Transcriptome Profiling של In-Vivo עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים
30 בינואר 2017
Microarray מאפשרת מדידה כמותית ופרופיל ביטוי גנים של תעתיקים על בסיס גנומי. לכן, פרוטוקול זה מספק הליך טכני אופטימלי במערך בקר בהתאמה אישית בשני צבעים תוך שימוש בעוברי בקר ביום 7 כדי להדגים את ההיתכנות של שימוש בכמות נמוכה של RNA כולל.
המטרה הכוללת של סרטון זה היא לספק הליך טכני אופטימלי באמצעות מערך בקר בהתאמה אישית בשני צבעים תוך שימוש בכמות נמוכה של RNA כולל מעוברי בקר ביום השביעי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לאובדן עוברי בפרות חולבות בעלות ייצור גבוה ושאלות לגבי איכות העובר ביחס לביטוי הגנים בעובר המתפתח לפני ההשתלה. היתרון של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לחקור ביטוי גנים באמצעות רמת פיקוגרמה של סך ה-RNA המופק מעוברים בודדים.
שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הגורם המשפיע על הישרדותם של עוברי בקר לפני השרשה המיוצרים in vivo. זה יכול גם לעזור לשפר טכנולוגיות רבייה כגון ייצור עוברים במבחנה. כדי להתחיל בהליך, הכינו עוברי בקר קפואים בצינור מיקרו-צנטריפוגה מתוך ערכת מיצוי RNA בקנה מידה פיקו מבוססת עמודים.
הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור, ודגר את העוברים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור למשך שתי דקות ב-800 פעמים G.Pipette 250 מיקרוליטר של מאגר מיזוג לתוך קרום מסנן עמוד הטיהור, ודגר את העמוד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה של צינור האיסוף ב-16,000 פעמים G למשך דקה אחת כדי לסיים את החימום המוקדם של העמודה.
מוסיפים 10 מיקרוליטר של 70% אתנול לתערובת של מאגר ליזה ועוברים ומערבבים היטב. לאחר מכן, טען את התערובת על עמוד הטיהור. צנטריפוגה את העמודה למשך שתי דקות ב 100 כפול G, ואז ב 16, 000 פעמים G למשך 30 שניות.
הוסף 100 מיקרוליטר ממאגר הכביסה הראשון לעמודה, וצנטריפוגה ב 8, 000 פעמים G למשך דקה אחת. בעזרת ערכת DNase, מערבבים חמישה מיקרוליטר של תמיסת מלאי עם 35 מיקרוליטר חיץ, ומערבבים על ידי היפוך עדין של הצינור הסגור. לאחר מכן, טען את תערובת ה- DNase על קרום עמוד הטיהור, ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הוסף 40 מיקרוליטר ממאגר הכביסה הראשון לעמודה, וצנטריפוגה ב 8, 000 פעמים G למשך 15 שניות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר ממאגר הכביסה השני, וצנטריפוגה למשך דקה. הוסף חלק נוסף ממאגר הכביסה השני לעמודה, וצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-16,000 פעמים G.העבירו את עמוד הטיהור לצינור מיקרו-צנטריפוגה אחר, והעמיסו 11 מיקרוליטר של מאגר פליטה על קרום העמוד.
דגרו את העמוד למשך דקה בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה של העמודה למשך דקה אחת ב-1,000 פעמים G, ולאחר מכן למשך דקה נוספת ב-16,000 פעמים G.בדוק את האיכות והכמות של ה-RNA המנופח, ולאחר מכן אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. בעזרת ערכת הגברה, הגבירו 100 פיקוגרם של RNA איכותי.
הערך את טווח הגודל של ה-aRNA המוגבר עם כימות מבוסס פלואורסצנטי. לאחר מכן, קבע את ריכוז ה-aRNA על ידי ספקטרופוטומטריה. הכן שני מיקרוגרם של ה- aRNA המוגבר לתיוג פלורסנט עם ערכה סטנדרטית.
הקימו קופסת אוזון בחדר חושך, והמתינו עד שרמת האוזון תרד ל-0.001 חלקים למיליון. הניחו פילטר לחדר חושך מעל האור. לאחר מכן, הכניסו את הדגימה לקופסת האוזון והוסיפו שני מיקרוליטר כל אחד של ציאנין חמישה צבעים ומאגר תיוג.
עם הדגימה תחת אור בטוח, הוסף מים ללא RNase כדי להשיג נפח כולל של 20 מיקרוליטר. מערבבים בעדינות את הדגימה, ולאחר מכן, מדגרים את הצינור בתרמוסייקלר בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מצננים את הדגימה על קרח למשך דקה אחת, ולאחר מכן, סובבו את הדגימה.
נקה את ה-aRNA המסומן והמוגבר עם ערכת מיצוי RNA. בעזרת סוג הספקטרומטר המתאים, קבע את ריכוז ה-aRNA המסומן והמוגבר. הכן דגימה שנייה של aRNA מוגבר המסומן בצבע ציאנין שלוש.
אחסן את דגימות ה-aRNA בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שלושה ימים. שלב 825 ננוגרם כל אחד של Cy3 ו-aRNA עם תווית 5. הוסף לכך את המאגר החוסם ואת מאגר הפיצול.
דוגרים על התערובת בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן מצננים על קרח למשך דקה. הוסף מאגר הכלאה של 55 מיקרוליטר, וערבב היטב מבלי להכניס בועות אוויר. צנטריפוגה את התערובת בחום של 11, 300 פעמים G למשך דקה.
טען 100 מיקרוליטר של דגימה על מגלשת המערך, ואטום את השקופית בתא ההכלאה. הכלאה של הדגימה למשך 17 שעות ב-65 מעלות צלזיוס תוך סיבוב ב-10 סיבובים לדקה. הכן תמיסת ייצוב וייבוש לניקוי אוזון.
שטפו את המערכים, נקטו באמצעי זהירות כדי למזער את החשיפה לאוזון, ולאחר מכן טבלו אותם בתמיסת הייצוב והייבוש למשך 30 שניות. ודא שמשטח המערך יבש וללא אבק. אחסן את המערכים במקום חשוך.
הפעל את סורק המיקרו-מערך והמתן עד שהוא יהיה מוכן לסריקה. לאחר מכן, טען את המערך עם הברקוד משמאל. בצע ניתוח נקודתי ושמור את הנתונים כקובץ GPR.
בתוכנת ניתוח סטטיסטי, נרמל ונתח את הנתונים. חשב את סף בחירת הנקודה החיובית, והצג את העלילה של אותות היברידיים ואותות רקע. בצע נורמליזציה של לס בתוך מערך, ולאחר מכן קוונטיל בין נורמליזציה של מערכים.
ייצא את הנתונים המנורמלים לקובץ גיליון אלקטרוני. השתמש בכל האותות החיוביים במאגר נתונים של מיקרו-מערך כדי ליצור רשימת זיהוי של גנים ייחודיים שנבחרו. העלה את רשימת הזיהוי למסד נתונים של סיווג וניתוח חלבונים, בחר בבוס שור כאורגניזם, ובצע בדיקת ייצוג יתר סטטיסטית ברירת מחדל.
לאחר הגברה בשני סיבובים, השברים דומים מאוד בגודלם ובאיכות טובה. הגברה מוצלחת בשיטה זו אמורה להניב עלייה של לפחות פי אלף של aRNA. לתמונת מיקרו-מערך באיכות גבוהה יש עוצמת נקודה גבוהה ועוצמת רקע נמוכה בשני הערוצים.
אם עוצמת הרקע גבוהה מדי, רזולוציית האות תהיה גרועה. כ-46% מהכתמים היו מעל הרקע, מהם בודדו 6,765 תעתיקי RNA ייחודיים המתבטאים בבלסטוציסט. מבחן ייצוג יתר סטטיסטי הצביע על כך ש-10 המונחים האונטולוגיים המובילים של הגנים מייצגים תהליכי חלוקה תאית פעילים.
פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים בתחום הרבייה של בעלי חיים לחקור את ביטוי הגנים העובריים ולהעריך כיצד גורמים שונים משפיעים על העובר המתפתח. הטכניקה הזו פותחה גם במינים חשובים אחרים, כמו החזיר. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון PCR כמותי כדי לאמת תוצאות מיקרו-מערך.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ RNA מעוברים וכן כיצד להגביר ולתייג RNA כדי לבצע ניתוח מיקרו-מערך דו-צבעוני.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט הליך טכני מותאם המשתמש במערך בקרים (bovine array) מותאם דו-צבעי לניתוח ביטוי גנים בעוברים של בקר ביום השביעי. השיטה מאפשרת שימוש בכמויות נמוכות של RNA סך-כל, ומספקת תובנות לגבי איכות העוברים וגורמים המשפיעים על הישרדותם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אמבריולוגיה
- ביטוי גנים
רקע
- טכנולוגיית מיקרומערכים (Microarray) מאפשרת מיפוי של ביטוי גנים ברמה הגנומית.
- הבנת אובדן עוברים בפרות חלב היא קריטית לשיפור טכנולוגיות רבייה.
- שיטות הדורשות כמות נמוכה של RNA יכולות לשפר מחקרים על עוברים בודדים.
- ניתוח ביטוי גנים יכול להנחות פרקטיקות בייצור עוברים in vitro.
מטרת המחקר
- להוכיח את ההיתכנות של שימוש בכמויות נמוכות של RNA כולל מעוברים של בקר.
- לחקור ביטוי גנים הקשור לאיכות העוברים לפני השתחלה.
- לספק תובנות לגבי גורמים המשפיעים על הישרדות של עוברים של בקר לפני השתחלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת עוברים בקרים שהוקפאו בהקפאה מהירה.
- שימוש בערכה להפקת RNA בקנה מידה פיקו-מטרי המבוססת על עמודות.
- יישום של מערך בקרים מותאם אישית בעל שני צבעים.
- מדידה כמותית של ביטוי גנים ברמות RNA של פיקוגרם.
תוצאות עיקריות
- פרופיל מוצלח של ביטוי גנים תוך שימוש בכמות מינימלית של RNA.
- תובנות לגבי איכות העוברים וגורמים המשפיעים על הישרדותם.
- שיפורים פוטנציאליים בטכנולוגיות רבייה.
- הדגמת ההיתכנות של השיטה עבור מחקרים עתידיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי בעל ערך לחקר ביטוי גנים בעוברים של בקר.
- שיטות הדורשות כמות נמוכה של RNA יכולות להקל על המחקר של התפתחות עוברית.
- גישה זו עשויה להוביל להתקדמות בשיטות רבייה בחוות הלבן.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר פרופיל ביטוי גנים רחב-גנומי מ-RNA ברמת פיקוגרם שהופק מעוברים בודדים של בקר, ובכך פותר צוואר בקבוק קריטי במחקר של ביולוגיה רבייתית. על ידי אספקת נתונים טרנסקריפטומיים כמותיים מעוברים טרום-השתבסות שהופקו in vivo, השיטה תומכת בהסרה מכניסטית של סיכונים הגורמים לאובדן עוברים בבקר חולב בעל תפוקה גבוהה. הגישה מציעה ערך טרנסלציונלי לתיקוף מטרות בטיפולים רבייתיים וביטחון חיזוי בתהליכי הערכת איכות עוברים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של רשתות תעתוק השולטות בהישרדות ובאיכות העוברי לפני ההשראה.
- ערך תפעולי: מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור דפוסי ביטוי גנים לתוצאות פנוטיפיות בהתפתחות העובר.
- ערך ניבוי: תומך בתעדוף תיקים באמצעות זיהוי חתימות מולקולריות הקשורות לעוברי בני-חיים לעומת עוברי שאינם בני-חיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: יוצר פרופילים טרנסקריפטומיים סטנדרטיים הניתנים לשחזור, המתאימים לגילוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) ולסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- יכולת הרחבה (Scalability): תכנון של מערך מיקרו (microarray) דו-צבעי מגביר את השכפול הטכני וממזער את השונות, מה שמאפשר השוואות חסונות בין דגימות.
- תועלת הפלטפורמה: יוצרת בסיס רב-פעמי לאישור בשלבים מאוחרים יותר באמצעות qPCR או סריקה פונקציונלית של גנים מועמדים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מערכת מודל בקר עם מקבילות התפתחותיות לאמבריוגנזה של בני אדם לפני השתלה לצורך מחקרים מכניסטיים.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאים של ביטוי גנים משלב הגילוי להערכה פרה-קלינית של גורמים המשפיעים על הישרדות העוברים.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר קבלת החלטות מבוססת נתונים לגבי התערבויות בטכנולוגיות רבייה, בהתבסס על פרופילי ביטוי של מסלולי התפתחות מרכזיים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בזיהוי מטרות מונחה-היפותזה ובתיקוף מכניסטי לפני המעבר לבדיקות תפקודיות או למחקרי תיקוף in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות בידוד של תמלילים המובעים באופן דיפרנציאלי הקשורים לאיכות העובר ולהישרדותו.
- סריקה: מספקת פלטי ביטוי כמותיים ונורמליים המאפשרים השוואה מהימנה של תנאים גנטיים או סביבתיים על התפתחות עוברית.
- אנליטיקה: משתמשת בנורמליזציית Loess וקוונטיל עם בדיקות ייצוג יתר סטטיסטיות כדי להפיק תובנות מעשיות של אונטולוגיית גנים מנתוני מערך זרקים (microarray).
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם מאמצי גילוי סמנים ביולוגיים על ידי זיהוי תהליכים שמורים, כגון חלוקה תאית פעילה, כמו מונחים תפקודיים בדירוג גבוה בעוברים בשלב הבלסטוציסט.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה סטנדרטית מ-RNA לנתונים, הישירה ליישום במיניהם של בעלי חיים חקלאיים וניתנת להתאמה למודלים אחרים של עוברים של יונקים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בנוגע לאובדן עוברי על ידי אספקת נתוני ביטוי בקנה מידה גנומי משלבים התפתחותיים רלוונטיים מבחינה קלינית.
- ערך תפעולי: מאפשר זיהוי ברגישות גבוהה מכמות RNA מינימלית, תוך סטנדרטיזציה של זרימות עבודה עם קלט נמוך עבור דגימות ביולוגיות יקרות או מוגבלות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go בפיתוח טכנולוגיות רבייה על ידי קישור פרופילים מולקולריים לתוצאות של חיוניות עוברית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מטרות או התערבויות, בהתבסס על העשרה של רשתות גנים קוהרנטיות תפקודית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-RNA, הגברה אנזימטית וטכניקות סימון פלואורסצנטי למניעת דגרדציה של הדגימות.
- תלוי בגישה לסורקי מיקרומערכים (microarray scanners), תאי היברידיזציה וסביבות עם בקרה על ריכוז האוזון לשמירה על שלמות האות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של מדדי איכות ה-RNA, יעילות הסימון ותנאי ההיברידיזציה לצורך קבלת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת הפרוטוקול לשלבי עובר שונים, מינים אחרים או סוגי דגימות עם תנובות RNA משתנות.
- מגבלות מעשיות כוללות את הדרישה לכמות קלט של RNA מוגבר והטיה פוטנציאלית שעלולה להיווצר במהלך שלבי ההגברה הדו-סבביים.
