Name: טיפול בעכברי SCA1 עם תרכובות מסיסות במים ל- Non-ספציפי להגביר את התפקוד מיטוכונדריאלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: למדו פרוטוקול לטיפול בעכברי SCA1 באמצעות חומצה סוקסינית מסיסה במים לשיפור תפקוד מיטוכונדריאלי. שיטה זו מאפשרת הערכה התנהגותית וביוכימית של השפעות טיפוליות על מחלות ניווניות מוחיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר הארי אור מאוניברסיטת מינסוטה על תרומתו הנדיבה של עכברים מהונדסים. ברצוננו להודות גם לבוגרי מכללת סקידמור הבאים על עבודתם בביצוע הניסויים הקודמים: מוניקה וילגאס, פורטר הול, מיטשל ספרינג, ניקולס טוקר, ג'ני ז'אנג, קלואי לארסון ושיאן סלוקום. יתר על כן, ברצוננו להודות למכללת סקידמור על מימון פיתוח השיטות הללו.

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
<li>Ergonul, P. G., Nergiz, C. <a target="_blank" href="http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31627.pdf">Determination of organic acids in olive fruit by HPLC.</a> 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
<li>Klement, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+nuclear+localization+and+aggregation%2C+role+in+polyglutamine-induced+disease+in+SCA1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice.</a> Cell. 95 (1), 41-53 (1998).</li>
<li>Serra, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+links+SCA1+pathophysiology+to+glutamate+signaling+in+Purkinje+cells+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+progressive+motor+deficits+in+mice+transgenic+for+the+human+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation.</a> J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).</li>
<li>Anjomani Virmouni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GAA-repeat-expansion-based+mouse+model+of+Friedreich%27s+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

אם שיטות אלה משמשים כמתואר, הם מסוגל לאתר והקלה על תפקוד המיטוכונדריה בתיווך זרחון חמצוני במודלים עכברים מחלות ניווניות של המוח הקטן. מבחני ביוכימיים והתנהגותיים בשילוב שיטות רבות לקביעת מידת תרומת המיטוכונדריה לפתולוגיה מחלות ניווניות של המוח הקטנה. על ידי טיפול בעכברים עם חומצת succinic להגברת חילוף חומרים ואת להגביר את התפקוד המיטוכונדריה, אנו מסוגלים להציג הצלה של גירעונות התנהגותי מוח קטנים וניוון המוח קטן. ...

המיטוכונדריה הם המפיקים המפתח של אדנוזין אדנוזין (ATP), גידול אנזים חיוני האנרגיה התאית, עם רוב ATP במיטוכונדריה המיוצר באמצעות זירחון חמצוני (OXPHOS) באמצעות שרשרת העברת אלקטרונים. המוח, נתון דרישות מטבוליות הגבוהה שלה הסתמכותו על זירחון חמצונים להפעלת פעילות עצבית, הוא רגיש מאוד תפקוד המיטוכונדריה. כתוצאה מכך, תפקוד המיטוכונדריה הופעל במהלך תהליך ההזדקנות 1 והוא מעורב בפתוגנזה של מחלות ניווניות מספר 2, 3, 4. לכן, המסקנה היא כי המיטוכונדריה הם מטרות טיפוליות אטרקטיבית ניווניות של מערכת העצבים. בפרוטוקול זה, אימצנו את השימוש בסוג אטקסיה spinocerebellar 1 (SCA1) כמחלה ניווניות מודל לחקר המיטוכונדריהl תפקוד והתפתחות טיפולים במיקוד המיטוכונדריה. SCA1 נגרמת על ידי מוטציה הרחבת חוזרים polyglutamine (polyQ) במוצר הגן ataxin-1 אשר מפעילה ניוון הדרגתי של נוירונים פורקינג של המוח הקטן ונוירונים של אזורי מוח אחרים. שורת העכבר המהונדסת משמשת כאן (יועד עכבר SCA1), אשר מבטאת transgene polyQ מוטנטי ataxin-1 תחת השליטה של מקדם ספציפי תאי פורקינג, מאפשרת ניתוח הממוקד של רכיב פורקינג התאים של SCA1 5. עכברים SCA1 לעבור ניוון פורקינג תא הדרגתי ולפתח הילוך 6 Ataxic. תפקוד מורכב מיטוכונדריאלי ואת יעילות טיפול במיקוד המיטוכונדריה ניתן להעריך עם סוללה של מבחנים מולקולריים והתנהגותיים. תפקוד מורכב מיטוכונדריאלי נמדד לשעבר vivo על ידי מבחני נשימה מאתרים צריכת חמצן שינתה בתוך רקמת המוח הקטנה בבנוכחות מצעים ומעכבי שרשרת העברת אלקטרונים 7. מבחני נשימה בעבר שימשו עם רקמת permeabilized, מבודד המיטוכונדריה, ושלמים רקמות 7, 8, 9. הם מאפשרים הערכה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בניגוד לשיטות איסוף נתונים מורפולוגיים כגון מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים או מכתים immunofluorescence. השימוש כולו רקמות ולא המיטוכונדריה מבודד ומונע מבחר מוטה של המיטוכונדריה בריאה שעלולות להתרחש במהלך תהליך הבידוד 7. כאשר המותאמים פרוטוקול כמוצג, assay הנשימה היא שיטה ערך לאיתור תפקוד המיטוכונדריה במדינות מחלות ניווניות של המוח הקטן. activators שאינו ספציפי של חילוף חומרים שניתן להשתמש בם כדי להסיק תפקוד המיטוכונדריה במודלי עכברים מהונדסים של diseas ניווניותדואר וסיוע בפיתוח טיפולים חדשים. קוורצטין, קואנזים Q10 ו קריאטין כל הוכח כדי לשפר פתולוגיה מחלות ניווניות בחולים והן במודלים של בעלי חיים של מחלות ניווניות 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. כאן אנו מציגים מפעיל מטבולית הרומן, חומצה succinic, להגברת חילוף החומרים ואת להגביר את תפקוד המיטוכונדריה מחלות ניווניות. כדי להבטיח כי מפעיל חוצה את מחסום דם המוח, הועסקה HPLC לזהות למסירת רקמה עצבית בעכברים שטופלו 17. כדי להעריך את ההשפעות הטיפוליות של תרכובות מסיסות במים ממוקדים מבחינת מטבולית כגון חומצת succinic, סוללה של פרדיגמות התנהגותיים ומחקרי immunopathological ניתן להשתמש. duדואר אל גירעונות הקואורדינציה המוטורית שמוצאים במחלת ניוון עצבה מוח קטן, assay מסלול הסימן עקב, assay assay קורה המוט מסתובב מאיץ המשמש לאיתור הצלה של פתולוגיה התנהגותית 6, 18, 19. אמצעים אלה הם השלימו עם הערכת immunopathological של cytoarchitecture המוח הקטן על ידי הערכת עובי שכבה מולקולרית (מוגדר אורך סוכת הדנדריטים תא פורקינג) וספירת סומה תא פורקינג בתוך אונה מוגדרת של מוח קטן רקמות 6, 20, 21. כאן אנו מציגים שיטות נוירו והתנהגותיים מרובות לאיתור וטיפול תפקוד המיטוכונדריה עם תרכובות מסיסות במים ממוקדים מבחינה מטבולית. אנו משתמשים בניתוח vivo לשעבר של הנשימה המיטוכונדריאלי לנתח תפקוד המיטוכונדריה של טראן SCA1עכבר sgenic. יתר על כן, אנו מראים כי תסמיני המחלה והפתולוגיה משתפרים על ידי חומצה succinic המאיץ המיטוכונדריה מסיסים במים, עוד להפליל תפקוד המיטוכונדריה בהתקדמות המחלה SCA1.

<table><tbody><tr><td>אדנוזין דיפוספט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>אסקורבט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>דיגיטונין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DTT סרום חמור</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>מלאט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>מניטול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן-לקטוביונאט</td><td>ביו-סוכרים</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>ספונין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>חומצה סוקסינית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&פריים;,N&פריים; -Tetramethyl-p-phenylenediamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה בינונית</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td><נוגדנים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ (אנטי אטקסין-1 )</td><td></td><td></td><td>Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן משני נגד עכבר</td><td>Life Technologies</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 נוגדן משני נגד ארנב</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן קלבינדין (עז)</td><td>Santa Cruz</td><td>C-20</td><td></td></tr><tr><td><חזק>בעלי חיים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>לשלוט בעכברים טרנסגניים</td><td>הארי אור, Ph.D.</td><td>A02</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>עכברי SCA1</td><td>הארי אור, Ph.D.</td><td>B05</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>עכברים מסוג פרא</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L מיקרוטום</td><td>ERMA</td><td></td><td>Sledge microtome</td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצרול-ג'לטין שקופיות</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 יחידת בקרת אלקטרודות Oxytherm</td> נייר <td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P.T.F.E.</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotallion Rotarod</td><td>PPP& G</td><td></td><td>צור קשר עם המחבר המקביל לקבלת מידע</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>תוסף מונה תאים (עבור ImageJ)</td><td>המכון הלאומי לבריאות</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a></td></tr><tr><td>3P& G Rota-Rod v3.3.3 (תוכנת rotarod)</td><td>PPP& G</td><td></td><td>צור קשר עם המחבר המתאים לקבלת מידע</td></tr><tr><td>Phidget21.dll (נדרש לתוכנת rotarod)</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td><a href="https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html</a></td></tr></tbody></table>

טיפול בעכברי sca1 עם תרכובות מסיסות במים ל- non-ספציפי להגביר את התפקוד מיטוכונדריאלי

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

תפקוד המיטוכונדריה ממלא תפקיד משמעותי בתהליך ההזדקנות במחלות ניווניות כוללים כמה ataxias spinocerebellar התורשתי והפרעות תנועה אחרות בסימן ניוון הדרגתי של המוח הקטן. מטרת פרוטוקול זה היא להעריך תפקוד המיטוכונדריה ב אטקסיה spinocerebellar סוג 1 (SCA1) ולהעריך את היעילות של מיקוד תרופתי נשימה מטבוליים באמצעות חומצת succinic תרכובת מסיסה במים כדי להאט את התקדמות מחלה. גישה זו ישימה מחלות אחרות של מוח קטנות והוא יכול להיות מותאם כדי שורה של טיפולים מסיסים במים. Ex vivo ניתוח הנשימה המיטוכונדריאלי משמש כדי לזהות ולכמת את השינויים הקשורים למחלות במיטוכונדריה. עם ראיות גנטיות (נתונים שלא פורסמו) וראיות proteomic של תפקוד המיטוכונדריה במודל עכבר SCA1, אנו להעריך את היעילות של טיפול עם הים מאיץ מטבולית מסיס במיםחומצה uccinic ידי המסת תרכובת זו ישירות אל תוך מי השתייה בכלוב בבית. היכולת של התרופה כדי לעבור את מחסום דם המוח אפשר להסיק דרך כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). יעילותה של תרכובות אלה לאחר מכן ניתן לבדוק באמצעות פרדיגמות התנהגותיים מרובות כולל rotarod המאיץ, מבחן בקורה וניתוח טביעת רגל. שלמות Cytoarchitectural של המוח הקטן ניתן להעריך באמצעות מבחני immunofluorescence המאתרות גרעיני תאים פורקינג דנדריטים תא פורקינג סומה. שיטות אלה הן טכניקות חזקות לקביעת תפקוד המיטוכונדריה ואת יעילות הטיפול עם תרכובות מסיסות במים במחלת ניוון עצבית במוח קטן.

באמצעות מיקוד תרופתי של המיטוכונדריה במוח הקטן עם חומצה succinic אנו מסוגלים למנוע תפקוד המיטוכונדריה במודל של עכברים של SCA1 מחלות ניווניות של המוח הקטן. תורם האלקטרונים הקנונית של דהידרוגנז succinate, חומצת succinic, פורק ב מי שתייה בכלוב בבית של עכברי SCA1 במשך חודש, עם תחילת ערכה התנהגותית במהלך השבוע השני של טיפול וערכת נוירו לאחר הטיפול (איור 1 א). הטיפול בחומצה Succinic 22 משפר את הבי...

אנו מציגים פרוטוקול ביוכימי והתנהגותי להערכת היעילות של תרכובות מסיסות במים ממוקדות מיטוכונדריה לטיפול באטקסיה ספינוצרבלרית מסוג 1 (SCA1) ומחלות ניווניות אחרות של המוח הקטן.

טיפול בעכברי SCA1 עם תרכובות מסיסות במים ל- Non-ספציפי להגביר את התפקוד מיטוכונדריאלי

Mitochondrial dysfunction plays a significant role in the aging process and in neurodegenerative diseases including several hereditary spinocerebellar ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להתבונן ולכמת את ההשפעות הטיפוליות של מפעילים מיטוכונדריאלים מסיסים במים על התנהגות המוח הקטן והרקמות בעכברי אטקסיה מוחית בעמוד השדרה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האטקסיה של המוח הקטן בעמוד השדרה, כגון האם ליקויים מיטוכונדריאלים תורמים לפתולוגיה של המחלה ויכולים להיות מונעים על ידי מפעיל מיטוכונדריאלי מסיס במים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שחומצה סוקסינית היא תרכובת זולה ומסיסה במים שאושרה על ידי ה-FDA וניתן להעביר אותה ישירות למוח דרך מי השתייה.ההשלכות של טכניקה זו עשויות להתרחב לטיפול במחלות ניווניות אחרות מכיוון שליקויים במתחמי זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי נמצאים במחלות ניווניות מרובות כולל אלצהיימר ומחלת הנטינגטון. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם ההגדרה הראשונית של הפרדיגמות ההתנהגותיות שייתכן שיהיה צורך להתאים על מנת להשיג תוצאות עקביות. הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה מכיוון שקשה לשחזר את השלבים ההתנהגותיים מקטע שיטה כתובה, אך קל לשכפל אותם בעזרת הקלטה חזותית.כדי להתחיל בהליך זה, הגדר את המסלול בזווית קלה כלפי מעלה לכיוון תא הבית, מרופד במצעים ומזון תגמול. לאחר מכן רפדו דף נייר לבן על המסלול. אפשר לעכבר להתאקלם בקופסת הבית למשך חמש דקות.לאחר מכן, הרימו נושא בודד וצבעו את כפות הרגליים האחוריות השמאלית והימנית בצבע כחול ואדום על בסיס מים לא רעיל בהתאמה. לאחר מכן מקם את הנבדק בתחילת המסלול ואפשר לו ללכת לתיבה הביתית. לאחר שהנבדק הגיע לתא הבית, סגור את דלת המלכודת ואפשר לה להישאר בתוך תא הבית למשך דקה אחת לפני שתחזור לכלוב הביתי המתאים.לאחר מכן נקו את המסלול ואת תא הבית עם אתנול 30% והחליפו את המצעים, תגמלו מזון ונייר מסלול לניסוי הבא. במקביל, אסוף את נייר המסלול לאחר הניסוי ובדוק את הניסוי. ניסוי טביעת רגל מוצלח מוגדר כמינימום של חמש טביעות רגל עוקבות שבהן הנבדק הולך לעבר קופסת הזהב מבלי להסתובב או לעצור.כעת הגדר את מנגנון הקורה על פי מפרט צלב המוט עם שש קורות שונות. בקצה אחד של הקורה הוקמה קופסה ביתית חשוכה עם מזון פרס. כדי לאמן נבדקים על הקורה, הרכיבו את המכשיר עם הקורה השלישית.הנח בעדינות את הנושא בקצה הקורה שממול לתיבת הבית. ואפשרו לו לעבור על פני הקורה. אפשר לכל נבדק עד שלושה ניסיונות של שתי דקות כדי להשיג ריצה מוצלחת.מה שמוגדר כחציית הקורה וכניסה לתיבת הבית תוך שתי דקות. ביום הרביעי של אימון האלומה, הרכיבו את המנגנון עם הקורה הראשונה. והגדר את תיבת הבית.הנח מצלמת וידאו מול המכשיר וודא שניתן לצלם בבירור את מכשיר הקרן המלאה בווידאו. אפשר לעכבר לחצות את האלומה, לצלם כל ניסוי בווידאו ולתעד את מספר הניסויים המוצלחים לכל נבדק לכל קרן. בשלב זה, התאקלמו את הנבדקים למאגר הנתיב שלהם במשך 10 דקות לפני תחילת הניסוי.במהלך תקופת התאקלמות זו, הכינו את מנגנון הרוטרוד המנקה כל נתיב של המכשיר עם 30% אתנול. לאחר מכן, פתח את תוכנת rotarod. הגדר את הגדרות ההתחלה לארבעה סל"ד, את הגדרות ההאצה לחמש דקות ואת הגדרות המהירות הסופיות ל-40 סל"ד כדי לספק תאוצה קבועה מארבע ל-40 סל"ד לאורך פרק זמן של חמש דקות.לאחר תקופת ההתאקלמות, הנח את הנבדקים על הרוטרוד בנתיבים המתאימים להם בזמן שהמוט מסתובב בארבעה סל"ד. לאחר שכל הנבדקים נמצאים בנתיבים שלהם, התחל את הניסוי הראשון. רשום את זמן ההשהיה ליפול באמצעות תוכנת המכשיר.ניתן להשתמש בטיימר משני כגיבוי. לאחר סיום הניסוי, אפשר לכל נבדק לנוח במאגרי הנתיב המתאימים לו במשך 10 דקות לפני הניסוי הבא כדי למנוע עייפות. בהליך זה, חבר את צינור תיבת בקרת הטמפרטורה של מיקרוטום מזחלת מהבמה לברז כיור.השתמש בתיבת בקרת הטמפרטורה כדי לקרר את שלב המיקרוטום ל-28 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הגדר את חוגת עובי החיתוך ל 50 מיקרומטר. לאחר מכן טפח חלק בגודל אגורה של תמיסת OTC על הבמה.לפני שה-OTC קופא, השתמש במלקחיים כדי למקם את חצי הכדור כך שמשטח החיתוך הסגיטלי האמצעי יהיה עם הפנים כלפי מטה על שכבת ה-OTC. כוונו במהירות ובעדינות את הרקמה כך שהקצה הצדדי של חצי הכדור יצביע לכיוון הלהב. נעלה על הבמה.עובדים בשכבות, מוסיפים OTC נוסף סביב הרקמה ומאפשרים ל-OTC לקפוא לחלוטין לפני הוספת השכבה הבאה. לאחר מכן הוסיפו שכבה דקה של OTC על גבי הטישו והקפיאו אותה. לאחר מכן, חתכו את הרקמה במשקל גוף שווה המחולקת על להב החיתוך.אסוף את החלקים באמצעות מברשת צבע של אמן משובח. והניחו אותם בצלחת באר עם תווית מתאימה המכילה XPBS אחד. בין החלקים, אפס את עובי החיתוך ל-50 מיקרומטר במידת הצורך.לאחר החיתוך, החלף את ה- PBS בכל באר של הצלחת בתמיסת אוריאה. והניחו את הצלחת על קרח. כשהוא מוכן, העבירו את הצלחת לגוש חימום המוגדר לטמפרטורת רתיחה כדי להרתיח את החלקים בתמיסת אוריאה על מנת לחשוף את האפיטופים לתיוג חיסוני.בין כל שלב רתיחה, מצננים את הצלחת המכילה את חלקי הרקמה על הקרח. לאחר הרתיחה יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים, להחליף את התמיסה הנוכחית ב- XPBS אחד ולערבב את החלקים למשך 10 דקות. לאחר מכן חסום את החלקים בתמיסת סרום חמור על ידי דגירה בסרום למשך שעה עם ערבול עדין בטמפרטורת החדר.כעת ניתן להכתים קטעים. לאחר התווית, הרכיב את החלקים על שקופיות מצופות ג'לטין של 2% עם מדיום הרכבה כדי להפחית את הלבנת התמונות. מכסים, מחליפים ומייבשים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן יש לאטום את החלקות הכיסוי עם לק ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק, אתר את הסדק הראשוני של המוח הקטן מתחת לאור השדה הבהיר. השלב הקריטי ביותר של בדיקת האמינו הוא לאתר במדויק את רקמת המוח הקטן במודולים 5 ו-6 A המאגפים את הסדק הראשוני.ניתוח דפוסי צביעה ואונות לא עקביות יבטיח שונות בתוצאה שלך. עם מטרה של פי 10, סרוק ועורר ברצף ערוצי DAPI, Alexa Fluor 488 ו-Alexa Fluor 594. שימוש בלייזר דיודה 405 ננומטר, לייזר גז ארגון 488 ננומטר ולייזר דיודה 559 ננומטר בהתאמה, בשילוב עם מפצל אלומה דיכרואית DM 488559 ננומטר.לאחר מכן הפרד ואסוף את האור הנפלט באמצעות מפצלי אלומה SDM 490 ו-SDM 560 ומסנן פס פס BA 575675 בהתאמה. חומצה סוקסינית הומסת במי שתייה בכלוב ביתי של עכברי SCA1 במשך ארבעה שבועות החל מגיל 17 שבועות. עכברי SCA1 מתחילים להציג את פנוטיפ האטקסיה בגיל חמישה שבועות.הערכות התנהגותיות נערכו במהלך תקופת הטיפול כדלקמן. בדיקת טביעת רגל במהלך שבוע 17. בדיקת קרן במהלך שבוע 18 והאצת רוטרוד במהלך שבוע 19.בגיל 20 שבועות הוקרבו עכברים ונאספה רקמת מוח לבדיקות אמינו-פתולוגיה, בדיקות HPLC ובדיקות נשימה. להלן הנתונים המייצגים מבדיקת טביעת הרגל המציגים שער מסוג פרא שטופל ברכב, שער SCA1 שטופל ברכב ושער SCA1 שטופל בחומצה סוקסינית. כאן נתוני ניתוח אלומה מראים את השיפור בביצועי הקרן של עכברי SCA1 עם טיפול בחומצה סוקסינית.טיפול בחומצה סוקסינית משפר משמעותית את ביצועי הרוטרוד המואצים של עכברי SCA1 כפי שמוצג על ידי חביון מוגבר ליפול. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ליישם את הטכניקה באופן עקבי על כל נבדק לאורך מספר ניסויים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו נשימה מיטוכונדריאלית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו נשימה באמצעות מתחמי זרחון חמצוני בודדים שהשתפרו לאחר מתן חומצה סוקסינית.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע בדיקות התנהגותיות ונוירו-פתולוגיות. המעריכים את השיפור בהתנהגות המוח הקטן והארכיטקטורה הציטולוגית.

treating-sca1-mice-with-water-soluble-compounds-to-non-specifically

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה אנו מבצעים את מבחן המוט המסתובב או הרוטרוד המואץ כדי להעריך קואורדינציה מוטורית ולמידה בנבדקי עכבר.

בדיקת מוט מסתובב מואץ או מבחן רוטרוד: שיטה לבדיקת קואורדינציה מוטורית ולמידה בעכברים

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא סימן היכר של הזדקנות תאית. מאמר זה משתמש בטיפול לא פולשני קרוב אינפרא אדום (ניר) כדי לשפר את התפקוד המיטוכונדריה בהאפיתל החושית שיווי המשקל עכבר ההזדקנות.

קרוב אינפרא אדום (ניר) אור מגביר את הביטוי של דה מרקר של פונקצית מיטוכונדריאלי בעכבר שיווי המשקל החושי האפיתל

מאתר מחקרים במודלים של דלקת המעי הגס הראו כי אחוז קטן (1-5%) של גזע mesenchymal (MSC) מוזרק לווריד או intraperitoneally הביתה כדי מודלק colon1,2. מחקר זה מראה כי זריקות intracardiac מונחה אולטרה סאונד של MSCs לגרום בלוקליזציה מוגברת אל המעי.

הזרקת Intracardiac מונחה אולטרה סאונד של גזע Mesenchymal האנושי כדי להגדיל את יונת אל המעי לשימוש במודלים מאתר של מחלות מעי דלקתיות ניסיוני

הבנת ההשפעה של חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) על תפקוד המיטוכונדריאלי בהפטוציטים חשוב לחקור את המנגנון של OCPs גורם להפרעות מטבוליות. נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי פונקציית המיטוכונדריה הכבד.

פרוטוקול ניסיוני לזיהוי תפקוד מיטוכונדריאלי בהפטוציטים שנחשפו לחומרי הדברה אורגנוכלורין

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca2+ באסטרוציטים ונוירונים.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

פרוטוקולים אלה יסייעו למשתמשים לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים שמקורם בתאי סרטן תלת-ממדיים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

כאן, אנו מתארים מתן תרופות מונחות מיקרופיפטה (MDA) כשיטה חלופית לאכילה אוראלית המתמרצת את חיית המחקר לבלוע טיפולים בקלות עם מינימום מתח ואי נוחות.

שימוש במתן תרופות מונחות מיקרופיפטה כשיטה חלופית לגבאג' אוראלי במודלים של מכרסמים

אורגנואידים במוח משמשים כמודל רב ערך למחקרי אנצפלומיופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ (MELAS), מציעים תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה הבסיסית שלהם ומספקים פלטפורמה לסינון תרופות. אורגנואידים שמקורם בקווי תאים עם רמות שונות של הטרופלזמיה של גנים גורמי מחלות מציגים הבדלים פנוטיפיים משמעותיים.

מידול מחלות מיטוכונדריאליות באמצעות אורגנואידים במוח: התמקדות באנצפלומיופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ

הזרקות מקומיות של תווית צבע מיטוכונדריאלי סופית של מיטוכונדריה תא שוואן ב-vivo למיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משתמשת בהוכחת היתכנות שהודגמה ברקמת שריר שלד של עכברים עם שריר בריא או חולה, כדי לספק הדמיה מיטוכונדרית ברזולוציה גבוהה.

שיטות לכימות במקום של מורפולוגיית מיטוכונדריה בתאי שריר וסופיים של עכברים

הליך פולשני להערכת תפקוד האנדותל הוא הוכיח באמצעות Endo-PAT 2000.

הערכת תפקוד האנדותל vasodilator עם 2000 Endo-PAT

למדו פרוטוקול לטיפול בעכברי SCA1 באמצעות חומצה סוקסינית מסיסה במים לשיפור תפקוד מיטוכונדריאלי. שיטה זו מאפשרת הערכה התנהגותית וביוכימית של השפעות טיפוליות על מחלות ניווניות מוחיות.

טיפול בעכברי SCA1 עם תרכובות מסיסות במים ל- Non-ספציפי להגביר את התפקוד מיטוכונדריאלי

גלה סרטונים נוספים