Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר
19 בפברואר 2016
טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא אימונולוקליזציה של חלבונים המופעלים בעובר דג הזברה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית והתאית, כגון לוקליזציה והפעלה של חלבונים זרחניים בעובר שלם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למקם איתות תלוי סידן בעובר שלם על ידי צביעה חיסונית של חלבונים המופעלים על ידי סידן.
לאחר השגת עוברים מסוג בר או טרנסגני על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 0.003% PTU לעוברים במי המערכת כדי לחסום פיגמנטציה ולדגור לשלב ההתפתחותי הרצוי. כאשר העוברים הגיעו לשלב הנכון, הוסיפו MESAB לתבשיל כדי להרדים את הדג. לאחר הרדמת הדגים, הסירו כמה שיותר מי מערכת, ולאחר מכן הוסיפו 4% PFA ו-PBS טריים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד ארבע שעות.
לאחר הדגירה, הסר את ה-PFA והשתמש ב-100% מתנול כדי להחליף אותו. לאחר מכן, אחסן את העוברים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפחות. כדי לבצע צביעה חיסונית, הנח מינימום של 10 עוברים לכל מצב ניסוי בצינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים בגודל 1.5 מילימטר.
כאשר העוברים התיישבו בתחתית הצינור, הסר והשליך את המתנול והשתמש בשטיפות הדרגתיות של ריכוזים יורדים של אתנול ב-PBTx כדי להחזיר לחות לעוברים. הסר את שטיפת ה-PBTx האחרונה והוסף 0.5 מיליליטר של 10% סרום עיזים רגיל או NGS ב-PBTx. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות עם נדנוד עדין.
לאחר מכן, הסר את התמיסה והוסף 0.2 עד 0.5 מיליליטר של דילול 1 ל-5 של נוגדן חד שבטי טובולין אנטי אצטילציה של עכבר ו-10% NGS ו-PBTx. דגרו על העוברים עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר למשך הלילה. בבוקר, הסירו והשליכו את הנוגדן ובצעו שלוש שטיפות באמצעות 0.5 מיליליטר של 2% NGS ו-PBTx עם נדנוד עדין במשך חמש דקות כל אחת.
עמעמו את האורות העליונים והוסיפו 500 מיקרוליטר לכל דגימה של דילול של 1 ל-500 של נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי ב-10% NGS ו-PBTx. דגרו בחושך בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות עם נדנוד עדין. לאחר הדגירה יש לשטוף את העוברים שלוש פעמים.
כדי לצבוע קו-אימונוסטית, הוסף דילול של 1 ל-20 של נוגדן CaMKII אנטי-פוספו. דגירה בחושך עם נדנוד עדין למשך הלילה. למחרת בבוקר, לאחר שטיפת העוברים עם 2% NGS ו-PBTx שלוש פעמים, הוסיפו דילול של 1 ל-5 של IgG אדום 568 מצומד לעזים פלואורסצנטיות נגד ארנב ו-10% NGS ו-PBTx.
לאחר הדגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות, שטפו את העוברים שלוש פעמים ואחסנו ב-PBTx או 50% גליצרול ב-PBS בהתאם להליך ההדמיה. כדי להרכיב את העוברים להדמיה, הניחו עובר אחד עד חמישה על מגלשת זכוכית. השתמש בארבעה שברי החלקת כיסוי מוערמים מספר אחד משני צידי הדג כדי ליצור תא.
והניחו תלוש כיסוי מעל. עם עדשת טבילה בשמן 100X והאור המועבר מביאים עובר בודד למיקוד. כבה את האור.
הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי עם הלייזרים המתאימים והפעל את המיקוד מרחוק. פתח את התוכנית הקונפוקלית ובסרגל הרכישה, בחר את המטרה המתאימה. לאחר מכן, בסרגל הבסיסי XY, לחץ על כפתור 1024 כדי להגדיר את גודל התמונה.
בסרגל הלייזר והגלאי, לחץ על התיבות האדומות 488 ו-568 הירוקות כדי להפעיל את גלאי הלייזר עבור כל ערוץ ולהגדיר את חור הסיכה לבינוני. לאחר מכן, בסרגל הרווח, התאם את הרווח עבור כל ערוץ כדי לדמיין אותו. לאחר מכן, בסרגל ההגדרות של הרכישה, לחץ על שידור חי כדי להתחיל ברכישת תמונות.
בסרגל הגדרות התצוגה, בטל את הסימון בתיבת כפה זום אינטגרלי למרכז בחלון החי. בסרגל ההגדרות של הרכישה תחת הכרטיסייה Z, עבור בין שכבות התמונה. לאחר בחירת מספר השכבות לשילוב בתמונה, עברו לנקודה כלשהי במרכז מישור Z.
תחת הכרטיסיה Z, לחץ על תיבת ההפניה האדומה הקטנה. זה יאפס את ה-RFA בנקודה שנבחרה כמרכז. בתיבה שכותרתה גודל מדרגה, בחר את עובי השכבות.
שימו לב לתיבת גודל הקובץ ונסו להגביל את הקבצים לג'יגה-בייט אחד. כדי למצוא את הקצה העליון של התמונה, לחץ על העיגול שליד למעלה ועבור בין שכבות Z. כעת לחץ על העיגול שליד התחתון והמחשב יחזיר את התמונה לשכבה כמרכז.
לאחר מכן, בתיבת הגדרות הרכישה, לחץ שוב על שידור חי כדי לעצור את רכישת הלייזר. בחלונית זו, לחץ על התיבות האדומות עם התווית ממוצע וערימת Z. קופסאות אלה יהפכו לירוקות.
בתיבה הגדרות רכישה, לחץ על בודד כדי להשיג את כל סדרת התמונות. עקוב אחר ההתקדמות תוך כדי סריקה בשני הערוצים ובכל מחסנית Z. כדי לשמור, לחץ על חלון אמצעי האחסון ולחץ על שמור בשם ותן שם לקובץ.
כדי לעבד את הקובץ בנפח, בזמן שמחסנית Z עדיין פתוחה, בחר בתפריט הנפתח של הנתונים ולחץ על עיבוד אמצעי האחסון. שמור את הקובץ המעובד כקובץ dot tif. איור זה מראה צביעה חיסונית עבור P-CaMKII וטובולין אצטיל, המהווה סמן סטנדרטי לריסים בשלפוחית של דג הזברה קופפר או KV. הזנת ריסים ראשוניים יוצרת זרימה מעגלית של נוזל, מה שמוביל לעלייה של סידן בתאים הריסים המצפים את ה-KV ולהפעלת CaMKII במקומות נפרדים כפי שניתן לראות כאן.
נתונים אלה מראים P-CaMKII כפי שהוא מופיע על פני השטח האפיקליים של תאים ריסניים המצפים אזורים ספציפיים של צינורות הפרינפריה בין 24 ל-72 שעות לאחר ההפריה או HPF. ביום אחד של התפתחות, האוזן העוברית של דג הזברה המקובעת ב-PFA ומתנול שומרת על מבניה ומאפשרת זיהוי של צביעת CaMKII בבסיס ולאורך הקינוצילום. ב-72 HPF, האוזן הפנימית הוכתמה נגד עם אלקסה 488 פלואידין וטובולין אנטי אצטיל עם אלקסה 568.
קיבוע המתנול של PFA שמר גם על F-actin וגם על טובולין. דג 30 HPF זה ביטא GFP ממוקד ממברנה, שיאבד עם קיבוע מתנול. קיבוע PFA הביא לאות P-CaMKII מופחת בהשוואה לקיבוע עם PFA ומתנול.
עם זאת, בשלב זה של ההתפתחות, האות חזק מספיק כדי להיות מזוהה ללא מתנול. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בעוברים טריים ובחומרים חופשיים טריים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למקם פוספופרוטאינים בעוברי דג הזברה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקות לצביעה אימונוהיסטוכימית של phospho-epitopes בעוברים שלים של zebrafish וביצוע לוקליזציה קונפוקלית פלואורסצנטית בשני צבעים. שיטות אלו יכולות להגדיר את המיקום והקינטיקה של חלבונים ספציפיים במבנים תאיים, כגון cilia ראשוניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
רקע
- מיקום אימונולוגי של חלבונים בעוברים של דג הזברה.
- הבנת ההפעלה של חלבונים מעובדים בפוספורילציה.
- לוקליזציה של אותיות תלויות סידן.
- חשיבותם של עיקרי מחקר בעוברים שלמים להשגת תובנות התפתחותיות.
מטרת המחקר
- לביצוע מיקום אימונו-היסטוכימי (immunolocalize) של חלבונים מופעלים בעוברים של דגי זברה.
- לבחינת שאלות מרכזיות בביולוגיה של התפתחות וביולוגיה של התא.
- להגדרה של קינטיקת ההפעלה של חלבונים בעובר שלם.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש בעוברים של דגי זברה מסוג פרא (wild type) או כאלו שעברו טרנסגנזה.
- יישום של 0.003% PTU לחסימת הפיגמנטציה.
- דגירה של העוברים עד לשלב ההתפתחותי הרצוי.
- צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות 4% PFA ו-PBS לצורך מיקום חלבונים.
תוצאות עיקריות
- מיקום מוצלח של חלבוני איתות תלוי-סידן.
- ויזואליזציה של חלבונים זרחוניים במבנים תאיים.
- קינטיקה מוגדרת של הפעלת חלבונים במהלך ההתפתחות.
- הבנה משופרת של דינמיקת חלבונים בעוברים שלמים.
מסקנות
- הטכניקות מאפשרות מחקר מפורט של לוקליזציית חלבונים והפעלתם.
- צביעה אימונוהיסטוכימית בעוברים של דגי זברה יעילה למחקר בביולוגיה התפתחותית.
- שיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי מנגנוני איתות תאיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
צביעה אימונוהיסטוכימית של אפיתופים מזופספורים בעוברים שלם של דגי זברה מאפשרת ויזואליזציה ישירה של דינמיקת אותות באיברים בעלי ריסונים, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות במסלולים התפתחותיים. גישה זו מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות לתוצאות פנוטיפיות במודל של חולייתנים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים באמצעות מיקום של חלבונים מופעלים, כגון phospho-CaMKII, במבנים כגון Kupffer’s Vesicle, הכליה והאוזן הפנימית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת היפותזות טיפוליות באמצעות מיקום של חלבונים מפוספורים בתאים עם ריסונים.
- ערך תפעולי: אישור מעורבות המטרה באמצעות קו-לוקליזציה עם tubulin מאצטיל, המהווה סמן לריסונים.
- ערך חיזוי: תמיכה בהבהרת המסלול באמצעות ויזואליזציה של הפעלת אותות תלוית-סידן ב-KV.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בשלבים הבאים בדגי zebrafish.
- פלט כמותי: מאפשר מדידות של עוצמת פלואורסצנציה של phospho-epitopes באזורים אנטומיים מוגדרים.
- יכולת הרחבה: תומך בעיבוד של מספר רב של עוברים לצורך זיהוי אותים הדיר שחזים בין תנאים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תואם למודלים של ciliopathy על ידי הערכת סיגנלינג תלוי-cilia ב-KV ובאוזן הפנימית.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מנגנוני סיגנלינג עובריים לבין תוצאות תפקודיות לאחר הלידה.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות go/no-go על בסיס מודולציה של המטרה ברקמות מתפתחות.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לזיהוי מוביל, על ידי אספקת נתוני אקטיבציה ברזולוציה מרחבית ברקמות של בעלי חוליות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות באמצעות ויזואליזציה ישירה של מיקום phospho-protein במבנים עובריים.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטית של איברים בעלי ריסים בדגימות שלמות (whole mounts).
- אנליטיקה: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות ב-KV, בכליה ובאוזן הפנימית לצורך השוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין סיגנלינג של ריסים עובריים למודלים פרה-קליניים של ciliopathies ומחלות כליה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית למיפוי phospho-epitope לאורך שלבי התפתחות ומודלים גנטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור אירועי פוספורילציה ללוקליזציה בשרישונים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות שלבי קיבוע ואינקובציית נוגדנים סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי תיקוף של הפעלת המסלול in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס נתוני איתות עובריים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באמבריולוגיה של דגי זברה ובטכניקות של אימונופלואורסצנציה.
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיה קונפוקלית עם כיוון לייזר לגילוי דו-ערוצי.
- מחייב סטנדרטיזציה של דילול הנוגדנים וזמני האינקובציה בין מעבדות שונות.
- כולל שיקולי התאמה לרקעים גנטיים ולשלבים התפתחותיים שונים.
- מוגבל על ידי רגישות שימור האפיטופ לשיטות קיבוע, שכן PFA לבדו מחליש את אות ה-phospho-CaMKII.
