Name: Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: חקור אימונוסטיינינג של פוספו-אפיטופים באמבריונים שלמים של דג זברה. שיטה זו מאפשרת לייצר תמונות תלת-ממדיות של חלבונים מופעלים בסידן במבנים תאיים כגון ריסים ראשוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0,817,658.

הנהלים דג הזברה בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת וירג&#39;יניה. 1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4% PFA / PBS. לשקול 8 גרם של paraformaldehyde (PFA) ב למכסה המנוע קטר. עוד בזמן שהיה במנדף, לפזר את PFA היבשים ~ 80 מ&quot;ל מזוקקים H 2 O עם ערבוב וחימום עד 50 ° C. תוך ערבוב, מוסיפים 3 - 10 טיפות של 1N NaOH טריים עד PFA נמס לגמרי פתרון מבהיר. מסירים מהאש ומוסיפים 100 מ&quot;ל 2x פוספט בופר (PBS). תביאו נפח 200 מ&quot;ל עם מזוקקים H 2 O. מגניב RT ולאשר pH של 7.4 לפני השימוש. חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס אבל להשתמש בתוך שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש 100% מתנול ללא כל תוספות. השתמש 95% אתנול ללא כל תוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן Tween פוספט שנאגר (PBT). מוסף מלוח פוספט שנאגר (PBS) עם 0.1% Tween-20. להוסיף 0.5 מ&quot;ל של פתרון המניה 20% Tween-20 עד 100 מ&quot;ל 1x PBS. חנות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פוספט שנאגר Triton-X (PBTx). מוסף PBS עם 0.1% Triton X-100. הוסף 0.5 מ&quot;ל של המניה 20% טריטון X-100 ל -100 מ&quot;ל של PBS. חנות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10% NGS / PBTx. סרום עיזים רגיל (NGS) בלוקים הלא ספציפי אתרי קישור. NGS חנות aliquots ב -20 ° C. כדי להשתמש, להוסיף 1 מ&quot;ל ל 9 מ&quot;ל PBTx. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 50% גליצרול / PBS. מערבבים היטב בחלקים שווים של PBS 2x ו -100% גליצרול. חנות ב RT. </li></ol> קיבוע העובר 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . (. למשל, β-יקטין: CAAX-GFP) גידול השג סוג בר (AB ו WIK) או מהונדס עוברי דרך הזדווגויות טבעיות. אם תרצה, להזריק עוברים עם בונה או morpholinos, כמתואר. 15,16 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם עוברים. איסוף עוברים דגירה על 28.5 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.003% 1-פניל-2-thiourea (PTU) לחסום פיגמנטציה כמתואר. 17 </su<html> p&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן. כאשר עובר הגיע לשלב ההתפתחותי הרצוי, 18, &#160; להרדים את העוברים באמצעות MESAB, להוציא מים מערכת כמה שיותר ולהוסיף PFA / PBS 4% טרי במשך 3 - 4 שעות ב RT. הערה: לפעמים פחות מ -20 שעות שלאחר ההפריה (hpf), לתקן לפני dechorionation. לפעמים אחרי 20 hpf, dechorionate לפני קיבוע באמצעות שני זוגות מלקחיים נקודת קנס תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי פתרונות. העבר עוברים באמצעות pipet נשא רחב, כמתואר. 17 פתרונות שינוי 1.5 מ&quot;ל כתרים צינורות microcentrifuge, פשוט בכך שהוא מאפשר עוברים להתיישב על ידי כוח המשיכה ללא צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט מקבע לאחר 3 -. 4 שעות, להסיר PFA / PBS, להחליף עם 100% מתנול ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה 48 לפחות. הערה: לקבלת immunoreactivity מקסימלי P-CaMK-II, להגביל את זמן אחסון מתנול הכולל לשבוע אחד. </li></ol>&quot;&gt; 3. עובר פריטי Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מינימום של 10 עוברי עבור כל תנאי הניסוי ב צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge כתרים, תווית אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העוברים להתיישב. סר וזורק מתנול רעננותם עם שטיפות מתקדמות המכילות 0.5 מיליליטר של הפחתה ריכוזית אתנול, כמצוין לשלב הבא. כל צעד הוא לשטוף 5 דקות עם נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגת רעננותם עם 5 פתרונות אלה: 66% אתנול / 33% PBTx, 33% אתנול / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (זהו החוזרים הראשונים של PBTx), 100% PBTx (זהו חוזר שני של PBTx). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לשטוף PBTx האחרון. הוסף 0.5 מ&quot;ל 10% NGS / PBTx. דגירה במשך שעה 1 לפחות ב RT עם נדנדה עדין ולאחר מכן להסיר ולסלק פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון נוגדן ראשוני על ידי דילול ב 10% NGS / PBTx. אם שיתוף immunostaining, השתמש נוגדן זיקה חזקה יותר הראשון. לצורך המחקר, דגירה עם נוגדנים חד שבטיים טובולין אנטי acetylated עכבר מדולל 1: 500. לקבלת examplדואר, אם יש 10 דגימות, לשלב 6 μl של פתרון נוגדן המניה עם 3 מ&quot;ל של 10% NGS / PBTx ולאחר מכן להפיץ 0.3 מ&quot;ל של זה לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 - 0.5 מ&quot;ל של נוגדן ראשוני מדולל על צינור אחד לטבול כל העוברים. דגירה עם נדנדת O / N העדין ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, להסיר ולסלק פתרון נוגדנים. הוסף 0.5 מ&quot;ל 2% NGS / PBTx לשטוף נוגדן ראשוני עודף. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דים האורות תקורה לדלל את נוגדנים משני fluorescently- מצומדות המתאים 10% NGS / PBTx כך שכל מצב מכיל 0.5 מ&quot;ל לפחות. עם נוגדן ראשוני טובולין אנטי acetylated העכבר, השתמש עז צבע ירוק ניאון IgG אנטי עכבר ביחס של 1: דילול 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים משני למשך 4 שעות עם נדנדה עדין ב RT בחושך. מעתה ואילך, תהליך דגימות תחת אורות מעומעמים דגירה במיכל כהה או על ידי לפפה בנייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">בסוף הדגירה, להסיר ולסלק את פתרון נוגדנים משני. הוסף 0.5 מ&quot;ל 2% NGS / PBTx לשטוף. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם-immunostaining שיתוף, להשיג את הנוגדן הראשוני השנייה מזן שונה הנוגדן הראשוני הראשון. במחקרים אלה, בצע את נוגדן אנטי phospho CaMK-II ארנב ידי נוגדנים משני IgG נגד ארנב עז צבען מצומדות אדום ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ארנב נגד phospho CaMK-II נוגדן 1:20. עבור כל צינור של עוברים, להשעות ב 0.3 מ&quot;ל 10% NGS / PBTx, ולאחר מכן להוסיף 15 μl של פתרון נוגדן המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי עוברי שקועים ואורות מעומעמים. דגירה עם נדנדת O / N העדין ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר תחת אורות עמומים, להסיר ולסלק פתרון נוגדנים. הוסף 0.5 מ&quot;ל 2% NGS / PBTx. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור אורות תקורה עמומות לדלל מספיק של fluorescently-conju המתאיםנוגדנים משני מגודרים כך שכל מצב בו לפחות 0.5 מיליליטר. במחקר זה, לדלל את נוגדנים משני IgG נגד ארנב עיזים אדומות ניאון מצומדות צבע (מסלול אדום) 1: 500 ב 10% NGS / PBTx. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים משני השני למשך 4 שעות עם נדנדה עדין ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה זה ותחת אורות עמומים, להסיר ולסלק את פתרון נוגדנים משני. הוסף 0.5 מ&quot;ל PBTx. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. חנות באחת PBTx או 50% גליצרול / PBS תלוי ההליך הדמיה. </li></ol> 4. הדמיה Confocal ועיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר עובר הדמיה. מניחים 1 - 5 עוברים בשקופית זכוכית. ליצור תא בין coverslip הראשי לשקופית באמצעות שברי coverslip בכל צד של החדר. בדרך כלל, ארבעה # 1 coverslips משמש כדי להפוך ערימות spacer אלה ללא הדבקה. הערה: אין הרכבה בינונית הכרחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טבילת שמן 100Xהמטרה להביא עובר יחיד אל המוקד באמצעות האור המועבר. כבה האור. הפעל מיקרוסקופ confocal. ודא לייזרים מתאימים (ירוק ו / או אדום) מופעלים accessary מוקד מרחוק עוסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנית confocal. ב &quot;הבר הרוכש&quot;, בחר את המטרה הנכונה. ב &quot;בסיסי XY&quot; בר, להגדיר את גודל התמונה 1,024 על ידי לחיצה על כפתור 1,024. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;לייזר וגלאים&quot; בר, לחץ על התיבה האדומה 488 ותיבת 568 ירוק להפעיל לייזר גלאי עבור כל ערוץ. גדר החריר עד בינוני ולהתאים את הרווח הבר &quot;הרווח&quot; של כל ערוץ לדמיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת &quot;רוכשת הגדרות&quot;, לחץ על &quot;חי&quot; כדי להתחיל רכישת תמונות. בשורת &quot;הגדרות תצוגה&quot;, בטל את &quot;כוח אינטגרל זום&quot; תיבת למרכז בחלון &quot;חי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת &quot;רוכש הגדרות&quot;, תחת לשונית &quot;Z&quot;, צעד דרך שכבות של תמונה. לאחר בחירה נוmber סעיפים אופטי לשלב לתוך התמונה, לעבור בשלב כלשהו &quot;המרכז&quot; של מטוס- z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;Z&quot;, לחץ על התיבה &quot;הפניה&quot; אדום קטן. זה יהיה לאפס את RFA בנקודה נבחרה &quot;המרכז&quot;. בתיבת הדו שכותרתו &quot;גודל שלב&quot;, לבחור את עובי השכבות (בין 0.25 מיקרומטר ו -2.0 מיקרומטר הוא אידיאלי). שימו לב בתיבה &quot;קובץ הגודל&quot; ולנסות להגביל ל -1 GB. הערה: בדרך כלל, עד 40 חלקים אופטיים של 0.5 - 1.0 מיקרומטר מתקבלת, אך מספר סעיפים יכולים להיקבע באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למצוא את קיצוני העליון של התמונה, לחץ על העיגול שליד &quot;למעלה&quot; ולעבור דרך שכבות z. כעת לחץ על העיגול שליד &quot;תחתית&quot;, המחשב ייקח את התמונה בחזרה שכבת כמרכז. שוב לעבור דרך שכבות כדי למצוא את הקיצוני התחתון של התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;Live&quot; שוב &quot;ההגדרות רוכשות&quot; תיבה כדי לעצור את הליזררְכִישָׁה. בלוח זה, לחץ על התיבות האדומות שכותרתו הממוצעת מחסנית Z. תיבות אלה יהפכו לירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיבת &quot;רוכשת הגדרות&quot;, לחץ על &quot;יחיד&quot; כדי לרכוש את סדרת תמונות כולו. אתה יכול לעקוב אחר התקדמות כפי שהוא סורק בשני ערוצים ודרך z-הערימה כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור, לחץ על החלון נפח ולחץ על &quot;שמירה בשם&quot; ואת שם הקובץ. שמור כקובץ &quot;.ids&quot;. נפח לעבד את הקובץ בעוד Z- מחסנית הוא עדיין פתוח, בחר את הנתונים לנתץ התפריט ולחץ על &quot;נפח לדקלם&quot;. שמור את הקובץ שניתן כקובץ TIFF. זהו הדימוי המוקרן המוצגים בפרסום זה. </li></ol>

<ol><li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during embryonic development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signalling+and+early+embryonic+patterning+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Yuen, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ca%282%2B%29+signaling+in+the+external+yolk+syncytial+layer+during+the+late+blastula+and+early+gastrula+periods+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).</li>
<li>Tombes, R. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+free+calcium+and+mitosis+in+mammalian+cells%3A+anaphase+onset+is+calcium+modulated%2C+but+is+not+triggered+by+a+brief+transient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient.</a> J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).</li>
<li>Hudmon, A., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Ca2%2B%2FCalmodulin-Dependent+Protein+Kinase+II%3A+The+Role+of+Structure+and+Autoregulation+in+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).</li>
<li>Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Evolution+of+Multifunctional+Ca2%2B%2FCaM-dependent+Protein+Kinase+%28CaMK-II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II).</a> Gene. 322, 17-31 (2003).</li>
<li>Braun, A. P., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multifunctional+Calcium%2FCalmodulin-Dependent+Protein+Kinase%3A+From+Form+to+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function.</a> Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).</li>
<li>Rich, R. C., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-directed+function+of+calmodulin+in+autophosphorylation+of+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).</li>
<li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx5-mediated+expression+of+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+is+necessary+for+zebrafish+cardiac+and+pectoral+fin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 175-184 (2009).</li>
<li>Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+CaMK-II+genes+during+early+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis.</a> Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).</li>
<li>Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activation+of+membrane+targeted+CaMK-II+in+the+zebrafish+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry.</a> Development. 137, 2753-2762 (2010).</li>
<li>Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMK-II+is+a+PKD2+target+that+promotes+pronephric+kidney+development+and+stabilizes+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia.</a> Development. 138, 3387-3397 (2011).</li>
<li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMK-II+activation+is+essential+for+zebrafish+inner+ear+development+and+acts+through+Delta-Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling.</a> Dev Biol. 381, 179-188 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , e1113(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , University of Oregon Press. (1993).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Obara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-2+immunolocalization+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+whole+mount+in+situ+hybridization+within+zebrafish+embryos+to+study+gene+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function.</a> J Vis Exp. , e50644(2013).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Harris, P., Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+tubulin-containing+structures+in+the+egg+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus+from+fertilization+through+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage.</a> J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה PFA / מתנול פותחה במעבדה זה במטרה העיקרית של אופטימיזציה של immunolocalization של epitope phospho-T 287 -CaMK-II במהלך ההתפתחות דג הזברה. שיטה זו מקומי בהצלחה P-CaMK-II במהלך היווצרות של מספר איברים ריסי כולל KV דג הזברה, 12 האוזן הפנימית 14 וכליות. 13 במיוחד בשלב KV, טכניקה זו היה צורך. ההצלחה של שיטה זו היא כנראה עקב שילוב של א) ומזעור autofluorescence, ב) שמירה על epitope phospho-CaMK-II ו- C) נגישות משופרת של epitope לנוגדנים. ...

הטכניקות המתוארות כאן הן תוצאה של מחקרים שביקשו להגדיר מטרות במורד הזרם של אותות Ca2+ במהלך אירועים המתרחשים במהלך ההתפתחות המוקדמת, כולל הפריה, קיבה, סומיטוגנזה והיווצרות גזע, עיניים, מוח ואיברים. 1-3 התגליות המקוריות של איתות Ca2+ עוברי היו תלויות בשימוש באינדיקטורים טבעיים ומהונדסים של Ca2+, כגון aequorin4 ו-fura-2. 5 אפילו עם הטכנולוגיה הנוכחית, זיהוי גבהים חולפים של Ca2+ דורש כלים אנליטיים מסורבלים ואינו חושף את המטרות של אותות Ca2+ כאלה. 
מעבדה זו חוקרת אותות Ca2+ הפועלים באמצעות חלבון קינאז תלוי Ca2+/קלמודולין (רב תכליתי) הידוע בשם CaMK-II, אנזים המועשר במערכת העצבים המרכזית וזוהה במקור כמווסת של חיזוק לטווח ארוך. 6 CaMK-II אינו ספציפי למוח, הוא מתבטא באופן נרחב ושמור מאוד לאורך כל תוחלת החיים והגוף של מינים ברחבי ממלכת החיות, כולל חסרי חוליות. ל-7,8 CaMK-II יש את היכולת הייחודית לשמור על פעילותו גם לאחר ירידה ברמות Ca2+ עקב יכולתו לזרחן עצמי ב-Thr287. במצב אוטו-זרחני זה, CaMK-II נשאר פעיל באופן בלתי תלוי ב-Ca2+/CaM, עד לדפוספורילציה. 6 לפיכך, לוקליזציה של CaMK-II זרחני (Thr287) יכולה לזהות תאים שבהם התרחשו עליות Ca2+ טבעיות ורלוונטיות. 
נוגדן נגד יונקים אוטו-זרחניים (P-Thr287) CaMK-II אופיין היטב ושימש בתחילה לאיתור CaMK-II מופעל ברקמת המוח. 9 לדגי הזברה (Danio rerio) יש שבעה גנים CaMK-II10,11 שתוצרי החלבון שלהם מכילים רצף של MHRQE[pT287]VECLK באזור זה. 10,11 רצף זה דומה מאוד לאנטיגן הפוספופפטיד המשמש ליצירת נוגדן רב-שבטי זה של ארנב (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) ולכן זו לא הייתה הפתעה גמורה שהנוגדן הזה הגיב עם דג הזברה CaMK-II. מעבדה זו הראתה כי נוגדן זה מגיב עם דג הזברה CaMK-II ביחס לזרחון עצמי ופעילות בלתי תלויה ב-Ca2+/CaM. 12 נוגדנים נוספים של CaMK-II ספציפיים לפאן הוכחו גם כמגיבים צולבים עם דג הזברה CaMK-II. 13
נוגדן זה שימש כדי להוכיח כי דג הזברה CaMK-II מופעל באופן מועדף בתאים בצד אחד של שלפוחית קופפר (KV), האיבר הריסי הדרוש לביסוס אסימטריה שמאלית/ימנית. 12 נוגדן זה שימש כדי להדגים כי CaMK-II מופעל באופן זמני בארבעה תאים סמוכים בצד שמאל של ה-KV בדיוק באותו שלב התפתחותי שבו נקבע מיקום האיבר. 12 בנוסף לשלפוחית קופפר (KV), אוטו-זרחן (P-T 287) היה ממוקם גם באתרים תוך-תאיים ספציפיים ברקמות ריסניות אחרות כולל הכליה, נוירומסטים והאוזן הפנימית. 12,13 בכליה של דג הזברה, P-T287-CaMK-II מועשר לאורך הגבול האפיקלי של תאי צינור ריסניים ובתוך ריסים קלואקליים שם הוא משפיע על הרכבתם. 13 לבסוף, באוזן הפנימית המתפתחת, P-T287-CaMK-II מרוכז באופן אינטנסיבי בבסיס הריסים ומשפיע על התמיינות התאים דרך מסלול האות Delta-Notch. 14 לסיכום, זיהוי CaMK-II מופעל איתר אתרים של שחרור Ca2+ תוך תאי והאיר מסלולי איתות פוטנציאליים חדשים.
תגליות אלה היו תלויות לחלוטין בפיתוח שיטה רגישה ומדויקת למיקום CaMK-II מופעל (P-T 287-autophosphorylated). מתוארות השיטות לתיקון וצביעת חיסון של דג הזברה KV, הכליות והאוזן הפנימית. מתוארות גם מגבלותיה של טכניקה זו. טכניקות אלה אמורות להיות שימושיות לכל חוקר המבקש להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה בשני תעלות פלואורסצנטיות לא רק של פוספו-אפיטופים, אלא כל אפיטופ, במהלך התפתחות מוקדמת של בעלי חוליות.

<table><tbody><tr><td>1-פניל-2-תיאוריאה (PTU)</td><td>סיגמא</td><td>P-7629</td><td>0.12% תמיסת מלאי. לדלל 1:40 במי מערכת</td></tr><tr><td>Alexa488 נגד עכבר IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>עיזים פוליקלונל, שימוש ב-1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 אנטי-ארנב IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>עיזים פוליקלונל, שימוש ב-1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>נקשר באופן מועדף ל-F-actin</td></tr><tr><td>Alexa568 נגד עכבר IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11004</td><td>פוליקלונל עיזים, שימוש ב-1:500</td></tr><tr><td>Alexa568 אנטי-ארנב IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>עיזים פוליקלונל, שימוש ב-1:500</td></tr><tr><td>אנטי-אצטילציה &#945;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>עכבר חד-שבטי, שימוש ב-1:500</td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-T287 CaMK-II</td><td>EMD Millipore</td><td>06-881</td><td>ארנב פוליקלונלי, שימוש ב-1:20</td></tr><tr><td>אנטי-טוטאל CaMK-II</td><td>BD Biosciences</td><td>611292</td><td>עכבר חד שבטי, השתמש בשעה 1:20</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר</td><td>S96857</td><td>כיתה מעבדה, 95%</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>מפוזרים כלי מדע עדינים</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td>#1&nbsp; עובי</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית</td><td>פישר</td><td>12-550-15</td><td>שקופיות זכוכית סטנדרטיות</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר</td><td>A411</td><td>אחסן במקפיא</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>צינורות מכוסים, לא סטריליים</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td>Aliquot 1 מ"ל צינורות, יש לאחסן במקפיא</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>דרגת ריאגנט,</td></tr> מלח <tr><td>פוספט חוצץ גבישי (PBS)</td> <td>איכות ביולוגית</td><td>119-069-131</td><td>תמיסת מלאי 10x או תוצרת מעבדה</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>BP-151</td><td>תמיסה של 10% במים, יש לאחסן ב-RT</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Life Technologies</td><td>85113</td><td>תמיסה של 10% במים, לאחסן</td></tr><tr><td>במיקרוסקופ RT Compound</td><td>Nikon</td><td>E-600</td><td>הרכבה על שולחן נטול רעידות</td></tr><tr><td>C1 Plus סריקת לייזר קונפוקלית</td><td>Nikon</td><td>C1 Plus</td><td>המופעלת על ידי תוכנית EZ-C1, אך שדרוגים משתמשים " אלמנטים"</td></tr></tbody></table>

phospho-אפיטופים immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

ההתפשטות מהירה של תאים, ביטוי ספציפי הרקמות של גנים ואת הופעתה של רשתות איתות לאפיין התפתחות עוברית מוקדמת של כל בעלי החוליות. קינטיקה ומיקום של אותות - אפילו בתוך תאים בודדים - בעובר המתפתח משלים זיהוי של גנים התפתחותיים חשובים. טכניקות Immunostaining מתוארים כי הוכחו להגדיר את קינטיקה של אותות בעלי חיים תאיים ושלמים במבנים קטנים כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון, הדמיה ועיבוד תמונות באמצעות מיקרוסקופ מתחם confocal-סריקת לייזר ניתן להשלים כמה כמו 36 שעות. דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם רצוי חוקרים המבקשים לבצע מחקרים בתוך בעלי החוליות היא הזולה רלוונטי מחלות אנושיות. knockouts או knockdowns הגנטיים חייב להיות מאושר על ידי האובדן של מוצר החלבון בפועל. אישור כזה של אובדן חלבוןיכול להיות מושג באמצעות הטכניקות המתוארות כאן. רמזים לתוך מסלולי איתות ניתן לפענח גם באמצעות נוגדנים כי הם תגובתי עם חלבונים ששונו שלאחר translationally ידי זרחון. שמירה ואופטימיזציה של המדינה פוספורילציה של אפיטופ לכן זה קריטי כדי קביעה זו לבין מושגת על ידי פרוטוקול זה. מחקר זה מתאר שיטות לתקן עוברים במהלך 72 שעות של פיתוח הראשון שיתוף בתרגום במגוון אפיטופים רלוונטי עם cilia בתוך שלפוחיות (KV) של Kupffer, הכליה ואת האוזן הפנימית. טכניקות אלו הם ישירים, אינם דורשים דיסקציה יכול להסתיים בתוך פרק זמן קצר יחסית של זמן. הקרנת ערימות תמונת confocal לתוך תמונה אחת היא אמצעי שימושי של הצגת נתונים אלה.

תנאים אופטימליים חזותי phospho-אפיטופים שיטות המתארות את immunolocalization של אפיטופים חלבון עוברי דג זברה כבר דלילות יחסית בהשוואה לאלו ללוקליזציה mRNAs באמצעות כלאה באתרה. Fixatives המשמשים לאיתור אפיטופים חלבונים בתאים ריסי של עוברי דג הזברה כללו 4% PFA / PBS ו מקבע של דנט, שהוא תערובת של מתנול DMSO. 19 לוקל...

טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע מיקום אימונולוגי (immunolocalize) של חלבונים המופעלים בעובר של דג הזברה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית וביולוגיה של התא, כגון מיקום והפעלה של חלבונים זרחופים (phosphorylated proteins) בעובר שלם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת למקם סיגנלינג תלוי סידן בעובר שלם באמצעות צביעה אימונואלוגית של חלבונים המופעלים על ידי סידן.לאחר השגת עוברים מסוג בר (wild type) או עוברים טרנסגניים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 0.003%PTU לעוברים במי המערכת כדי לחסום את הפיגמנטציה, והדגירו עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. כאשר העוברים הגיעו לשלב הנכון, הוסיפו MESAB לצלחית כדי להרדימ את הדגים. ברגע שהדגים הורדמו, הסירו כמה שיותר ממי המערכת, ולאחר מכן הוסיפו 4%PFA ו-PBS טריים והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד ארבע שעות.לאחר הדגירה, הסירו את ה-PFA והחליפו אותו ב-100% methanol. לאחר מכן, אחסנו את העוברים בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפחות. לצורך ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית, הניחו לפחות 10 עוברים עבור כל תנאי ניסיוני בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מילימטר מסומנות.כאשר העובריים שקעו לתחתית המבחנה, הסירו והשליכו את המטנול והשתמשו בשטיפות הדרגתיות של ריכוזי אתנול יורדים ב-PBTx כדי להחזיר את העובריים למצב הידרטציה. הסירו את

immunostaining-phospho-epitopes-ciliated-organs-whole-mount-zebrafish

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Immunolabeling שיטות כדי לנתח אוכלוסיות נפרדות של microtubules במוח דג זברה המתפתח מתוארים כאן, אשר חלים באופן נרחב לרקמות אחרות. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה ממוטב עבור immunolabeling microtubules יציבה ודינמית. פרוטוקול השני מספק שיטה כדי התמונה ולכמת nascent microtubules במיוחד.

השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור האפיון אימונוהיסטוכימיה ולוקליזציה של מזון orexin, וקולטנים orexin, ו קולטנים אנדוקאנביאיד בבטן ובמוחות של השמנה רגילה דיאטה המושרה (DIO) בוגרים דג זברה מודלים באמצעות שיטות אימונוimmunoperixidase וכפולות.

זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

אנו מציגים את הטכניקה למדידה ברמת דיוק גבוהה של יחסי איזוטופים של אבץ באיברי עכבר.

מדידות דיוק אבץ איזוטופי גבוהות יישומים לאיברי עכבר

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

חקור אימונוסטיינינג של פוספו-אפיטופים באמבריונים שלמים של דג זברה. שיטה זו מאפשרת לייצר תמונות תלת-ממדיות של חלבונים מופעלים בסידן במבנים תאיים כגון ריסים ראשוניים.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

גלה סרטונים נוספים