNARE machinery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates that botulinum toxin-mediated SNARE cleavage blocks netrin-1-dependent axon branching, establishing exocytosis as a necessary step in morphological plasticity.
- Operational Value: Supports use of DIC time-lapse imaging to quantify stable axon branch formation over 24 hours as a phenotypic readout for pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery imaging assays with biochemical validation to support target hypothesis testing in neuronal development pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of guidance cue signaling through direct observation of vesicle fusion events in response to netrin-1 stimulation.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs of exocytic event frequency and axon branch metrics for compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Generates measurable readouts including SNARE complex levels via Western blot, exocytic event counts via TIRF, and branch length via DIC imaging for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects molecular mechanism (SNARE-dependent exocytosis) to cellular phenotype (axon branching) enabling preclinical continuity in neurite outgrowth models.
- Enterprise Reuse: Combines live imaging and biochemical assays into a reusable platform for studying membrane dynamics in neuronal differentiation and regeneration models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by establishing SNARE-mediated exocytosis as a required process for netrin-1-driven axonal branching.
- Operational Value: Standardizes correlative imaging and biochemical workflows to improve reproducibility across laboratories studying neuronal morphogenesis.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking molecular perturbations (e.g., SNARE cleavage) to structural outcomes in neuronal networks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in vesicle trafficking and axonal connectivity based on functional phenotypic validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, live-cell TIRF microscopy, and SNARE biochemistry.
- Depends on access to microfluidic imaging chambers, laser-based TIRF systems, and Western blotting infrastructure.
- Necessitates standardization of netrin-1 stimulation timing and toxin treatment protocols across experimental groups.
- Involves adaptation considerations for applying the assay to different neuronal subtypes or disease-relevant models.
- Limited by the technical complexity of correlating single-vesicle events with population biochemical assays without automated image analysis pipelines.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
SNARE Complex Formation Assay
3:12
Imaging Exocytic Events via TIRF Microscopy
8:08
Differential Interference Contrast Timelapse Microscopy of Axon Branching
10:10
Toxin Manipulations and Fixed Cell Immunofluorescence
11:13
Results: SNARE-mediated Exocytosis in Netrin-dependent Axon Branching
12:58
Conclusion
