Name: ניתוח In vivo נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: חקור נדידת תאים in vivo באמצעות השתלות תאים והדמיה בזמן אמת בעוברי דג זברה Danio rerio. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפקוד גנים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-F. Bouallague ולמתקן בעלי החיים IBENS על הטיפול המעולה בדגי הזברה. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, מענקים N° SFI20111203770 ו-N° PJA 20131200143.

<ol><li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+A+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model.</a> Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Dang, I., Gorelik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signalling+to+the+Arp2%2F3+complex+steers+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Dumortier, J. G., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TORC2+Component%2C+Sin1%2C+Controls+Migration+of+Anterior+Mesendoderm+during+Zebrafish+Gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation.</a> Plos One. 10, e0118474(2015).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+things%3A+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li>
<li>Ulrich, F., Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slb%2FWnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li>
<li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).</li>
<li>Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling+patterns+the+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling patterns the organizer.</a> Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , (2000).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li>
<li>Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellTrack%3A+An+open-source+software+for+cell+tracking+and+motility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis.</a> Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).</li>
<li>Tahinci, E., Symes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functions+of+Rho+and+Rac+are+required+for+convergent+extension+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation.</a> Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).</li>
<li>Zhang, T., Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3-Efemp2a+modulates+the+fibrillar+matrix+for+cohesive+movement+of+prechordal+plate+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors.</a> Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).</li>
<li>Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein%3A+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li>
<li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מציג דרך קלה ללמוד את התפקיד של גן מועמד נדידת תאי in vivo, על ידי שילוב של היצירה עוברת chimeric באמצעות השתלה תאית עם הדמיה לחיות. יצירה עוברת פסיפס לימוד הדינמיקה של תא דורש הדמיה של קווי המתאר שלה לנתח סיומות cytoplasmic. זו יכולה להיות מושגת על ידי תיוג תאים מבודדים בתוך תווית אחרת - שכותרתו או אחר - סביבה, ובכך להציע ב...

בשנת יצורים רב-תאיים, נדידת תאים היא חיונית הן לפיתוח העובר שבו היא מבטיחה הארגון של תאים לתוך רקמות ואיברים, ובמשך חייו הבוגרים, בו היא לוקחת חלק הומאוסטזיס רקמות (ריפוי פצעים) וחסינות. בנוסף לפונקציות פיזיולוגיות אלה, נדידת תאים הוא מעורב גם במצבים פתולוגיים מגוונים, כולל, ובמיוחד, גרורות סרטניות. נדידת תאים כבר נתחה במבחנה במשך עשרות שנים, מתן הבנה כוללת של המנגנונים המולקולריים הבטיחו תנועות תא על משטחים שטוחים. בשנת vivo עם זאת, תאים עומדים בפני סביבה מורכבת יותר. זה בבירור הופיע בשנים האחרונות כי הגירה בתוך אורגניזם עשויה להיות מושפעת רמזים חיצוניים כגון תאי מטריקס, תאי שכנים או כמוקינים מופרשים מנחת הגירה, וכי מנגנוני נהיגת נדידת תאים עשויים להשתנות ממה תוארה &lt;em&gt; במבחנה 1,2. המנגנונים הבטיחו נדידת תאי vivo קבלו פחות תשומת לב עד כה, בעיקר בשל הקושי הטכני גדל, לעומת במבחנה. בשנת vivo ניתוח נדידת תאים בפרט דורש גישה אופטית ישירה תאים נודדים, טכניקות לתייג תאים ייחודיים כדי לראות דינמיקה המורפולוגיה שלהם, כמו גם רווח או הפסד של הפונקציה מתקרב לבחון את התפקיד של גנים מועמדים. עד כה, רק כמה מערכות מודל מחסה מאפיינים אלה שימשו לנתח בתא vivo הגירה 3. אנחנו לאחרונה השתמשנו ההגירה של צלחת prechordal הפוטנציאלית עוברות דג זברה מוקדם כמערכת מודל הנוח חדשה להעריך את הפונקציה של גני מועמדים בשליטת נדידת תאי vivo 4,5. צלחת prechordal פרוספקטיבי (הידוע גם בשם mesendoderm הקדמי) היא קבוצה של תאים ויוצרים בתחילת Gastrulation בצד הגבי של העובר. במהלך gastrulation בקבוצה זו נודד קולקטיבי כלפי קוטב החיה של העובר 6-8, כדי ליצור את צלחת prechordal, עיבוי mesendodermal, קדמית notochord: ומתחת הצלחת העצבית. החלק הקדמי של צלחת prechordal יהיה להצמיח בלוטת הבקיעה, בעוד החלק האחורי שלה תורם סביר לעמוד בראש mesoderm 9. הודות לפיתוח החיצוני בהירות אופטית של עובר הדג, נדידת תאים ניתן ישירות ובקלות שנצפתה המבנה הזה. השתלת תאים היא טכניקה חזקה מאוד המאפשרת יצירה המהירה וקלה של עוברת פסיפס 10. הבעת סמני cytoskeletal פלורסנט בתוצאות תאים המושתלים בתוך התיוג של תאים בודדים, המורפולוגיה והדינמיקה של אשר ניתן להבחין בקלות. שילוב זה רווח או הפסד של הפונקציה מתקרב היתרי ניתוח של פונקציות אוטונומיות התא של פחיתגן didate. הפרוטוקול המובא מתאר כיצד אנו הערכנו את הפונקציה של Sin1 רכיב TORC2 בשליטת דינמיקת גירה תקטין תא in vivo 5. אבל, כאמור בתוצאות ודנו עוד יותר, זה יכול לשמש כדי לנתח את המשמעות הפוטנציאל של כל גן מועמד בשליטת נדידת תאי in vivo.

<table><tbody><tr><td>נימי זכוכית (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.58&nbsp; מ"מ)</td> <td>מכשירי הרווארד</td><td>300085</td><td>נימי זכוכית בעובי סטנדרטי</td></tr><tr><td>(קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.78 מ"מ)</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>300085</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td> דק דופן <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4333</td><td>10&nbsp; 000&nbsp; יחידות פניצילין ו-10&nbsp; מ"ג סטרפטומיצין למ"ל</td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>5F כלי תחתית זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>משדר אוויר</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (להזרקה)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור (להשתלת תאים)</td><td>Leica</td><td>Leica מיקרומניפולטור</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Hammilton</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>דיוויד קופף מכשירים</td><td>דגם 720</td><td></td></tr><tr><td>תבנית השתלה</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק</td> <td>מחטמחבר צינור Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr> צינורות <tr><td></td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE צינורות</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח<em&gt; in vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

נדידת תאים היא המפתח למצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כולל גרורות סרטניות. הבסיסים התאיים והמולקולריים של נדידת התאים נותחו ביסודיות במבחנה. עם זאת, נדידת תאים in vivo שונה איכשהו מנדידת מבחנה, והוכחה כקשה יותר לניתוח, בהיותה פחות נגישה לתצפית ישירה ומניפולציה. פרוטוקול זה משתמש בנדידת הצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית בעובר דג הזברה המוקדם כמערכת מודל לחקר תפקודם של גנים מועמדים בנדידת תאים. אבות הלוח הקדם-כורדלי יוצרים קבוצת תאים אשר, במהלך הקיבה עוברת הגירה מכוונת מהמארגן העוברי לקוטב החיה של העובר. הפרוטוקול המוצע משתמש בהשתלת תאים ליצירת עוברי פסיפס. זה מציע את היתרונות המשולבים של תיוג תאים מבודדים, שהוא המפתח להדמיה טובה, ושל הגבלת השפעות הרווח/אובדן התפקוד לתאים הנצפים, ובכך להבטיח השפעות אוטונומיות של התאים. אנו מתארים כאן כיצד הערכנו את תפקודו של רכיב TORC2 Sin1 בנדידת תאים, אך ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לנתח את תפקודו של כל גן מועמד בשליטה על נדידת תאים in vivo.

הטכניקה הציגה שמשה לנתח את התפקיד של Sin1, אחד מרכיבי הליבה של הטור 2 המורכב (TORC2), בשליטת נדידת תאי vivo. שימוש השתלת תאים מתיר תיוג של תאים מבודדים וניתוח של תופעות תאים אוטונומיים. סרט S1 מציג את ההגירה של ובתאים צלחת prechordal המושתלים. תיוג יקטין עם ABP140 מאפשר הדמיה הקלה של בליטות ציטופלסמית עשיר תקטנה. מדדנו תדירות והכיוון שלהם. Wild-type תאים לייצר בליטות ציטופלסמית גדולים תכופים אוריינטציה בכיוון של הקוטב בעלי חיים, <...

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנתח את התפקוד של גן מועמד בבקרה על נדידת תאים in vivo באמצעות השתלת תאים בשילוב עם דימוי חי (live imaging) בעובר דג הזברה (Zebrafish). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום נדידת התאים, כגון קביעת התפקיד והחשיבות של גנים מועמדים חדשים בנדידת תאים in vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת עוברים פסיפסאיים (mosaic embryos), דבר המאפשר דימוי טוב וניתוח של אדנומיוזיס תאי.להכנת מחטים להשתלת תאים, השתמש במכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות (micro pipette puller) כדי למשוך קפילרה מזכוכית. לאחר מכן, בעזרת מיקרו-פורג' (microforge), חתוך את קצה המחט בנקודה שבה הקוטר הפנימי הוא 35 micrometers. השתמש במיקרו-גריינדר (microgrinder) כדי ליצור שיפוע (bevel) בקצה החתוך של הקפילרה בזווית של 45 מעלות.כדי להסיר שאריות זכוכית, הכניסו את המחט למחזיק מחטים המותקן על מזרק, ולאחר מכן השתמשו ב-2% hydrofluoric acid כדי לשטוף את פנים המחט שלוש פעמים על ידי שאיבה והוצאה של התמיסה. לאחר מכן, שטפו את המחט עם acetone שלוש פעמים. כדי להכין צלחות להזרקה או להשתלת תאים, הכינו 1% agarose על ידי חימום של 50 milliliters של תווך עוברים המכיל 0.5 grams של agarose במיקרוגל למשך דקה אחת בעוצמה מלאה.קררו את ג'ל האגרוז לטמפרטורה של כ-60 °C ושפכו את כל הנפח לתוך צלחת פטרי של 90 מילימטר. הכניסו תבנית כדי ליצור קווים להזרקה או כדי ליצור בארות להשתלת תאים. כאשר ג'ל האגרוז מתמצק, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את התבנית.להזרקה לעוברים תורמים, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו בפינצטה כדי להעביר בעדינות את העוברים הטרנסגניים שנאספו לשורות של צלחת הזרקה מלאה בתווך עוברים. בעזרת פינצטה כוונו את העוברים כך שהתאים יפנו כלפי מעלה, ולאחר מכן דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 28 °C עד שהעוברים יגיעו לשלב ארבעת התאים. לאחר מכן, מלאו מחט הזרקה ב-2 µL של תמיסת הזרקה שהוכנה מראש, המכילה את הדומיין הקושר-אקטין של חלבון actin-binding protein 140 משמרים הקשור ל-mcherry.לאחר מכן, הכניסו את המחט למחזיק מחטים המחובר למיקרו-מניפולטור ולמזרק אוויר (air transjector). פתחו את המחט באמצעות פינצטה עדינה על ידי נגיעה עדינה בקצה המחט או על ידי לחיצה על קצ에요. לאחר מכן, הכניסו את המחט לאחד מארבעת התאים והזריקו את התמיסה עד למילוי של 70% מנפח התא.הזריקו 30 עוברים באופן דומה. כאשר העוברים הגיעו לשלב הספירה (sphere stage), השתמשו בפיפט פלסטיק רחב (pasture pipette) כדי להעביר עוברים טרנסגנים של host goosecoid GFP ועוברים תורמים שהוזרקו קודם לכן לצלוחיות פטרי נפרדות בקוטר 35 מילימטר, המצופות בשכבת agarose בעובי מילימטר אחד בתוך תווך עוברים ומלאות בתווך עוברים עם Pen/Strep. הוציאו ידנית את העוברים מהכוריון באמצעות פינצטה עדינה.לאחר מכן, העבירו את העוברים לאינקובטור בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. כאשר העוברים הגיעו לשלב המגן (shield stage), בחרו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עוברים תורמים המבטאים ABP140 mcherry בתוך המגן הירוק. באמצעות פיפטת פסטור מלוטשת באש, העבירו את עוברי המארח לשורה של בארות בצלחת להשתלת תאים הממולאה ב-Pen/Strep EM. לאחר מכן, מקמו את העוברים התורמים בשורה הסמוכה.בשלב הבא, השתמשו בריס של עין כדי לכוון בזהירות את העוברים כך שהמגן (shield) יהיה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, באמצעות מחזיק מחטים המחובר למזרק, שטפו את קצה המחט על ידי שאיבה והזרקה של 70% ethanol. ייבשו את המחט על ידי שאיבת אוויר לתוכה.כאשר המחט יבשה, הכניסו אותה למחזיק המחט המחובר למזרק Hamilton, כאשר השיפוע פונה כלפי מעלה. כדי לבצע השתלה ממגן למגן, חדרו למגן של עובר תורם באמצעות מחט ההשתלה ושאבו כ-10 עד 20 תאים המסומנים ב-ABP140 mcherry. הימנעו בזהירות משאיבת חלמון.העבירו את התאים למגן של עובר המאכס וחזרו על העברת התאים עד שכל עוברי המאכס יעברו השתלה. עם סיום ההשתלה, השתמשו בפיפטת פסטור שעברה ליטוש באש כדי להסיר עוברים פגומים. דגרו את העוברים המשתלים בטמפרטורה של 28 °C למשך כ-30 דקות כדי לאפשר להם להתאושש.כדי להשתיל תאי אב בודדים של הלוח הפרה-כורדלי (prechordal plate) לאחר הסרת הדפריון מהעוברים כפי שהודגם קודם לכן, השתמשו בפיפטת פסטור מלוטשת באש כדי להעביר שלושה עוברים תורמים לכלי השתלת תאים המלא ב-Pen/Strep calcium free ringers. בעזרת פינצטה עדינה, בצעו עבור כל עובר דיסקציה של רקמה (explant) המכילה את התאים המוזרקים המסומנים ב-ABP140 mcherry, והשליכו במהירות את שאר חלקי העוברים. בעזרת ריסון, ערבבו בעדינות את הרקמות עד להתפרק התאים.לאחר מכן, שאבו תא בודד ומבודד לתוך מחט ההשתלה והשתילו אותו במגן של עובר מאכסן, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון. לשליטה מיטבית בשאיבה ובהשתלה, שמרו על הפרדת האוויר/מים במרחק של כ-20 סנטימטרים מקצה המחט. כדי לקבע את העוברים, מלאו מבחנה בעלת תחתית זכוכית ב-1 מילימטר של agarose 0.2% חם ב-EM. הניחו את המבחנה בבלוק חימום בטמפרטורה של 42 degrees Celsius.העבירו עובר נבחר לתוך תמיסת האגרוז והסילו את עודפי מדיום העוברים מהפיפטה. לאחר מכן, שאבו את העובר לתוך הפיפטה יחד עם האגרוז והעבירו אותו לתא הדמיה שהוכן מראש, בתוספת טיפה של אגרוז. לפני שהאגרוז מתקשה, השתמשו בריס של עין כדי לכוון את העובר על ידי הנחת ה-prechordal plate הפרוספקטיבי כלפי מעלה לצורך הדמיה במיקרוסקופ אנכי, או על קרקעית הזכוכית לצורך הדמיה במיקרוסקופ הפוך.יהיו כ-40 שניות להכוונת העובר לפני שהג'ל אגרוז יתקשה, תלוי בטמפרטורת החדר. הכוו את העובר במהירות על ידי מניפולציה של הבלסטודרם ולא של החלמון, ששביר מאוד. לאחר שכל העוברים מקובעים והאגרוז התקשח, השתמש ב-Pen/Strep EM כדי למלא את התא ולמנוע מהעוברים להתייבש.בצעו דימוי תאים חיים וניסויי דינמיקה תאית בהתאם לפרוטוקול הכתוב. הטכניקה המודגמת בסרטון זה שימשה לניתוח התפקיד של Sin1, אחד מרכיבי הליבה של קומפלקס TOR 2, בבקרת נדידת תאים in vivo. סרטון זה מציג את נדידתם של תאי אב של הלוח הפרה-כורדלי (prechordal plate) שהושתלו.סימון של אקטין מאפשר ויזואליזציה של בליטות ציטופלזמיות עשירות באקטין. באמצעות ניתוח של התדירות והכיוון, נצפה כי תאי פרא (wild type) מייצרים לעיתים קרובות בליטות ציטופלזמיות גדולות, המכוונות לכיוון הקוטב האנימלי וכיוון הנדידה. כפי שניתן לראות בדמות זו, אובדן תפקוד של Sin1 מוביל להפחתה דרסטית במספר הבליטות ולפיזור אקראי של הבליטות שנותרו, מה שמעיד על חשיבותו של Sin1 בבקרת היווצרותן של בליטות עשירות באקטין.מעניין לציין כי ניתן להציל את הפנוטיפ של Sin1 על ידי ביטוי של צורה פעילה באופן קבוע של Rac1, מה שמרמז בעוצמה ש-TOR C2 שולט בדינמיקה של אקטין וביצירת בליטות תאיות באמצעות Rac1. טכניקה זו שימשה גם לניתוח התפקיד של arpin, מעכב של קומפלקס ARP2/3, בנדידת תאים. כפי שמוצג כאן, אובדן תפקוד של arpin מוביל לעלייה בתדירות הבליטות, בין אם בשל יצירה תכופה יותר של בליטות, או בשל עלייה ביציבות הבליטות.מדידת אורך החיים של הבליטות בהיעדרו של arpin חשפה כי ההתמדה הזמנית של הבליטות הוכפלה, מה שמעיד על עלייה ביציבות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע השתלה של כ-30 עוברים בתוך 45 דקות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעקוב אחר התפתחות העוברים, שכן כל השלבים תלויים בתזמון קריטי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לספק דימוי טוב יותר ולענות על שאלות הנוגעות לארגון התת-תאי של רכיבים ציטוסקלטיים, סמני קוטביות, חלבוני היצמדות, או כל מרכיב תאי אחר. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בהשתלות של תאי אב של הלוח הפרה-כורדאלי (prechordal plate) כדי לנתח את תפקידו של כל גן מועמד בנדידה תאית in vivo.

analyzing-vivo-cell-migration-using-cell-transplantations-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

דג הזברה השתלת מאפשר שילוב של גנטיקה אמבריולוגיה ליצור מפלצות רקמות ספציפיות. וידאו זה מדגים gastrula מבוים השתלות תא אפשרו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקידים של אוכלוסיות astroglial ו רמזים הנחיות ספציפיות במהלך היווצרות השליכה בקידמתו.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

סרטון זה מתאר שיטת מיקרו-הזרקה להעברת תאי סרטן השד לחלל הפריביטלין של עוברי דגי זברה טרנסגניים. לאחר הדגירה, אנו מדמיינים את העובר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בפלישה של תאים סרטניים, הפצתם וגרורות.

zPDX-אנליזה של פולשניות: חקירת התנהגות פולשנית של תאי סרטן גרורתיים בעוברי זברה Xenografts

מקור: Williams, A. L., et al. הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים כדי להמחיש התפתחות בזמן אמת: הדמיה של תאי פסגה עצבית נודדים בעוברי דג זברה. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מציג פרוטוקול הדמיה מרובה פוטונים כדי לדמיין את הנדידה של תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה.

הדמיה של נדידת תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה באמצעות הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

כאן, אנו מתארים דגמים דג הזברה xenograft באמצעות שני אתרים הזרקה שונים, כלומר, חלל צינור perivitelline של קיביה, כדי לחקור את התנהגות פולשנית ולהעריך את הפוטנציאל intravasation ו extravasation של תאי סרטן שד אנושיים, בהתאמה.

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת קסנו בחלמון של עוברי דגי זברה שקופים המותאם בשיטת היערכות פשוטה ומהירה. ניתוחים לאחר הזרקה כוללים הישרדות והערכת נטל המחלה של תאים מושתלים על ידי ציטומטריית זרימה.

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

חקור נדידת תאים in vivo באמצעות השתלות תאים והדמיה בזמן אמת בעוברי דג זברה Danio rerio. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפקוד גנים בביולוגיה התפתחותית.

ניתוח

גלה סרטונים נוספים