Name: תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: למד לתכנן ולארוז וירוסי רטרו ולנטי CRISPR בעלי כייל גבוה להזרקה סטריאוטקטית למוח העכבר. שיטה זו מאפשרת חקר תפקידי גנים בהפרעות נוירולוגיות ללא צורך ביצורים מהונדסים גנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי נין להעניק R01MH097949 ואת Autism Speaks פיילוט גרנט 7359 כדי BWL ואת Instrumentation משותף דימות אופטי נוריס כותנה Cancer Center גרנט P30CA023108.

<ol><li>Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077(2011).</li>
<li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li>
<li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li>
<li>Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method">http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method</a> (2015).</li>
<li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30(2014).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ישנם כמה שלבים קריטיים שחשובים אריזת ויראלי מוצלחת. Cell בריאות היא קריטית לפני ובמהלך transfection, כמו תאים בריאים יפחיתו את כמות הנגיף מיוצרת מאוד. אם transfection ואריזה מצליחים, אז 100% של התאים צריכים לבטא את fluorophore והתאים צריך להקים syncytium פונקציונלי. בשלב 3.2.4, הקשה על הצינור הוא הכרחי transfection-כייל גבוה ביעילות, ואת ה- pH של תמיסת מלח HEPES שנאגרו חייב להיות מדויק. Maxi-preps המייצרים פלסמידים הדרושים אריזה ויראלי חייב להיות טהור מאוד. עד כה, זה מועיל כדי אתנול לזרז את elution DNA הסופי מחדש להשעות במאגר טריס-EDTA. זה גם מאוד חשוב להפחית את כמות בסרום עד 2% או פחות בתקשורת כי קפאין מתווסף ביום 6 (שלב 3.4) לפני אוסף ויראלי. אם בסרום לא מצטמצם, אז הנגיף המטוהר הסופי יכיל כמות רצויה של prot בסרוםעין. שימוש פוליאתילן גליקול 6000 כאשר מזרזים חלקיקים הנגיפיים כולל הכרח ultracentrifugation. כמו כן, חשוב לציין כי וירוסים המכיל Cas9 CRISPR בדרך כלל יש כייל סביב פי 10 פחות וירוסים אך ורק המכיל fluorophore. עבור הניתוח stereotaxic, השימוש בחומרי הרדמה נשאפים מאפשר שליטה מהירה ומדויקת או התודעה של החיה לעומת הרדמה בזריקות ומאפשר הרדמה על פני טווח גילאים גדול. חשוב מאוד לשמור על מכשירי ניתוח נקי וסטרילי, יחד עם מיקוד לשחזור דורש המיקום המדויק של הראש. ודא שאין התנדנדות או גלגול של הראש במכשיר stereotaxic וכי הגולגולת מרגישה במקומו. זה יכול להיות שימושי כדי לאפשר הגולגולת להתייבש כדי למצוא את התפרים כדי לקבוע את הקואורדינטות stereotaxic. כמו כן, שיעור ונפח לכל stereotaxic לתאם צריך להיקבע באופן אמפירי. טכניקה זו המגביל כי ההתפשטות של lenti- או רטרו-וירוס מוגבלת, במיוחד בהשוואת וירוסי adeno קשור (AAVs) .לכן, וירוסים אלה הם בעלי ערך כאשר מדביקים אזור במוח בדיד, אך לא עבור זיהום כולל קשור AAVs המשמש ניתוח התנהגות בבעלי חיים. שימוש קפאין בפרוטוקול זה מגדיל מאוד את כייל של וירוסים אלה, אך הם עדיין לא גבוהים כמו titers מושגת באריזת AAV. כמו כן, שילוב יציב הוא רק יתרון ביטוי fluorophore, כמו CRISPR / Cas9 טפסי עריכות גנומי יציבים גם כאשר transfected זמני ויתכן כי על-הולך ביטוי Cas9 ו sgRNA עשוי בסופו של דבר לייצר את השפעות היעד. הביטוי חולף מערכת CRISPR / Cas9 עם AAVs מספיקה כדי לייצר שינויים גנומית מופצים ברחבי חלוקות תא, לעומת זאת, ביטוי fluorophore לא יישמר. יצירת lenתדהמה ו רטרווירוסים ניצול מערכת CRISPR / Cas9 יהיה להקנות את היכולת למקד כל גן הרומן במגוון רחב של אורגניזמים. היעילות של עריכת גן נראית תלוי ברצף של RNA מדריך מיקוד מחשוף Cas9. זה כבר נקבע באופן אמפירי כי בין 10% ו -80% של שיבוטים מכילים indels לאחר רצף נגועים בתאי Neuro2A. זהו כיום ידועים אם תדרי indel מחושבים בתאי Neuro2A הם שיקוף של אלה בנוירונים. מדריך תוכנות עיצוב RNA כגון Benchling חברה כוללות ציון &quot;על היעד&quot; שעשויה להיות מסוגל לחזות את היעילות של רצף מטרה נתון. באיזו מידה &quot;על היעד&quot; כגון ציונים הם צרכימים ואמינים להיקבע באופן אמפירי בנוירונים ותא-סוגים אחרים כמערכת CRISPR-Cas9 הופך יושם באופן נרחב יותר. Lentivirus מבוסס ייצור חיים מהונדס כבר variably מוצלח עם דיווחים כי transgenes נמסר lentivirus להפוך סיlenced 11. עריכת גן CRISPR בתיווך של ה- DNA עשויה להיות מועברת דרך הקו ניבט ליצור מודלים של בעלי חיים שלמים. לפיכך, עריכת גנומי יציבה עשויה להיות ברת השגה למרות והשתקת fluorophores ויראלית נמסר transgenes Cas9. זה עשוי לספק פלטפורמה יעילה עבור שינויים גנומית ממוקדים. משלוח ויראלי של מערכת CRISPR / Cas9, ואילו מעתה אין צורך האורגניזם המהונדס, הוא משלים טכניקות אלה. לדוגמה, הזרקת חלקיקים נגיפיים כגון לתוך חיים מהונדס תרכובת inducibly מבטא opto- או הכימותרפיה הגנטי תלוי Cre ו Cre transgenes אמור להקל מחקרים מורכבים לתוך מערכת היחסים בין מניפולציות גנטיות הפעילות העצבית. דוגמה שנייה היא לספק אלה חלקיקים נגיפיים Cas9 / sgRNA לתוך בנוקאאוט מותנה בניסיון למסך אינטראקציות גן-גן. לבסוף, אחר מסלול מרגש של מחקר זה הוא ההקרנה של פנוטיפים ותרכובות טיפוליות תאים שמקורם בחולה, אשר יכולהלשמש כדי לאמת ולגלות רשתות גנטיות כי הם שיבשו במחלות שונות.

כדי ללמוד את הבסיס של פיזיולוגיה נורמלית והפתולוגיה מחלה, יש צורך לתמרן ביטוי גנים בדיוק אורגניזמים מודל. עבור אורגניזמים מודל יונקים, זה הוא מרוכז בעיקר על היצירה והפיתוח של עכברים מהונדסים שבו מרכיב גנטי של ריבית מוקף אתרים מוכרים על ידי recombinase. זה יכול לגרום מניפולציה אתר ספציפי של גנים ולצדו אלה. אמנם זה כבר אסטרטגיה מוצלחת, זה זמן ומשאבים רבים; למשל, יצירת חיים מהונדסים משולשים שיבטאו גן floxed, recombinase Cre, ואת גן כתב Cre דורשת הזדווגויות ואימות מרובות. לעומת זאת, הזרקת stereotaxic של שכפול חלקיקים נגיפיים פגומים קידוד חלבון פלואורסצנטי ואת recombinase לתוך חית גן floxed אינו מחייבים גנוטיפ מורכב או אסטרטגיות רבייה 1. יתר על כן, אם חלבון פלואורסצנטי ו Cre להביע וירוס הוא שיתוף מוזרק עם enco וירוס שנידינג חלבון פלואורסצנטי שונה, אז זה מספק שליטה בתוך הרקמות עבור המניפולציה הגנטית הממוקדת. בעוד אסטרטגיה זו עדיין דורש את השימוש בבעלי חיים עקום, אסטרטגיות מבוססות RNA בתיווך ויראלי לעקוף את הצורך חיות טרנסגניות. לדוגמא, הזרקת stereotaxic של וירוסים שכפולים מחסרת המקודדים חלבון פלואורסצנטי ו RNA מכבנה קצרה (shRNA) יכולה להשתמש מכונית RNAi אנדוגני של התא כדי לגרום לירידה חזקה לפרוטוקול של גן של עניין. עם זאת, אסטרטגיות shRNA לייצר דפיקה ומורדות גן עדין ופעמים רבות תוצאת פנוטיפים הסלולר צנוע 2. בעוד למטה דפיקה עשוי להיות רלוונטי יותר פיסיולוגי לטיפול באין גן הטרוזיגוטיים, חוסן הירד שלה לעומת פסק דפיקה אינו אידיאלי עבור גילוי פנוטיפי של גנים חדשים. טכניקה שלישית שנוצרה לאחרונה, CRISPR (באשכולות קבוע Interspaced חזור קצר Palindromic) / Cas9 (CRISPR הקשוריםחלבון 9) מערכת, מסתמך על הביטוי הן של RNA אקסוגניים קטן אנזים חיתוך DNA. המערכת CRISPR / Cas9 הותאמה ממערכת החיסון פרוקריוטים אשר פיתחו שיטה לזיהוי זרים, פולשים DNA מפני וירוסים ותוכנות מיקוד זה שעומד לעבור פירוק באמצעות האנזים Cas9 3,4. טכניקת עריכת הגנום עצמה זה יכול לשמש ליצירת מחיקות ממוקדות, הוספות, ומוטציות; ואת הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לבצע מחיקות בתוך גן של עניין על מנת המפסיד יוצא ביטויו vivo. אנזים Cas9 חייב לבוא לידי ביטוי עם RNA מדריך הומולוגי אל האזור של עניין ורציף עם RNA פיגום. נוק של גן באמצעות טכניקה זו דורש מיקוד Cas9 לאזור מסוים בגנום באמצעות RNAs מדריך הסינטטי (sgRNA), ואת גרימת הפסקות גדילים כפולות (DSBs) באתר של עניין. DSBs אלה הם תוקנו לאחר מכן על ידי מכונות לתיקון תאים אנדוגני באמצעות הצטרפותו קצה שאינם הומולוגיים (NHEJ) אשר leמודעת indels שעשוי לייצר מוטציות missense או שטויות ולכן יכול ליצור פסד של ביטוי חלבון פונקציונלי 5. מכיוון שהמערכת הזו מייצרת שינויים גנומיים, זה רק דורש את הביטוי החולף של Cas9 ו sgRNA. עם זאת, רצוי אינדיקטור ניאון יציב כדי לזהות תאים וצאצאיהם המנוהלים באופן זה. יש Lenti- ו רטרווירוסים היתרון של שילוב הדנ&quot;א של עניין ביציבות לתוך התאים המארחים המקיימות ביטוי לטווח ארוך מועברים לתאי הבת במהלך מיטוזה. פרוטוקול זה מתאר את העיצוב והייצור של שני סוגים של שכפול פגום, רטרווירוסים כייל גבוה: חלקיקי lentiviral נגזרות וירוס הכשל החיסוני האנושי (lentivirus) ואלה המבוססים על וירוס murine מאלוני לוקמיה (רטרו-וירוס). בעוד שני הנגיפים הללו מסוגלים לתמוך יציבה מביעה של transgenes הגדול, חלקיקי retroviral יכולים לשלב רק לתוך הגנום duחלוקת תא טבעת עם השפלה של מעטפת הגרעין, ולכן יכולה לשמש ככלי לתייג ולידת עדכני תאי 6. בעוד lentiviruses יש מוניטין של להיות נמוכה יחסית כייל 7, מתודולוגיה זו, ובכלל זה שימוש קפאין 8 במהלך איסוף ויראלי, מייצרת כותרות שגרתי של 10 9 ו -10 10 חלקיקים / מ&quot;ל. יתרון נוסף של lenti- ו רטרווירוסים הוא הסובלנות מוסיף מאוד גדול. האוסף של הפרוטוקולים הבאים מתאר את הליך תכנון lenti או רטרו-וירוס קידוד כתב ניאון, sgRNAs, ו Cas9 כדי לנצל את המערכת CRISPR / Cas9 לשנות DNA וכן להביע חלבון פלואורסצנטי. עכבר נוירוכירורגיה stereotaxic היא שיטת ערך להזרקת וירוסי in vivo ללמוד מורפולוגיה, פונקציה, וקישוריות של נוירונים נגועים. זיהום ויראלי בנוירונים יכול לשמש כדי לתפעל רמות ביטוי על פני תקופה ממושכת של טיםדואר, כגון במהלך התפתחות, וביטוי ניתן לשלוט במדויק על ידי השימוש במערכות שונות סמים מושרים וביטוי ספציפי מונע Cre. פרוטוקול מסוים זה מסביר כיצד להזריק וירוס בעת sgRNA ו Cas9 כדי המפסיד יוצא גן של עניין במוח של עכבר בוגר. עכברים להתאושש מהר מאוד מהליך זה וביטוי של transgene ויראלי ניתן לראות בתוך ההזרקה 48 שעות. עם זאת, הביטוי fluorophore מופיע להגדיל במשך שבועות וכתוצאה מכך רמות מקסימלי בסמוך 3 שבועות לאחר ההדבקה. עכברים לעבור הזרקת stereotaxic ויראלי יכול לשמש התנהגות, אלקטרופיזיולוגיה, או מחקרים מורפולוגיים. בסך הכל, המטרה של נהלים אלה היא להדגים כיצד מפסיד יוצא גן במוח העכבר הבוגר באמצעות ניתוח stereotaxic ו וירוס להביע sgRNA ספציפי Cas9.

<table><tbody><tr><td colspan="4">List of Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>293FT קו תאים</td><td>Life Technologies</td><td>R700-07</td><td>עבור Lentivirus</td></tr><tr><td>293GP קו תאים</td><td>Clontech</td><td>631458</td><td>עבור Retrovirus</td></tr><tr><td>Iscove שינוי של DMEM (IMDM)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>IMDM מלא עם 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, ו-1% P/S</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>קורנינג</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)</td><td>קורנינג</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין, 100x (L-Gln)</td><td>קורנינג</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין, 100x (P/S)</td><td>קורנינג</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן 10&nbsp; ס"מ צלחת</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">List of Transfection Reagents</td></tr><tr><td>5&nbsp; צינורות פוליסטירן מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2)</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>C69-500</td><td>הכינו תמיסה של 2.5 מ' בנתרן כלורי (><><NaCl</td></tr><tr><td></td><td>)Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>פישר מדעי&nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x תמיסת מלח חומצית HEPES (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 מ"ל: 8.2 גרם NaCl, 5.95&nbsp; גרם HEPES, 0.106 גרם Na2HPO4, pH 7.01 (בדיוק!)</td></tr><tr><td>קפאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; יחידת מסנן מזרק M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLGV033RS</tr><tr><td>0.45 ומיקרו; יחידת מסנן מזרק M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td>מזרק</td></tr><tr><td>SLHP033RS 60 סמ"ק L/L</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>352098</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול&nbsp; &nbsp; 6000 (PEG 6000)</td> <td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) פוספט חוצץ מלח (PBS)</td> <td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוס תורם</td><td></td><td>Cellgro 35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-GFP, ארנב, 488 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ריאגנטים לניתוח סטריאוטקסי</חזק</td></tr><tr><td>>וטרינר מזרק וטרינר להשתמש במזרק T.B. רק 1 סמ"ק Luer slip T.B. 100/bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל נירוסטה, #10, 100-pk</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>משחת דמעות מלאכותית</td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח רגילה&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>משחה אנטיביוטית משולשת&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&reg; חבילת מחטים רכה 25 גרם x 5/8 אינץ'</td> <td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 תפרי משי</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו crispr כייל גבוה ו lentiviruses באמצעות stereotaxic הזרקת

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

שכפול לנטי-וירוסים פגומים או רטרו-וירוסים מסוגלים לשלב ביציבות טרנסגנים בגנום של תא מארח נגוע. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב לקידוד חלבונים פלואורסצנטיים, בקרים אופטו-גנטיים או כימו-גנטיים של פעילות התא, או ביטוי הטרולוגי של גנים אנושיים באורגניזמים מודלים. וירוסים אלה שימשו בהצלחה גם להעברת רקומבינאזות לאתרי מטרה רלוונטיים בבעלי חיים טרנסגניים, או אפילו לספק סיכת ראש קטנה או מיקרו RNA על מנת לתמרן את ביטוי הגנים. בעוד שטכניקות אלה היו פוריות, הן מסתמכות על בעלי חיים טרנסגניים (רקומבינאזות) או לעתים קרובות חסרות יעילות וסגוליות גבוהות (shRNA/miRNA). לעומת זאת, מערכת CRISPR/Cas משתמשת בנוקלאז Cas אקסוגני המכוון לאתרים ספציפיים בגנום של אורגניזם באמצעות RNA מנחה אקסוגני על מנת לגרום לשברים דו-גדיליים ב-DNA. הפסקות אלה מתוקנות לאחר מכן על ידי חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ), ומייצרות מוטציות החדרה ומחיקה (indel) שעלולות לגרום למוטציות מזיקות או שטויות. כתב יד זה מספק שיטות מפורטות לתכנון, ייצור, הזרקה ואימות של חלקיקי וירוס בודדים/רטרו שיכולים להמיר נוירונים ביציבות כדי לבטא מדווח פלואורסצנטי, Cas9 ו-sgRNAs כדי להפיל גנים באורגניזם מודל.

בעקבות &quot;פרוטוקול עיצוב Strand מדריך (sgRNA) עבור CRISPR / Cas9 רטרו-וירוס&quot;, oligos מיקוד רצף מסוים מוכנסים לתוך וקטור שיבוט PXL במורד הזרם של האמרגן hU6 או במורד של פיגום RNA מדריך שימוש באתרי שיבוט BbsI (איור 1, שלב 1). SgRNA זה הוא נכרת אז מן PXL ו מוכנס לתוך עמוד השדרה pRubi באמצעות אתרי BstBI ו פאצ&#39;י (איור 1, שלב 2). לבסוף, אחר sgRNA משובטים לתוך PXL ניתן למקם במורד הזרם של המדריך הראשון pRubi-Guide1 (איור 1, שלב 3), מיקוד לאזור אחר של הגן והגדלת הסיכוי בנוקאאוט דרך NHEJ. אימות של המבנים הנכונים צריכה להיקבע על ידי ניתוח רצף. ברגע מבנה זה הוא עשה, זה יכול להיות ארוז לתוך וירוס בעקבות &quot;פרוטוקול רטרו / Lentiviral Production- CaPO4 שיטה&quot;. אריזה מוצלחת אושר על ידי זיהום של וירוס לתוך HEK293 תאים כדי titer נirus. אם אין ביטוי fluorophore אז הנראה אירעה שגיאה במהלך האריזה של הנגיף. איור 2 הוא תוצאת נציג של 2 רטרווירוסים, GFP אחד להביע ואת mCherry לבטא אחרים, שיתוף מוזרק לתוך gyrus המשוננת של עכבר בילוד (7 ימים) צלם 21 ימים לאחר הזרקה. תיוג של נוירונים עם mCherry או GFP מאפשר הערכה מורפולוגית של מניפולציות גנטיות שונות באותה רקמה, שבו וירוס אחד יכול להביע CRISPR / Cas9 בתיווך KO ואת וירוס בקרה אחרים, להביע fluorophore בלבד. הזרקת Stereotaxic מאפשרת סלקטיביות אנטומיים מדויקות כפי שהודגם על ידי הזיהום הדיסקרטי של קואורדינטות המיועדות, gyrus המשוננת. כשמנתחים חלקים במוח לזיהום, חשוב לשמור הרקמה שמסביב עד שהוא נחוש כי האזור האנטומי הנכון היה נגוע. אם אין כל סימן של זיהום, אז זה אפשרי כי ההזרקה התרחשה אזור שכנהד ניתן לזהות בסעיפים שמסביב. זה גם יכול להיות מועיל כדי לאתר את מסלול מחט למצוא באזור ההזרקה המדויק. וירוסי Pseudotyped VSVG לעתים רחוקות פרושים של השולים של gyrus המשוננת כאשר הוא מוזרק in vivo, נוטה להתפשט לאורך תאי מדביק ציר המקוריים / זנב לאורך gyrus המשוננת כולו, כמו מנותח על ידי שחזור 3D (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> איור 1:. האסטרטגיה שיבוט עבור פלסמיד pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR retroviral אסטרטגיה זו היא זהה עבור פלסמידים lentiviral מבוססי FU. oligos sgRNA הם annealed ונוסף PXL באמצעות אתרי שיבוט BsbI. לאחר רצף על מנת להבטיח כי sgRNA מוכנס לתוך בהצלחה PXL, לעכל את הפלסמיד עם BstBI ו פאצ&#39;י. את הכנס כי הוא נשר (קופסא שחורה) הוא משובטים מכן לתוך ב ויראלי בחזרהאחד (שחור מנוקד קווים) pRubi-Guide1 CRISPR. SgRNA שני גם יכול להיות מוכנס לתוך PXL ולעכל החוצה באמצעות האנזים פאצ&#39;י. זה הוא משובטים מכן לתוך וקטור CRISPR pRubi-Guide1 (קווים מקווקווים אדום) באמצעות אתר פאצ&#39;י. הפלסמיד כתוצאה מכן מכיל שני גדילי מדריך כמו גם אלמנטים ויראלי הצורך, יזמים, ו fluorophores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> איור 2:. הזרקת retroviral של gyrus משוננת עכבר Retroviruses להביע mCherry (אדום) או GFP (ירוק) הוזרקו gyrus משוננת של עכבר P7. 21 ימים לאחר מכן העכברים היו perfused ואת המוח מחולק ומוכתם עבור GFP ו mCherry. (א) תמונת ניאון רחב בתחום 5X מציגה את יחסי הציבורecision של זריקת gyrus המשוננת ואת הספציפיות של נוירונים גרגיר gyrus משוננים תיוג. המורפולוגיה של ההיפוקמפוס ניתן לראות באמצעות מכתים DAPI (הכחול). סרגל קנה מידה מודד 200 מיקרומטר. (ב) תמונה ניאון 10X רחב בתחום מוכיח כי lentiviruses כייל גבוה אלה להדביק מספר גדול של תאים מורפולוגיה אשר ניתן לגשת דרך ביטוי fluorophore. סרגל קנה מידה מודד 100 מיקרומטר. וירוסים (C) להביע GFP או mCherry היו שיתוף מוזרקים לתוך gyrus המשוננת. באמצעות מערכת של רטרווירוסים, אפשר להשתמש וירוס אחד לעשות מניפולציה גנטית כזו מאופיינת GFP ועוד מניפולציה בסימן mCherry, ולאחר מכן להעריך את השינויים יחידים או כתוסף בשל כל וירוס. סרגל קנה מידה מודד 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> איור 3:. האנטומי התפשטות הזרקת lentiviral coinjection Stereotaxic<html> של וירוס ה- GFP-shPten ו וירוס מלא mCherry לתוך המוח של אדם מבוגר PTEN loxP / + העכבר הביא התפשטות ויראלית לאורך הציר המקורי / זנב כולו של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס. הדבר בא לידי ביטוי שחזור 3D של מידת ההזרקה שבו נסגרה קווי מתאר של ההתפשטות ויראלית אותרו למעלה מ -21 קטעי סדרתי (Z = 50 מיקרומטר / קטע) באמצעות תוכנת שחזור. העתקים קונטור היו מיושרים אז כדי ליצור את תמונות 3D עבור כימות היקף. סה&quot;כ התפשטות ויראלית מוצגת בירוק (נפח = 54,730,800 מיקרומטר 3) וממרח משונן-מקומי מוצג סגול (נפח = 27,275,200 מיקרומטר 3). הווירוס מתפשט לאורך מסלול המחט ואת כפיס המוח בצומת של מסלול מחט בנוסף ממלא את ציר הזנב / המקורי של gyrus המשוננת. סרגל קנה מידה מודד 200 מיקרומטר. les / ftp_upload / 53,783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; משלימה וידאו 1. עיצוב של sgRNAs לשבט לתוך עמוד השדרה retroviral ו lentiviral. ב RNA מדריך סינתטי זה למשל עיצוב (sgRNA), רצף הגנום של CHD8 העכבר להוריד מאתר צמח השדה. קודון ההתחלה ומבנה אקסון הם דמיינו אז וקטור NTI. זה מאפשר לנו להעתיק את האזור הגנומי סביב אקסון הקידוד הראשון וזן רצף זה לתוך Benchling. Benchling מאפשר לנו לדמיין כל sgRNAs הפוטנציאל באזור. יתר על כן, לאחר המציינת את האזור הגנומי יש לנו קלט, Benchling יראה לנו ציונים על-היעד מחוץ היעד עבור כל RNA מדריך. המשתמש יכול ולאחר מכן בחר את הרנ&quot;א מדריך עם עשרות מאזני וחוץ-היעד הגבוה ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לאפשר לחוקרים לתכנן ולארוז וירוסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי, CAS9 ו-sgRNAs, ולאחר מכן להזריק אותם באופן סטריאוטקסי למוח העכבר.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות ספציפיות בתחום מדעי המוח, כגון תפקידם של גנים העומדים בבסיס הפרעות נוירולוגיות והפרעות התפתחותיות-נוירולוגיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לבצע מניפולציה של גנים ספציפיים ללא התהליך הגוזל זמן ומשאבים של יצירת בעלי חיים שעברו הנדסה גנטית.לפני הכנת התאים, השתמש באתר אינטרנט כדי להפיק רצף מנחה של 20 נוקלאוטידים או sgRNA שישמש לתכנון אוליגו-נוקלאוטידים רצף-יחיד. לאחר הזמנת האוליגו-נוקלאוטידים ושימוש בהם ליצירת פלסמיד סופי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, המשך על ידי העברת כל התאים שהופשרו מקריו-מבחנה (cryotube) למבחנה קונית של 15 מיליליטר באמצעות פיפט. לאחר מכן, הוסף 2 מיליליטר של מצע IMDM מלא, מחומם מראש ומאוזן ב-CO2. לאחר מכן, סבב את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-500 ×g. לאחר מכן, שאב את העלייה (supernatant) והשהה מחדש את משקע התאים ב-10 מיליליטר של IMDM מלא. זרע את התאים בצלחת תרבית תאים של 10 ס"מ והדגר אותם למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C בתוך אינקובטור עם 5% פחמן דו-חמצני. 24 שעות לאחר הזריעה, החלף את המצע על ידי שאיבת המצע הקיים והוספת 10 מיליליטר של IMDM מחומם מראש. בצע פיצול (split) של התאים ברגע שהם הגיעו למצב של התלכדות (confluence). כדי לפצל את התאים, שאב את המצע ושטוף את הצלחת עם 5 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, הוסף לצלחת מיליליטר אחד של 0.25% trypsin והדגר בטמפרטורה של 37 °C עד שהתאים יתנתקו מהצלחת.לאחר מכן, הוסף 0.5 milliliters של IMDM כדי לנטרל את תגובת ה-trypsin והעבר את התאים באמצעות פיפט לשפופרת של 1.5 milliliter. לאחר מכן, סבב את התאים ב-500 ×g למשך חמש דקות. השהה מחדש את התאים ב-one milliliter של IMDM ודלל 10 µL של תאים ב-90 µL של PBS.ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) או סופר תאים אוטומטי, והעבירו אותם מחדש לצלחות עם IMDM מלא.ביום החמישי, החליפו את המצע שעתיים לפני הטרנספקציה וודאו שיש בדיוק 10 milliliters של מצע בצלחת בעלת קוטר 10 סנטימטר. לאחר מכן, הכינו את ריאגנטים הטרנספקציה עבור שתי צלחות באמצעות שתי מבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה בנפח חמישה milliliters. סמנו את המבחנה הראשונה כ-DNA ואת המבחנה השנייה כ-2X HBS. לאחר מכן, התאימו את ריכוז ה-DNA ל-one microgram ל-microliter ב-Tris EDTA ב-pH 7.4.להכנת ריאגנטים לטרנספקציה של Lentiviruses ורטרו-וירוסים, הוסיפו באיטיות את הרכיבים הדרושים למבחנה המסומנת DNA תוך써 נקישה רציפה על המבחנה לערבוב. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של 2X HBS למבחנה המסומנת 2X HBS. בשלב הבא, הוסיפו באיטיות 1 mL מהתכולה של מבחנת ה-DNA למבחנת ה-2X HBS, טיפה אחר טיפה. נקישו באופן רציף על מבחנת ה-2X HBS ועקבו אחר משקע סידן-פוספט שנוצר לאחר כל טיפה כדי לוודא יצירה מוצלחת של קומפלקסים לטרנספקציה. לאחר מכן, הדגירו את המבחנה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, הוסיפו 1 mL של ריאגנט הטרנספקציה בטיפות איטיות לכל צלחת תאים של 10 cm והדגירו את התאים למשך הלילה ב-37 °C.החליפו את המצע ביום השישי.ביום השביעי, העבירו את המצע המכיל חלקיקי נגיף באמצעות פיפט סרולוגית של 10 milliliter לשפופרת קונית של 50 milliliter לפני האחסון בטמפרטורה של ארבעה degree Celsius. לאחר מכן, הוסיפו שמונה milliliters של מצע 0.5% FBS לכל צלחת תאים.ביום השמיני, אספו את מצע התאים המכיל חלקיקים ויראליים ושלבו אותו עם הקציר מהיום הקודם בתוך מבחנה קונית בנפח 50 milliliter.בשלב זה, סנטריפוגו את העל-נוזל הוויראלי ב-2000 ×g למשך 10 דקות. לאחר מכן, טהרו את המדיום הוויראלי על ידי סינונו דרך מסנן מזרק של 0.45 µm בעל קישור חלבון נמוך. בשלב הבא, הוסיפו למדיום תמיסת polyethylene glycol 6000 בריכוז 5X. הפכו את המבחנה מספר פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, הדגירו את התערובת הוויראלית בטמפרטורה של 4 °C למשך 12 שעות לפחות.ביום התשעה, סבב את התערובת הויראלית בצנטריפוגה ב-2500 ×g למשך 45 דקות. לאחר 45 דקות, השלך את הנוזל העליון (supernatant) וסבב שוב למשך שתי דקות, ולאחר מכן הסר שוב את הנוזל העליון. לאחר מכן, השהה מחדש את המשקע (pellet) על ידי הוספת 320 µL של PBS סטרילי והדגר במנער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. למחרת, חלק את הווירוס לאליקווטות והקפא אותן בטמפרטורה של 80°C-.כדי להתחיל בהליך זה, גלחו את ראשו של עכבר שהורדם כדי להכין את אתר ההזרקה. הזרים isoflurane 4% לתוך קונוס האף. לאחר מכן, מקמו את העכבר במכשיר הסטריאוטקסי. הכניסו את מוט הנשיכה לתוך פיו עד ששיניו ינחתו בחריץ, לפני קיבוע מוטות האוזניים. ודאו שגופו של בעל החיים נמצא על פד החימום והאף ממוקם בתוך קונוס האף.לאחר מכן, ודאו את יעילות ההרדמה על ידי צביטה בכף הרגל. לאחר מכן, טפטפו דמעות מלאכותיות כדי לסבך את העיניים. בהמשך, נגבו את הראש הגולח באמצעות פובידון יוד ולידוקאין.כעת בצעו חתך קטן לאורך קו האמצע של קרקפת. ייבשו את הגולגולת באמצעות מקלון ומרחו מי חמצן כדי לסייע בהדמיית ה-bregma. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, אתרו את ה-bregma על הגולגולת והניחו את מקדח הקידוח מעליו.הגדירו את הקואורדינטות הסטריאוטקטיות הדיגיטליות של מישורי X, Y ו-Z לאפס. כדי להבטיח שהראש מפולס על ציר Y הרוסטרלי-קודאלי, הניחו את מקדח הקידוח על ה-lambda ופלסו את הראש כך שקואורדינטת Z תהיה שווה בקירוב לאפס הן ב-bregma והן ב-lambda. כדי להבטיח שהראש מפולס לאורך ציר X, הניחו את מקדח הקידוח בנקודת האמצע שבין ה-bregma ל-lambda ומדדו את קואורדינטות Z במרחק של מילימטר אחד מנקודת האמצע משני הצדדים כדי לוודא שהן שוות.כעת הנמיכו את ריכוז ה-isoflurane ל-2% לפני מיקום המקדח מעל הקואורדינטות הרצויות, וקדחו בזהירות דרך הגולגולת. לאחר קידוח כל החורים, הצמידו את המזרק הממולא בנגיף למכשיר הסטריאוטקטי. מרכזו את המזרק מעל החור והגדירו את קואורדינטת Z בגולגולת על אפס. הנמיכו לאט את המזרק לעומק Z המקסימלי והתחילו בהזרקה בקצב של 0.25 µL לדקה באמצעות מזריק סטריאוטקסי. לאחר השלמת ההזרקה בעומק Z המקסימלי, המתינו דקה לפני הרמת המזרק לקואורדינטה הבאה והתחילו בהזרקה שוב. המשיכו בתבנית זו עד להזרקה בכל קואורדינטות Z המיועדות להזרקה.לאחר ההזרקה האחרונה, המתינו שתי דקות לפני הסרת המזרק. לאחר מכן, הוציאו את העכבר מהמכשיר הסטריאוטקטי ותפרו את הקרקפת. מרחו לידוקאין וקרם אנטי-בקטריאלי על אזור הניתוח ותנו תרופה לשיכוך כאבים לפני העברת בעל החיים לתא התאוששות מחומם.תמונה זו במיגדיחור פלואורסצנטי בשדה רחב (10X) הדגימה כי רטרו-וירוסים בתר במינון גבוה מדביקים מספר רב של תאים, שניתן להעריך את המורפולוגיה שלהם באמצעות ביטוי של פלואורופור. בדוגמה זו, וירוסים המבטאים GFP או mCherry הוזרקו יחד לתוך ה-dentate gyrus. באמצעות מערכת של רטרו-וירוסים, ניתן להשתמש בווירוס אחד כדי לבצע מניפולציה גנטית אחת המסומנת על ידי GFP ובמניפולציה אחרת המסומנת על ידי m-Cherry, ולאחר מכן להעריך את השינויים הבודדים או המצטברים הנובעים מכל וירוס.זוהי שחזור תלת-ממדי של היקף ההזרקה, שבו שורטטו קווי מתאר סגורים של התפשטות הווירוס על פני 21 חתכים סדרתיים. קווי המתאר שורטטו ולאחר מכן כווננו כדי להפיק תמונות תלת-ממדיות לצורך כימות הנפח. ההתפשטות הווירוסית הכוללת מוצגת בירוק וההתפשטות הממוקמת ב-dentate מוצגת בסגול. תמונה זו מראה את הווירוס מתפשט לאורך נתיב המחט וה-corpus callosum, בנוסף למילוי הציר הרוסטראלי-קודאלי של ה-dentate gyrus.בעקבות ההזרקה הוויראלית in vivo, אנו משתמשים בשיטות אחרות כגון היסטולוגיה, אלקטרופיזיולוגיה או מיקרוסקופיה של תאים חיים כדי לחקור את השפעת המניפולציה הגנטית על ההתפתחות הנוירונלית.

designing-packaging-delivery-high-titer-crispr-retro-lentiviruses-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בקרה וניתוח של מעגלים...

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

מקור: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Newborn Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של וקטור ויראלי המקודד Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לתוך הסטריאטום של גור עכבר מהונדס גנטית כדי להשיג מניפולציה גנטית על ידי כריתת קלטת STOP עם אגף loxP, הפעלת חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP כמדווח.

מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית בסטריאטום גור עכבר

מקור: Pereira, M. et al., In vivo Direct Reprogramming של תאי גליה תושבים לאינטרנוירונים על ידי הזרקה תוך מוחית של וקטורים ויראליים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הזרקה סטריאוטקסית של נגיף הקשור לאדנו לקליפת המוח של עכבר טרנסגני כדי להעביר תכנות מחדש של עצבים תלויי Cre וגנים מדווחים פלואורסצנטיים לתאי גליה.

הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים ויראליים לתכנות מחדש של תאי גליה במודל עכבר

מקור: Fricano-Kugler, C. J., et al. תכנון, אריזה ואספקה של CRISPR רטרו ולנטי-וירוסים עם טיטר גבוה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה מדויקת של גנים עצביים במוח העכבר. הפרוטוקול מבטיח העברת וירוסים מדויקת לבליטה המשוננת, ומאפשר תיוג פלואורסצנטי ונוקאאוט גנים בתיווך CRISPR לחקור מעגלים עצביים, תפקוד גנים ומנגנוני מחלה in vivo.

הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה גנטית עצבית ממוקדת במוח העכבר

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך...

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

הזרקת stereotactic של lentiviruses להביע cDNAs או shRNAs יכול לווסת ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח של עכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשלב זריקות stereotactic עם משימות התנהגותיות, כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST).

יישום טכניקת הזרקת stereotactic לחקר השפעות גנטיות על התנהגות בעלי החיים

אטקסיות של פוליגלוטמין ספינוצרבלריות נגרמות על ידי התפשטות CAG המייצרת חלבונים המועדים להצטברות. פרוטוקול זה מתאר ייצור וקטורים, מסירה סטריאוטקסית וניתוח הכללות ואובדן סמנים נוירונים, ומספק פלטפורמה מבוקרת לחקר מנגנונים ולהערכת טיפולים ממוקדים למחלות ניווניות עצביות.

פתולוגיה סטריאטלית שנגרמה על ידי לנטריאלי כמודל פרה-קליני של אטקסיות תפינוצרבלריות פוליגלוטמין

למד לתכנן ולארוז וירוסי רטרו ולנטי CRISPR בעלי כייל גבוה להזרקה סטריאוטקטית למוח העכבר. שיטה זו מאפשרת חקר תפקידי גנים בהפרעות נוירולוגיות ללא צורך ביצורים מהונדסים גנטית.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

גלה סרטונים נוספים