קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לכמת את הדינמיקה של אקטין קליפת המוח על ידי ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה לאחר רכישה על ידי השתקפות פנימית כוללת, הדמיית תאורה מובנית או סים דשא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביופיזי, כגון איזה תפקיד יש לזרימת אקטין בקליפת המוח בוויסות אינטראקציות בסינפסה האימונולוגית. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא משלבת רזולוציה בקנה מידה ננומטרי עם תאימות לאורח חיים, ומאפשרת לצפות ולנתח תהליכים בקנה מידה קטן יותר בהשוואה לטכניקות מיקרוסקופיה קונבנציונליות.

מי שידגים את הטכניקה הזו יהיה ג'ורג' אשדאון, דוקטורנט מהמעבדה שלי. לדגימת בדיקה, הוסף חמישה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי מיקרוספרה פלואורסצנטית תת-עקיפה בקוטר 100 ננומטר לפני השטח של תלוש כיסוי טרי לא מצופה. לאחר מכן מורחים את תמיסת המיקרוספרה על החלקת הכיסוי בעזרת קצה פיפטה ומניחים לה להתייבש.

הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום הרכבה לתלוש כיסוי הבדיקה כדי להתכונן להדמיה כדי להתחיל, הפעל את החממה לבמה מחמם של מערכת ה-SIM של הדשא ומלא את המאגר במים מזוקקים כדי לכסות במלואו את בסיס גוף החימום. תנו למים להתייצב ל -37 מעלות צלזיוס. חבר את צווארון החימום לעדשת המטרה והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן אבטח את בלוק הדירוג התואם דשא 4 88 בנתיב האור של המיקרוסקופ כדי להבטיח שהנתיב האופטי הנכון מופעל. העבר את מצב הערוץ במיטת הלייזר למצב יחיד. חזור על פעולה זו עבור כבל הסיבים במיקרוסקופ stage.

צפה לראות שגיאה בחלון התוכנה אם שלבים אלה לא יבוצעו. לאחר הגדרת המצב, הורד את המטרה למישור ה-Z הנמוך ביותר והניח עליה טיפת שמן. הנח את פתק כיסוי דגימת הבדיקה עם המיקרוספירות הפלואורסצנטיות על המיקרוסקופ stage.

לאחר מכן בחר את מערכת המיקוד המושלמת או את פונקציית ה-PFS בגוף המיקרוסקופ. הזז את המטרה בהדרגה למעלה דרך מישור Z ועצור כאשר כפתור ה-PFS מפסיק להבהב, מה שמצביע על כך שמישור המוקד הושג בתוכנת הבקרה. עבור לתצוגה חיה כדי לדמות את המיקרוספירות על המסך.

בצע התאמות עדינות למיקוד באמצעות גלגל המניפולטור המיקרו PFS. שימו לב לתאורה אחידה ללא הגשת פלואורסצנט לא ממוקדת מעל גל הריח של 75 ננומטר. לבסוף, ודא שהתאורה המובנית מושגת על ידי התבוננות בדפוס תאורה משתנה מדגימת המיקרוספרה הפלואורסצנטית לגירוי תאי T להתמודד עם התאים של שמונה.

יש לכסות היטב עם 200 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים נגד CD 3 ואנטי CD 28 ולדגור את החלקת הכיסוי למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת פתק הכיסוי כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הנח אותו על שלב המיקרוסקופ ולאחר מכן מצא את מישור המוקד של הדשא. לאחר מכן, פיפטה בעדינות 200 מיקרוליטר של תאי T שהועברו לאחת הבארות בהחלקת הכיסוי.

השתמש ב-epi fluorescence כדי לעקוב אחר התאים שעברו טרנספטציה של GFP actin כשהם נוחתים על החלקת הכיסוי. לאחר שהתאים התייצבו, עברו למצב חי באמצעות ה-N SimPad ובדקו שהתאים בצג נמצאים בפוקוס. כדי להקליט מהלך זמן, פתח את חלון רכישת ND ובחר בכרטיסיית הזמן.

לאחר מכן לחץ על הוסף והגדר את המרווח ללא עיכוב. הגדר את משך הזמן ל -10 דקות. לבסוף, התחל להקליט את הנתונים על-ידי בחירה באפשרות הפעל כעת בחלון רכישת ND.

כדי לשחזר את התמונות פתח תחילה את תוכנת הניתוח המכילה את מודול הניתוח הנכון. לחץ על יישומים ולאחר מכן בחר את חלון הצג סוף סים. הגדר את אפנון התאורה, הניגודיות ודיכוי הרעשים ברזולוציה גבוהה לאחד, ובנה מחדש את מערך הנתונים של ה-SIM של הדשא כדי להפיק תמונת SIM מלאה משורת מצב התמונה.

ודא שגודל הפיקסלים הוא 30 ננומטר ולאחר מכן ייצא את הנתונים כקבצי TIF לניתוח מוט. לאחר הורדה וחילוץ חבילת התוכנה MATLAB של המקלות, פתח את הסקריפט. לאחר מכן הגדר את פרמטרי הקלט כמתואר בפרוטוקול הטקסט עבור מסנן ההסרה הנייחת.

בשורה 23, הגדר את פרמטר הסינון לממוצע נע ובשורה 24, השתמש ב-21 כפרמטר הממוצע הנע כדי ליצור מפה וקטורית אחת. הגדר את תת-האזור הזמני בשורה 31 למספר הפריימים המרבי במקרה זה 63. לאחר מכן, בשורה 32, הגדר את השינוי הזמני לאחד בשורות 33 עד 35.

הזן את שמות קבצי הפלט, הכותרות של מפות וקטור הפלט ונתיב ספריית הפלט. לאחר מכן הגדר את הפורמט שבו יש לשמור את תמונות המפה הווקטורית. במקרה זה, png.

בחלון העורך של MATLAB, פתח את הסקריפט. הפעל מוטות ערוץ אחד וטען את סדרת התמונות על ידי הרצת שורות 1 עד 23 של הסקריפט. הבא לרוץ קווים 29 עד 35 של מקלות ערוץ אחד.

כדי להתחיל בניתוח המקלות, עקוב אחר ההנחיה ובחר מצולע כדי להגדיר אזור עניין או החזר ROI אם תרצה. כדי להציג את המפות הווקטוריות יש להריץ את קווים 38 עד 52. לאחר מכן הפעל את קווים 53 עד 72 כדי לשרטט את היסטוגרמה של גודל המהירות המוצגת כאן היא תא OT T המבטא GFP שכותרתו F actin, שצולם עם פרוטוקול sim דשא.

נדון בטקסט חמש דקות לאחר שתא זה הוכנס לכיסוי המצופה בנוגדנים נגד CD 3 ואנטי CD 28 שנועדו לעורר היווצרות של סינפסות אימונולוגיות. נלקח ממנו מסלול זמן כדי שניתן יהיה לדמיין את הזרימה המולקולרית של f actin. ניתוח עוקב של נתונים אלה באמצעות תוכנית מקלות זו איפשר לכמת את הזרימה המולקולרית של F actin כפי שמתואר על ידי מפה וקטורית זו המתאימה לאזור הקופסה של התא משמאל, המייצג חלק מהיקף הסינפסה.

הגדלה נוספת של מפה זו ותת-אזור תאי T מבהירה את כיווניות ומהירות זרימת האקטין, אותה ניתן לקבוע מאורך וקטור כמו גם מקוד צבע ניתן לשרטט נתוני מהירות בהיסטוגרמה המאפשרת ניתוח סטטיסטי. באופן קולקטיבי, תוצאות אלה מראות כי בסינפסה האימונולוגית F אקטין זורם בצורה סימטרית מהפריפריה לכיוון מרכז התא. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לרכוש ts בנתונים ולנתח דינמיקת אקטין בקליפת המוח באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה.

למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבל תובנה לגבי זרימת אקטין במהלך נדידת תאי T, ניתן להשתמש בה גם במערכות אחרות שבהן זרימה מולקולרית נחשבת חשובה, כגון ביצוע נדידת תאים.