Name: הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: למדו לבודד ולגדל תאי OPC מקליפת המוח של עכברושים ולכמת תהליכי oligodendrogenesis בתרביות תאים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ואמינה של השפעת גורמים ניסיוניים על תהליכי מיאלינציה במערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

גרנט חסות: מכוני הבריאות הלאומיים; מספר גרנט: R37 NS041435.

<ol><li>Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+genetics+of+vertebrate+glial-cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification.</a> Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).</li>
<li>Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+capacity+of+the+MS+brain+decreases+with+disease+chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity.</a> Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).</li>
<li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li>
<li>Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+glial+cells%3A+a+novel+glial+cell+population+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropath+Exp+Neur%22%5BJournal%5D)">NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain.</a> J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).</li>
<li>Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+generate+A2B5-positive+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells.</a> Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).</li>
<li>Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+bipotential+glial+progenitor+cells+in+adult+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve.</a> Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).</li>
<li>Popko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+deficient+mice%3A+expression+of+myelin+basic+protein+and+generation+of+mice+with+varying+levels+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin.</a> Cell. 48 (4), 713-721 (1987).</li>
<li>Bourre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+profile+and+basic+protein+measurements+in+the+myelin+range+of+particulate+material+from+normal+developing+mouse+brain+and+from+neurological+mutants+%28Jimpy%3B+quaking%3B+Trembler%3B+shiverer+and+its+mld+allele%29+obtained+by+zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation.</a> J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).</li>
<li>Baxi, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+thyroid+hormone+%CE%B2+receptor+agonist+enhances+human+and+rodent+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation.</a> Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).</li>
<li>Warringa, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+stimulates+the+development+of+oligodendrocytes+in+primary+glial+cultures+and+affects+glucose+metabolism+and+lipid+synthesis+in+these+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures.</a> Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).</li>
<li>Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+has+diverse+and+multiple+stimulating+effects+on+expression+of+the+major+myelin+protein+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes.</a> J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quetiapine+facilitates+oligodendrocyte+development+and+prevents+mice+from+myelin+breakdown+and+behavioral+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes.</a> Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).</li>
<li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li>
<li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+glial+cells+during+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li>
<li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte%2Fneuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה מהירה ואמינה לבידוד OPCs עכברוש וכימות ב oligodendrogenesis במבחנה בתגובה לגורמים הניסיונות. באמצעות סלקציה חיובית, תשואות גבוהות של OPCs קיימא וטהור משמשים במישרין למטרות ניסויים. שיטה זו מייעלת את הבידוד, culturing, וצעדי הבידול לתוך מסגרת 1 בשבוע זמן, תאים קבועים ניתן לאחסן בנוחות על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות בלי לפגוע רגישות assay. יתרון עיקרי עם מבחני קרינ...

הולכה עצבית יעילה במערכת העצבים המרכזית היונקת (CNS) דורשת מעטפת המיאלין של אקסונים על ידי oligodendrocytes. במהלך פיתוח, oligodendrocytes להתעורר מתוך מאגר של ובתאים oligodendrocyte (OPCs) כי הם חשבו להגר מאזורי חדרית של המוח קדמי בפיתוח עצבי צינור 1. לאחר OPCs הגירה להתמיין oligodendrocytes בוגרת, myelinating כי לא רק להקל התפשטות הדחף יעיל, אלא גם לספק אקסונים עם תמיכה trophic 2. המבוגר CNS שומרת אוכלוסיה שופעת של OPCs כי הם מפוזרים בכל רחבי החומר האפור-לבן המהוות כ 5-8% מכלל התאים 3. בעקבות עלבון demyelinating, OPCs להגר באתר של פציעה, להתרבות, ולבדל להחליף נדני המיאלין אבודים או פגומים על אקסונים חשופים. עם זאת, בכמה הגדרות מחלה / פציעה, תהליך זה נמצא להיות יעיל או יכול להיכשל 4 לחלוטין. בשעה שdemyelination כרוני הוא חשב להוסיף את נטל המחלה, oligodendrogenesis ויצירת מיאלין יעיל עשוי להקל תסמינים 5. בהתאם לכך, כבר היה עניין ללמוד OPCs במבחנה כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים הניסיונות על oligodendrogenesis. תובנה השלבים השונים של בידול oligodendrocyte כבר מתאפשר על ידי זיהוי של סמני תאים ספציפיים הבמה. עצמית חידוש ובתאים מוקדם מוגדרים על ידי הביטוי שלהם של אלפא הקולטן לגורם הצמיחה נגזר טסיות (PDGFRα), עצביים / גליה אנטיגן 2 (NG2) ו A2B5 6 - 8. כפי OPCs ליזום תכנית הבידול שלהם לסגת מחזור התא, הם downregulate ביטוי של סמנים אלה ולהתחיל לבטא חלבונים מעידים premyelinating oligodendrocytes כולל המחזורי-נוקלאוטיד 3&#39;-phosphodiesterase (CNPase) ו O4. לבסוף, הבידול שלהם לתוך oligodendroc בוגרת יותרytes מתאפיין ביטוי של חלבונים הקשורים המיאלין, כולל גליקופרוטאין הקשורים המיאלין (הפצ&quot;ר), חלבון proteolipid (PLP), ואת חלבון המיאלין הבסיסי (MBP). MBP הוא חלבון קרום היקפי תאיים מרכיב עיקרי של מעטפת המיאלין. עכברים שחסר MBP לפתח פנוטיפ חמור שבו myelination CNS הוא ירד מוביל משמעותי רעידות, עוויתות 9,10 מוות מוקדם. תפקיד חשוב זה של MBP ב myelination הוביל שימוש בו כסמן של בידול oligodendrocyte היא במבחנת in vivo 11. כימות של MBP יכולה להיות מושגת באמצעות מתודולוגיות שונות. RT-PCR וניתוח כתם המערבי לאפשר כימות של רמות MBP תחת משטרי טיפול שונים. Immunocytochemistry היא שיטה איכותית נפוצה שיכולה גם להיות כמותית כאשר גישות מיקרוסקופיה מבוסס מצלמה משמשות. למרות שמערכות אלה מהימנות יסודיש המחקר של בידול oligodendrocyte, הם כל החסרונות שלהם כי להגביל את השימוש שלהם ב ההקרנה סמים. ראשית, כמות OPCs העיקרית הדרושים RT-PCR וניתוח כתם המערבי מפחית את מספר משתנים שיכולים להיבחן בו זמנית. בעוד דרישת תא immunocytochemistry היא הרבה יותר נמוכה, זמן ניכר חייב להיות מוקדש כל ניסוי אם כימות היא מטרה. תמונות רבות חייבות להיות בשבי ואז לכמת כדי להקל על הניתוח הניסיון. אזהרות אלה הופכים מכשולים חשובים לשקול ללימודים הדורשים הערכת קצב העברת נתונים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה אשר מנצל היבטים בסיסיים משני immunocytochemistry ומתודולוגיות כתם המערבי כימות המיאלין, תוך הפחתה משמעותית של שניהם את מספר התאים הדרושים זמן להשלמת ניתוח כמותי.

<table><tbody><tr><td><חומרי חיתוך חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS ללא Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 ס"מ פוליסטירן פטרי צלחות</td><td>פישרברנד</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה קלה</td><td></td><td>מוטיק SM2-168</td><td></td></tr><tr><td><חזק>דיסוציאציה חומרים</מסובב ></td><td></td><td></td><td></td>צינור חזק</tr> <tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td> ערכת דיסוציאציה <td>של צינור מסובב</td></tr><tr><td>רקמות עצביות (P)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>ערכת דיסוציאציה אנזימטית</td></tr><tr><td>PBS עם Ca2+ ו-Mg2+</td><td>corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &mu; m מסננת תאים</td><td>קורנינג</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td><חזק>A2B5 טיהור עמודים&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-A2B5 מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td><td>חרוזים כרוכים A2B5 נוגדן</td></tr><tr><td>LS עמודות</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>עמודות בחירה מגנטיות</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS עם Ca2+ ו-Mg2+</td><td>corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9647</td><td>0.50%</td></tr><tr><td><חומרי תרבית חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 מ"ל</td></tr><tr><td>טריודותירונין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T6397</td><td>45 ננומטר</td></tr><tr><td>מלח קלמסטין פומראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SML0445-100 מ"ג</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>מלח Quetiapine hemifumarate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>N-אצטיל ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165</td><td>5 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8783</td><td>60 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1524</td><td>10 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Putrecine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>16 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5261</td><td>40 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H0135</td><td>50 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>d-ביוטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B4639</td><td>10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I6634</td><td>5 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4161</td><td>100 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>יסודות קורט B</td><td>קורנינג</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>תוסף B-27</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>24 בארות Visiplate שחור עם מכסה</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>תרבית רקמה דרגה</td></tr><tr><td><חזק>אימונוציטוכימיה וכימות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr> <tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>78787</td><td>0.10%</td></tr> <tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>ג'קסון מחקר חיסוני</td><td>005-000-121</td><td>5%</td></tr><tr><td>עכבר חד שבטי אנטי-MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-אקטין</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-7210</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-אוליגן 2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>עז אנטי-עכבר 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>עז אנטי-ארנב 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 עיזים נגד עכבר</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עיזים נגד ארנב</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade עם DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS עם Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey Clx Infared Imaging System</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת עכברוש oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת dual-אינפרא אדום

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

אוליגודנדרוגנזה יעילה היא המטרה הטיפולית של מספר תחומי מחקר כולל פגיעה בחוט השדרה, היפוקסיה בילודים ומחלות דמיאלינטיות כגון טרשת נפוצה ומיאליטיס רוחבית. מיאלינציה נדרשת לא רק כדי להקל על התפשטות דחפים מהירה בתוך מערכת העצבים המרכזית, אלא גם כדי לספק תמיכה טרופית לאקסונים הבסיסיים. ניתן לחקור תאי אב של אוליגודנדרוציטים (OPCs) במבחנה כדי לסייע בזיהוי גורמים שעשויים לקדם או לעכב התמיינות אוליגודנדרוציטים. עד כה, רבות מהשיטות הזמינות להערכת תהליך זה דרשו מספר גדול של תאים, ובכך הגבילו את מספר התנאים שניתן לחקור בכל זמן נתון, או שיטות כימות עתירות עבודה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד של מספר רב של OPCs טהורים ביותר יחד עם שיטה מהירה ואמינה לקביעת אוליגודנדרוגנזה ממספר מצבים בו זמנית. OPCs מבודדים מקליפת חולדה יילודים P5-P7 וגדלים במבחנה במשך שלושה ימים לפני ההתמיינות. ארבעה ימים לאחר ההתמיינות, אוליגודנדרוגנזה מוערכת באמצעות בדיקת סריקה פלואורסצנטית כפולה אינפרא אדום כדי לקבוע את ביטוי חלבון המיאלין.

OPCs A2B5 החיובי מבודדים באמצעות בחירת תא חיובית באמצעות מערכת הפרדת עמודה מגנטית. לפני תחילת ההליך בבידוד, המוח כולו יוסר גורי חולדה כי הם בין P5 ו P7. ברגע שהמוח כולו מנותק בהצלחה מהגולגולת, נורות המוח קטנת ההרחה מוסרות באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס (איור 1 א). על מנת לבודד רקמת קליפת מוח מוחות ההיפותלמוס, התלמוס המוח התיכון הם נכרתו על ידי דיסקציה זהירה (האיור 1B). לאחר מכן, ההיפוקמפוס בסטריאטום מוסר באמצעות מלק...

אוליגודנדרוציטים הם תאי המיאלין של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ותרבית של קודמיהם, תאי אב אוליגודנדרוציטים, מקליפת חולדות, כמו גם שיטה כמותית מהירה ואמינה להערכת אוליגודנדרוגנזה במבחנה בתגובה לגורמים ניסיוניים.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ולגדל תאי אב של אוליגודנדרוציטים מחולדה ולכמת את האוליגודנדרוגנזה בתגובה לגורמים ניסויים. אוליגודנדרוגנזה יעילה היא המטרה הטיפולית בתחומי מחקר רבים, כולל פגיעות בחוט השדרה, היפוקסיה ניאונטלית ומחלות דמילינציה כגון מיאליטיס טרנסברסית וטרשת נרכים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת פרוטוקול לבידוד של מספרים גדולים של OPCs עם שיטה מהירה ואמינה לקביעת האוליגודנדרוגנזה במספר תנאי ניסוי בו-זמנית.כדי להתחיל בהליך זה, עקרו את כל ציוד הניתוח באמצעות מכשיר עיקור בחרוש חרוש חם. לאחר מכן, הוסיפו 15 עד 20 milliliters של PBS לשפופרת קונית של 50 milliliters. הניחו את השפופרת הקונית על קרח, והשתמשו בה להחזקת רקמת הקורטקס החתוכה בזמן הניתוח.בשלב הבא, הוסיפו PBS קר לצלחית פטרי בקוטר 10 סנטימטר, שתשמש לנתיחה תחת מיקרוסקופ אור. לאחר הקטלת גורי החולדה, גזרו את העור מאחורי האוזניים לאורך קו האמצע באמצעות מספריים קטנים, וקלפו את השוליים של העור לאחור.בשלב הבא, חתכו את הגולגולת לאורך קו האמצע, מגזע המוח ועד העיניים. השתמרו שלא לחתוך עמוק מדי כדי לשמור על מבנה הקורטקס שמתחתיו. לאחר מכן, בצעו שני חתכים לטראליים תחת השחמון על ידי הכנסת מספריים כירורגיים קטנים לתוך ה-foramen magnum.בצעו חתך נוסף בין העיניים, קדמה לבצולבים הריחוניים. קלפו בזהירות כל חצי של הגולגולת לאחור. הוציאו את המוח כולו והניחו אותו בצלחת פטרי של 10 centimeter ממולאת ב-PBS קר.תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר את הבצלילים הריחניים ואת המוח הקטן באמצעות פינצטה כירורגית עדינה. הפוך את המוח כך שהפני השטח הוונטרליים יהיו גלויים. לאחר מכן, באמצעות פינצטה ישרה ועדינה, בצע דיסקציה קהה על ידי הנחת קצות הפינצטה סגורים בין הקורטקס להיפותלמוס, עד לעומק של כשני שלישים מהמוח.פתחו את הפינצטה ברגע שהיא במקומה, ולאחר מכן חזרו על הפעולה עבור ההמיספרה השנייה. לאחר מכן, הפרידו בעדינות את הקורטקס מאזורי ההיפותלמוס והמוח האמצעי. הסירו את ההיפותלמוס, התלמוס והמוח האמצעי על ידי החזקת המוח האמצעי במשטח האחורי שלו וקילופו לכיוון הקצה הקדמי של המוח.לאחר מכן, נתקו את הקשרים הקדמיים (anterior). באמצעות פינצטה כפופה ועדינה, הסירו את ההיפוקמפוס ונתקו את קשרו לקליפת המוח (cortex). לאחר מכן, הסירו את שארית הסטריאטום (striatum) על ידי גירודו מקליפת המוח שמתחתיו בתנועה אלכסונית כלפי חוץ.יש להסיר את כלי הדם ואת הקרומיות מהפני השטחי הגבוני (ventral) של קליפת המוח. לאחר מכן, הפוך את המוח כך שהפני השטחי הגבי (dorsal) יהיה גלוי. קלף את הקרומיות מקליפת המוח שמתחתיה נמצא הפקעת הריחית (olfactory bulb).חזור על הפרוצדורות עבור סך של שלושה עד ארבעה גורי חולדה. והנח את כל קליפות המוח (cortices) שבוצע להן דיסקציה בתוך צלחת פטרי. קצץ אותן בעזרת להב תער סטרילי עד לקבלת נתחים של 1 mm על ידי 1 mm.לאחר מכן, אספו את הרקמות על ידי שטיפת הצלחת ב-PBS לפני החזרתה לקרח. כעת, באמצעות פיפט פסטור מזכוכית המחובר לבקר פיפט, בצעו דיסוציאציה מכנית של הרקמה על ידי פיפטור עשרה עד חמישה עשר פעמים, או עד שחלקי הרקמה יקטנו והתמיסה תהפוך לעכורה. לאחר מכן, החזירו את הדגימה לאינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך 15 דקות תוך סיבוב רציף.לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של PBS לכל דגימה וסננו את ההומוגנאט דרך מסנן עם נקבים של 40 micrometer המונח על מבחנה של 50 milliliters. לאחר מכן, שטפו את המסנן ב-one to two milliliters נוספים של PBS. רכזו את כל דגימות ההומוגנאט למבחנה קונית אחת של 50 milliliters ובצעו ספירה כוללת של התאים.לאחר ביצוע ספירת התאים, חלקו את ההומוגנאט באופן שווה למבחנות קוניות של 15 ml, וסובבו אותן בצנטריפוגה למשך 10 עד 12 דקות ב-300 gs. הכינו כל עמודת LS על ידי הוספת 5 ml של בופר עמודה. אספו את הנוזל שעבר (flow through) למבחנה קונית של 15 ml.לאחר שבאפר העמודה עבר לחלוטין דרך התא העליון, העבר 1000 µL של תרחיף התאים לכל עמודה ואפשר לתאים לעבור באמצעות כוח הכבידה. לאחר מכן, הוצא כל עמודה והנח אותה בתוך מבחנה קונית של 15 mL. הוסף 5 mL של באפר עמודה ודחף את הבאפר במהירות דרך העמודה כדי לשחרר את התאים הקשורים ולהוציאם מהעמודה.לזריעת התאים, יש לדלל אותם במצע להתרבות OPC לריכוז של 60,000 תאים למיליליטר. יש להעביר בפיפטה 500 microliters של תאים לאורך הדופן של כל באערה שחורה בעלת תחתית שקופה בלוח של 24 באערים. יש לערבב את התאים על ידי ניעור אופקי של הלוח בתנועת שמינית.בנוהל זה, הנח טיפ של פיפט 200 µL מעל פיפט פסטור מזכוכית כדי להבטיח שהבאר לא תינזק במהלך השאיבה. לאחר מכן, שאב את המצע מבארי התרבית עבור קבוצת טיפול אחת בכל פעם כדי למנוע ייבוש של התאים. לאחר מכן, הוסף באיטיות 500 µL של תערובת מאסטר לטיפול לאורך דופן הבאר באמצעות פיפט של 1 mL.דגרו את התרביות ובצעו החלפה מלאה של המצע למצע טיפול טרי מדי יומיים עד שלושה ימים. בתום תקופת הטיפול הרצויה, שאבו את המצע. הוסיפו באיטיות 400 microliters של PFA לדופן הבאר כדי לקבע את התאים.דגרו את הפלטה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות, שאבו את ה-PFA והוסיפו לאט 500 µl של D-PBS סטרילי כדי לשטוף את התאים. חזרו על השטיפה פעמיים נוספות ואל תשאבו את השטיפה האחרונה.כעת, הביאו את הפלטה לטמפרטורת החדר, שאבו את הבארות והוסיפו 250 µL של D-PBS המכיל 5% NGS ו-0.1% Triton x-100. דגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם ניעור אורביטלי עדין. הכינו את תמיסת הדגירה הראשונית על ידי דילול של נוגדן monoclonal anti MBP מעכבר ונוגדן polyclonal anti olig2 מארנב ב-D-PBS המכיל 5% NGS.לאחר מכן, דגרו את הנוגדנים הראשוניים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה, בין 16 ל-18 שעות, תוך ניעור אורביטלי עדין. בזמן שטיפת הפלטה, הכינו את תמיסת הדגירה המשנית על ידי דילול של נוגדני anti mouse 680 ו-anti rabbit 800 ב-D-PBS המכיל 5% NGS. לאחר מכן, שאבו את השטיפה האחרונה והוסיפו 250 microliters של תמיסת דגירה משנית.הגנו על הפלטה מאור והדגירו אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת תוך כדי ניעור אורביטלי עדין. לאחר מכן, סרקו את הפלטה באמצעות מערכת דימוי המסוגלת לזהות פליטות פלואורסצנציה של 700 nanometer ו-800 nanometer. כנקודת התחלה, הגדירו את ה-focal offset ל-3, ואת הרגישויות ל-1.5 עבור MBP, ל-5.0 עבור actin, ול-3.5 עבור olig2.כוון את ערכי הרגישות לפי הצורך כדי למנוע חשיפת יתר של האות. בסכימה זו, בדיקת ה-DIFS מתחילה עם תאי OPC של חולדה חיוביים ל-A2B5 שבודדו טריים והוצבו בכלי תרבית מצופים ב-PLL. תרביות אלו מורבות במשך שלושה ימים בנוכחות 20 ng/mL של PDGFAA, ולאחר מכן מטופלות בגורמים ניסיוניים במצע טרי נטול PDGF ביום אפס.מדיום הטיפול מוחלף באופן מלא ביום השני. והתאים מקובעים ב-4% paraformaldehyde ביום הרביעי. כאן, בוצע אימונוציטוכימיה עבור olig2 ו-MBP בתרביות מייצגות ביום אפס וביום הרביעי, תוך שימוש ב-Dapi כצביעה נגדית לגרעין.תרביות אלו מראות צביעה קוסטיתטיבית עבור סמן התאים של שושלת האוליגודנדרוציטים, Olig2, בימים אפס וארבעה. לעומת זאת, צביעה עבור סמן האוליגודנדרוציטים הבשלים MBP הייתה ניכרת רק ביום הרביעי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לטהר, לתרבת ולהבדיל תאי OPC של חולדה החיוביים ל-A2B5, וזאת כדי לכמת את השפעתם של גורמים ניסויים על אוליגודנדרוגנזה.זיהוי גורמים המקדמים אוליגודנדרוגנזה הוא בעל רלוונטיות מיוחדת למחקר של מחלות דמיליניזציה, כגון טרשת נפוצה. לאחר ששיטות העבודה המתוארות כאן יישלטו, הן עשויות לסייע בזיהוי גורמים אלו ובפיתוח טיפולים תרופתיים טובים יותר בסופו של דבר.

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מאמר זה מתאר שיטות להפיק אוכלוסיות מועשר Murine של תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) בתרבות העיקרי, אשר להבדיל לייצר oligodendrocytes בוגרת (OLS). בנוסף, דו"ח זה מתאר את טכניקות כדי לייצר Murine myelinating שיתוף תרבויות על ידי זריעת OPCs העכבר על המיטה neurite של הגב עכבר שורש עצב הגנגליון (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

ראשוני, תאים אנושיים עובריים מופקים ממוח, multipotential progenitor...

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

סרטון וידאו זה מדגים את ההליך לבודד נוירונים של גנגליון רשתית (RGNs) מהרשתית של חולדה ולעבד אותם יחד עם תאי גליה (OEG). שיטה זו מאפשרת לחקור את הפוטנציאל הנוירו-רגנרטיבי של OEGs לאחר פגיעה עצבית.

טיפוח של נוירוני גנגליון ברשתית עם גליית מעטפת חוש הריח

הסרטון מדגים פרוטוקול להבחנה של תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) לאוליגודנדרוציטים וגרימת מיאלינציה בתרבית משותפת עם נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG). ה-OPCs מומרים עם וקטורים לנטי-ויראליים המקודדים חלבון איתות המווסת את המיאלינציה. ה-OPCs המומרים מתורבתים יחד עם נוירוני DRG כדי להעריך את ההתמיינות לאוליגודנדרוציטים ואת המיאלינציה הנגרמת על ידי חלבון איתות.

בדיקת מיאלינציה הנגרמת על ידי התמרה חוץ גופית עבור תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים

מקור: Schott, J. T., . הכנת תרביות אב של אוליגודנדרוציטים של חולדות וכימות של אוליגודנדרוגנזה באמצעות סריקת פלואורסצנציה אינפרא אדום כפולה. J. Vis. exp. (2016).  }סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיה פלואורסצנטית כפולה כדי להעריך את ההתמיינות של אוליגודנדרוציטים מתאי מבשר (OPCs) שבודדו ממוח של גור חולדות. התהליך כולל קיבוע התאים, תיוג סמנים ספציפיים עם נוגדנים משניים ראשוניים ומצומדים פלואורופור, והדמיה שלהם באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. מזוהים אוליגודנדרוציטים מובחנים המבטאים הן את החלבון הבסיסי של...

הדמיה פלואורסצנטית כפולה לזיהוי אוליגודנדרוציטים מובחנים

מקור: Portela-Lomba, M., et. al. קוקולטורה של נוירונים של גנגליון רשתית של חולדה עם גליה מעטפת ריח, כמודל במבחנה של התחדשות אקסונלית בוגרת. J. Vis. exp. (2020). סרטון זה מדגים הדמיה וכימות של התחדשות אקסונלית בתאי עצב גנגליון רשתית של חולדות אקסוטומיות (RGNs) בתרבית משותפת עם תאי גליה עוטפים ריח אנושיים אימורטליים. RGNs הם בעלי תווית חיסונית, עם סומות אדומות ואקסונים ירוקים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, ואחוז הנוירונים עם אינדקס התחדשות אקסוני ואקסונלי כומת באמצעות תוכנת...

הדמיה וכימות של התחדשות אקסונלית בנוירונים של גנגליון רשתית של חולדה

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

להלן, אנו מציגים שיטה יעילה לטיהור של oligodendrocytes הפוך וייצור של מדיום אוליגודנדרוציטים ממוזג שניתן להשתמש בהם לניסויים בשיתוף התרבות.

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.

שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

למדו לבודד ולגדל תאי OPC מקליפת המוח של עכברושים ולכמת תהליכי oligodendrogenesis בתרביות תאים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ואמינה של השפעת גורמים ניסיוניים על תהליכי מיאלינציה במערכת העצבים המרכזית.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

גלה סרטונים נוספים