הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולתרבית תאי אב של אוליגודנדרוציטים של חולדות ולכמת את האוליגודנדרוגנזה בתגובה לגורמים ניסיוניים. אוליגודנדרוגנזה יעילה היא המטרה הטיפולית בתחומי מחקר רבים, כולל פגיעה בחוט השדרה, היפוקסיה בילודים ומחלות דמיאליניות כגון מיאליטיס רוחבית וטרשת נפוצה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת פרוטוקול לבידוד של מספר רב של OPCs עם שיטה מהירה ואמינה לקביעת אוליגודנדרוגנזה על פני מספר תנאי ניסוי בו זמנית.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לעקר את כל ציוד החיתוך באמצעות מעקר חרוזים מחומם. לאחר מכן, הוסף 15 עד 20 מיליליטר PBS לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הנח את הצינור החרוטי על קרח, והשתמש בו כדי להחזיק את רקמת קליפת המוח החתוכה לקוביות במהלך הדיסקציה.

לאחר מכן, הוסף PBS קר לצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר שתשמש לדיסקציה תחת מיקרוסקופ האור. לאחר הקרבת גורי החולדות, חתכו את העור מאחורי האוזניים לאורך קו האמצע בעזרת מספריים קטנים. ומקלפים את דשי העור לאחור.

לאחר מכן, חתכו את הגולגולת לאורך קו האמצע מגזע המוח לעיניים. והיזהר לא לחתוך עמוק מדי על מנת לשמר את מבנה קליפת המוח הבסיסית. לאחר מכן, בצע שני חתכים רוחביים נחותים מהמוח הקטן על ידי החדרת מספריים כירורגיים קטנים לתוך הפורמן מגנום.

בצע חתך נוסף בין העיניים הקדמיות לנורות הריח. מקלפים בזהירות כל מחצית מהגולגולת בחזרה. הסר את כל המוח והניח אותו בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר מלאה ב-PBS קר.

תחת מיקרוסקופ אור דיסקציה, הסר את נורות הריח והמוח הקטן בעזרת מלקחיים כירורגיים עדינים. הפוך את המוח כך שפני הגחון יהיו גלויים. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים ישרים עדינים, בצע דיסקציה קהה על ידי הנחת קצות מלקחיים סגורים בין קליפת המוח להיפותלמוס לעומק של כשני שלישים מהמוח.

פתח את המלקחיים ברגע שהם במקומם, ולאחר מכן חזור על ההליך עבור חצי הכדור השני. לאחר מכן, הקניטו את קליפת המוח מאזורי ההיפותלמוס והמוח האמצעי. הסר את ההיפותלמוס, התלמוס והמוח התיכון על ידי החזקת המוח התיכון על פני השטח האחוריים שלו וקילוף לכיוון הקצה הקדמי של המוח.

לאחר מכן, נתק את הקשרים הקדמיים. בעזרת מלקחיים מכופפים דקים, הסר את ההיפוקמפוס ונתק את חיבורו לקליפת המוח. לאחר מכן, הסר את הסטריאטום הנותר על ידי גירודו מקליפת המוח הבסיסית בתנועה אלכסונית כלפי חוץ.

נקה את כלי הדם וקרומי המוח משטח הגחון של קליפת המוח. לאחר מכן, הפכו את המוח כך שפני השטח הגביים יהיו גלויים. קלף את קרומי המוח מקליפת המוח הבסיסית בה נמצאת נורת הריח.

חזור על ההליכים בסך הכל שלושה עד ארבעה גורי חולדות. ומניחים את כל קליפות המוח המנותחות בצלחת פטרי. קוצצים אותם בעזרת סכין גילוח מעוקר עד להשגת נתחים של מילימטר על מילימטר.

לאחר מכן אספו את הטישו על ידי שטיפת הכלי עם PBS לפני הנחתו בחזרה על הקרח. כעת, באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית המחוברת לבקר פיפטה, נתקו את הרקמה באופן מכני על ידי פיפטה עשר עד חמש עשרה פעמים או עד שחלקי הרקמה מצטמצמים בגודלם והתמיסה הופכת לעכורה. לאחר מכן, החזר את הדגימה לחממת תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם סיבוב רציף.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר PBS לכל דגימה וסנן את ההומוגנאט דרך מסנן נקבוביות של 40 מיקרומטר המונח על צינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את המסנן עם מיליליטר עד שניים נוספים של PBS. אסוף את כל הדגימות ההומוגנטיות לצינור חרוטי אחד של 50 מיליליטר ורכוש ספירת תאים כוללת.

לאחר ביצוע ספירת התאים, חלקו את ההומוגנאט באופן שווה לצינורות החרוטיים של 15 מילילטר, וצנטריפוגה אותם למשך 10 עד 12 דקות במשקל של 300 גרם. ראש כל עמודת LS על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מאגר עמודות. ואסוף את הזרימה דרך צינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר שמאגר העמודים עבר לחלוטין דרך החדר העליון, החל 1000 מיקרוליטר של תרחיף התא על כל עמודה ואפשר לתאים לעבור דרך כוח הכבידה. לאחר מכן, הסר כל עמודה והנח אותה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר עמודות וצלול את המאגר דרך העמודה בקצב מהיר כדי לעקור את התאים הקשורים ולשחרר אותם מהעמודה.

כדי לצלחת את התאים, יש לדלל אותם באמצעי התפשטות OPC ל-60,000 תאים למיליליטר. פיפטה 500 מיקרוליטר של תאים לאורך הצד של כל באר תחתונה שחורה ושקופה של צלחת 24 בארות. מערבבים את התאים על ידי ניעור הצלחת אופקית, באמצעות תנועה של ספרה שמונה.

בהליך זה, הנח קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר מעל פיפטה פסטר מזכוכית כדי להבטיח שהבאר לא תיפגע במהלך השאיפה. לאחר מכן, שאפו את המדיה מבארות התרבית קבוצת טיפול אחת בכל פעם כדי למנוע ייבוש התאים. לאחר מכן, הוסף לאט לאט 500 מיקרוליטר של תערובת מאסטר טיפול לאורך צד הבאר באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד.

דגרו על התרבויות ובצעו חילופי מדיה מלאים עם מדיה טיפולית חדשה כל יומיים-שלושה. בתום תקופת הטיפול הרצויה יש לשאוב את המדיה. הוסף לאט 400 מיקרוליטר PFA לצד הבאר כדי לתקן את התאים.

ודוגרים את הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות, שאפו PFA והוסיפו לאט לאט 500 מיקרוליטר D-PBS סטרילי כדי לשטוף את התאים. חזור על הכביסה פעמיים נוספות ואל תשאב את הכביסה הסופית.

כעת, הביאו את הצלחת לטמפרטורת החדר, שאפו את הבארות והוסיפו 250 מיקרוליטר של D-PBS המכילים חמישה אחוז NGS ו-0.1 אחוז טריטון x-100. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה עם טלטול אורביטלי עדין. הכן את תמיסת הדגירה העיקרית על ידי דילול נוגדן חד שבטי נגד MBP של עכבר ונוגדנים אנטי אוליג2 רב-שבטיים של ארנב ב-D-PBS המכיל חמישה אחוז NGS.

לאחר מכן, דגרו על הנוגדנים העיקריים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה למשך 16 עד 18 שעות עם טלטול אורביטלי עדין. בזמן שטיפת הצלחת, הכינו את תמיסת הדגירה המשנית על ידי דילול הנוגדנים נגד עכבר 680 ואנטי ארנב 800 ב-D-PBS המכילים חמישה אחוז NGS. לאחר מכן, שאפו את הכביסה הסופית והוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת דגירה משנית.

הגן על הצלחת מפני אור ודגר אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה עם טלטול אורביטלי עדין. לאחר מכן, סרוק את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה המסוגלת לזהות פליטות פלואורסצנטיות של 700 ננומטר ו-800 ננומטר. כנקודת התחלה, הגדר את היסט המוקד לשלוש, ואת הרגישויות לנקודה אחת חמש עבור MBP, חמש נקודות אפס עבור אקטין ושלוש נקודה חמש עבור olig2.

התאם את ערכי הרגישות לפי הצורך כדי למנוע חשיפת יתר של האות. בסכימה זו, בדיקת DIFS מתחילה עם OPCs חיוביים לחולדות A2B5 מבודדים טריים המצופים על כלי תרבית מקודדים PLL. תרביות אלה מתפשטות במשך שלושה ימים בנוכחות 20 ננוגרם למיליליטר PDGFAA, ולאחר מכן מטופלות בגורמים ניסיוניים במדיה טרייה נטולת PDGF ביום האפס.

המדיה הטיפולית מתחדשת במלואה ביום השני. והתאים מקובעים עם 4 אחוז פרפורמלדהיד ביום הרביעי. כאן, אימונוציטוכימיה עבור olig2 ו-MBP בוצעה על התרביות המייצגות ביום האפס וביום הרביעי תוך שימוש ב-Dapi ככתם נגד גרעיני.

תרביות אלה מציגות צביעה מכוננת לסמן התא של שושלת הפאן אוליגודנדרוציטים, Olig2, בימים אפס וארבע. בעוד שהכתמה לסמן אוליגודנדרוציטים בוגרים MBP ניכר רק ביום הרביעי. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר, לתרבת ולהבדיל בין OPCs חיוביים לחולדות A2B5 על מנת לכמת את ההשפעה של גורמים ניסיוניים על אוליגודנדרוגנזה.

זיהוי הגורמים המקדמים אוליגודנרוגנזה רלוונטי במיוחד לחקר מחלות דמיאליניות כגון טרשת נפוצה. לאחר שליטה, הטכניקות המתוארות כאן עשויות לעזור לזהות גורמים כאלה ובסופו של דבר לפתח טיפולים טובים יותר.