Transcriptome Profiling של In-Vivo עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

המטרה הכוללת של סרטון זה היא לספק הליך טכני אופטימלי באמצעות מערך בקר בהתאמה אישית בשני צבעים תוך שימוש בכמות נמוכה של RNA כולל מעוברי בקר ביום השביעי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לאובדן עוברי בפרות חולבות בעלות ייצור גבוה ושאלות לגבי איכות העובר ביחס לביטוי הגנים בעובר המתפתח לפני ההשתלה. היתרון של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לחקור ביטוי גנים באמצעות רמת פיקוגרמה של סך ה-RNA המופק מעוברים בודדים.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הגורם המשפיע על הישרדותם של עוברי בקר לפני השרשה המיוצרים in vivo. זה יכול גם לעזור לשפר טכנולוגיות רבייה כגון ייצור עוברים במבחנה. כדי להתחיל בהליך, הכינו עוברי בקר קפואים בצינור מיקרו-צנטריפוגה מתוך ערכת מיצוי RNA בקנה מידה פיקו מבוססת עמודים.

הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור, ודגר את העוברים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור למשך שתי דקות ב-800 פעמים G.Pipette 250 מיקרוליטר של מאגר מיזוג לתוך קרום מסנן עמוד הטיהור, ודגר את העמוד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה של צינור האיסוף ב-16,000 פעמים G למשך דקה אחת כדי לסיים את החימום המוקדם של העמודה.

מוסיפים 10 מיקרוליטר של 70% אתנול לתערובת של מאגר ליזה ועוברים ומערבבים היטב. לאחר מכן, טען את התערובת על עמוד הטיהור. צנטריפוגה את העמודה למשך שתי דקות ב 100 כפול G, ואז ב 16, 000 פעמים G למשך 30 שניות.

הוסף 100 מיקרוליטר ממאגר הכביסה הראשון לעמודה, וצנטריפוגה ב 8, 000 פעמים G למשך דקה אחת. בעזרת ערכת DNase, מערבבים חמישה מיקרוליטר של תמיסת מלאי עם 35 מיקרוליטר חיץ, ומערבבים על ידי היפוך עדין של הצינור הסגור. לאחר מכן, טען את תערובת ה- DNase על קרום עמוד הטיהור, ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

הוסף 40 מיקרוליטר ממאגר הכביסה הראשון לעמודה, וצנטריפוגה ב 8, 000 פעמים G למשך 15 שניות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר ממאגר הכביסה השני, וצנטריפוגה למשך דקה. הוסף חלק נוסף ממאגר הכביסה השני לעמודה, וצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-16,000 פעמים G.העבירו את עמוד הטיהור לצינור מיקרו-צנטריפוגה אחר, והעמיסו 11 מיקרוליטר של מאגר פליטה על קרום העמוד.

דגרו את העמוד למשך דקה בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה של העמודה למשך דקה אחת ב-1,000 פעמים G, ולאחר מכן למשך דקה נוספת ב-16,000 פעמים G.בדוק את האיכות והכמות של ה-RNA המנופח, ולאחר מכן אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. בעזרת ערכת הגברה, הגבירו 100 פיקוגרם של RNA איכותי.

הערך את טווח הגודל של ה-aRNA המוגבר עם כימות מבוסס פלואורסצנטי. לאחר מכן, קבע את ריכוז ה-aRNA על ידי ספקטרופוטומטריה. הכן שני מיקרוגרם של ה- aRNA המוגבר לתיוג פלורסנט עם ערכה סטנדרטית.

הקימו קופסת אוזון בחדר חושך, והמתינו עד שרמת האוזון תרד ל-0.001 חלקים למיליון. הניחו פילטר לחדר חושך מעל האור. לאחר מכן, הכניסו את הדגימה לקופסת האוזון והוסיפו שני מיקרוליטר כל אחד של ציאנין חמישה צבעים ומאגר תיוג.

עם הדגימה תחת אור בטוח, הוסף מים ללא RNase כדי להשיג נפח כולל של 20 מיקרוליטר. מערבבים בעדינות את הדגימה, ולאחר מכן, מדגרים את הצינור בתרמוסייקלר בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מצננים את הדגימה על קרח למשך דקה אחת, ולאחר מכן, סובבו את הדגימה.

נקה את ה-aRNA המסומן והמוגבר עם ערכת מיצוי RNA. בעזרת סוג הספקטרומטר המתאים, קבע את ריכוז ה-aRNA המסומן והמוגבר. הכן דגימה שנייה של aRNA מוגבר המסומן בצבע ציאנין שלוש.

אחסן את דגימות ה-aRNA בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שלושה ימים. שלב 825 ננוגרם כל אחד של Cy3 ו-aRNA עם תווית 5. הוסף לכך את המאגר החוסם ואת מאגר הפיצול.

דוגרים על התערובת בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן מצננים על קרח למשך דקה. הוסף מאגר הכלאה של 55 מיקרוליטר, וערבב היטב מבלי להכניס בועות אוויר. צנטריפוגה את התערובת בחום של 11, 300 פעמים G למשך דקה.

טען 100 מיקרוליטר של דגימה על מגלשת המערך, ואטום את השקופית בתא ההכלאה. הכלאה של הדגימה למשך 17 שעות ב-65 מעלות צלזיוס תוך סיבוב ב-10 סיבובים לדקה. הכן תמיסת ייצוב וייבוש לניקוי אוזון.

שטפו את המערכים, נקטו באמצעי זהירות כדי למזער את החשיפה לאוזון, ולאחר מכן טבלו אותם בתמיסת הייצוב והייבוש למשך 30 שניות. ודא שמשטח המערך יבש וללא אבק. אחסן את המערכים במקום חשוך.

הפעל את סורק המיקרו-מערך והמתן עד שהוא יהיה מוכן לסריקה. לאחר מכן, טען את המערך עם הברקוד משמאל. בצע ניתוח נקודתי ושמור את הנתונים כקובץ GPR.

בתוכנת ניתוח סטטיסטי, נרמל ונתח את הנתונים. חשב את סף בחירת הנקודה החיובית, והצג את העלילה של אותות היברידיים ואותות רקע. בצע נורמליזציה של לס בתוך מערך, ולאחר מכן קוונטיל בין נורמליזציה של מערכים.

ייצא את הנתונים המנורמלים לקובץ גיליון אלקטרוני. השתמש בכל האותות החיוביים במאגר נתונים של מיקרו-מערך כדי ליצור רשימת זיהוי של גנים ייחודיים שנבחרו. העלה את רשימת הזיהוי למסד נתונים של סיווג וניתוח חלבונים, בחר בבוס שור כאורגניזם, ובצע בדיקת ייצוג יתר סטטיסטית ברירת מחדל.

לאחר הגברה בשני סיבובים, השברים דומים מאוד בגודלם ובאיכות טובה. הגברה מוצלחת בשיטה זו אמורה להניב עלייה של לפחות פי אלף של aRNA. לתמונת מיקרו-מערך באיכות גבוהה יש עוצמת נקודה גבוהה ועוצמת רקע נמוכה בשני הערוצים.

אם עוצמת הרקע גבוהה מדי, רזולוציית האות תהיה גרועה. כ-46% מהכתמים היו מעל הרקע, מהם בודדו 6,765 תעתיקי RNA ייחודיים המתבטאים בבלסטוציסט. מבחן ייצוג יתר סטטיסטי הצביע על כך ש-10 המונחים האונטולוגיים המובילים של הגנים מייצגים תהליכי חלוקה תאית פעילים.

פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים בתחום הרבייה של בעלי חיים לחקור את ביטוי הגנים העובריים ולהעריך כיצד גורמים שונים משפיעים על העובר המתפתח. הטכניקה הזו פותחה גם במינים חשובים אחרים, כמו החזיר. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון PCR כמותי כדי לאמת תוצאות מיקרו-מערך.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ RNA מעוברים וכן כיצד להגביר ולתייג RNA כדי לבצע ניתוח מיקרו-מערך דו-צבעוני.