ניתוח In vivo נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את תפקודו של גן מועמד בשליטה על נדידת תאים in vivo באמצעות השתלת תאים בשילוב הדמיה חיה בעובר דג הזברה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום נדידת התאים כגון קביעת התפקיד והחשיבות של גנים מועמדים חדשים בנדידת תאים in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת עוברי פסיפס המאפשרים הדמיה טובה ואדנומיוזיס תאי.

להכנת מחטי השתלת תאים השתמש במושך מיקרו פיפטה כדי למשוך קפילרי זכוכית. לאחר מכן, בעזרת מיקרו-זיוף, חותכים את קצה המחט בנקודה שבה הקוטר הפנימי הוא 35 מיקרומטר. בעזרת מיקרו-מטחנה משופע את הקצה החתוך של הנימים בזווית של 45 מעלות.

כדי לחסל שאריות זכוכית, הכנס את המחט למחזיק מחט המותקן על מזרק, ולאחר מכן השתמש בחומצה הידרופלואורית 2% כדי לשטוף את פנים המחט שלוש פעמים על ידי משיכת התמיסה פנימה והחוצה. לאחר מכן שטפו את המחט באצטון שלוש פעמים. להכנת כלים להזרקה או להשתלת תאים, הכינו 1% אגרוז על ידי חימום 50 מיליליטר של מדיום עוברי המכיל 0.5 גרם אגרוז במיקרוגל למשך דקה אחת בעוצמה מלאה.

מצננים את ג'ל האגרוז לכ- 60 מעלות צלזיוס ויוצקים את כל הנפח לצלחת פטרי של 90 מילימטר. הכנס תבנית ליצירת קווים להזרקה או ליצירת בארות להשתלת תאים. כאשר ג'ל האגרוז מוגדר, השתמש במלקחיים כדי להסיר את התבנית.

כדי להזריק עוברים תורמים, תחת סטריאומיקרוסקופ השתמשו במלקחיים כדי לסחוט בעדינות עוברים טרנסגניים שנאספו לתוך קווי צלחת הזרקה מלאה במדיום עוברי. בעזרת מלקחיים מכוונים את העוברים עם התאים כלפי מעלה, ואז דוגרים על הצלחת ב-28 מעלות צלזיוס עד שהעוברים מגיעים לשלב ארבעת התאים. לאחר מכן, טען מחט הזרקה עם שני מיקרוליטרים של תמיסת הזרקה שהוכנה בעבר המכילה את תחום קשירת האקטין של חלבון קושר האקטין השמרים 140 הקשור לדובדבן.

לאחר מכן הכנס את המחט למחזיק מחט המחובר למיקרומניפולטור ומחובר למעביר אוויר. פתח את המחט באמצעות מלקחיים עדינים כדי לגעת בעדינות בקצה המחט או על ידי צביטה בגפיה. לאחר מכן הכנס את המחט לאחד מארבעת התאים והזריק את התמיסה כדי למלא 70% מנפח התא.

להזריק 30 עוברים באופן דומה. כאשר העוברים הגיעו לשלב הכדור, השתמשו בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר עוברי GFP של אווז טרנסגני ועוברים תורמים שהוזרקו בעבר לצלחות פטרי נפרדות בגודל 35 מילימטר המצופות באגרוז מילימטר אחד בתווך עוברי וממולאות במדיום עוברי Pen/Strep. בעזרת פינצטה עדינה ניתן לחלץ ידנית את העוברים מהכוריון שלהם.

לאחר מכן הכניסו את העוברים לאינקובטור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. כאשר העוברים הגיעו לשלב המגן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחר עוברים תורמים המבטאים ABP140 mcherry בתוך המגן הירוק. באמצעות פיפטת מרעה מלוטשת אש, העבירו את העוברים המארחים לשורת בארות בצלחת השתלת התאים המלאה בעט/סטרפטוקוקוס EM. לאחר מכן הניחו את העוברים התורמים בשורה השכנה.

לאחר מכן, בעזרת ריסים, כוונו בזהירות את העוברים עם המגן כלפי מעלה. לאחר מכן, בעזרת מחזיק מחט המחובר למזרק, שטפו את קצה המחט על ידי משיכה פנימה והוצאת 70% אתנול. יבש את המחט על ידי שאיבת אוויר לתוכה.

כאשר המחט יבשה, הכנס אותה למחזיק המחט המחובר למזרק המילטון כשהשיפוע פונה כלפי מעלה. כדי לבצע השתלת מגן למגן, הזן את המגן של עובר תורם עם מחט ההשתלה ושרטט כ-10 עד 20 תאים המסומנים ב-ABP140 mcherry. הימנע בזהירות מציור חלמון.

השתל את התאים במגן של העובר המארח וחזור על העברת התאים עד להשתלת כל העוברים המארחים. לאחר השלמת ההשתלה, השתמש בפיפטה מרעה מלוטשת אש כדי להסיר עוברים פגומים. דגרו על העוברים המושתלים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות כדי לאפשר להם להתאושש.

כדי להשתיל תאי אב של צלחת קדם-כורדלית בודדת לאחר דה-כוריוניזציה של עוברים, כפי שהודגם קודם לכן, השתמש בפיפטה מרעה מלוטשת אש כדי להעביר שלושה עוברים תורמים לתוך צלחת השתלת תאים מלאה בצלצולים נטולי סידן עט/סטרפטוק. בעזרת פינצטה עדינה לכל עובר מנתחים צמח המכיל את התאים המסומנים ABP140 mcherry שהוזרקו והשליכו במהירות את שאר העוברים. בעזרת ריסים מערבבים בעדינות את האקספלנטים עד שהתאים מתנתקים.

לאחר מכן צייר תא בודד ומבודד במחט ההשתלה והשתיל אותו במגן של עובר מארח כפי שהודגם מוקדם יותר בסרטון. לשליטה אופטימלית בשאיפה ובהשתלה יש לשמור על הפרדת האוויר/מים במרחק של כ-20 ס"מ מקצה המחט. כדי להרכיב את העוברים יש למלא בקבוקון תחתון זכוכית במילימטר אחד של 0.2% אגרוז חם ב- EM. הניחו את הבקבוקון בחום של 42 מעלות צלזיוס בגוש חום.

העבירו עובר נבחר לתמיסת האגרוז והשליכו את מדיום העובר העודף מהפיפטה. לאחר מכן משוך את העובר לתוך הפיפטה עם אגרוז והעביר אותו לתא הדמיה שהוכן בעבר יחד עם טיפת אגרוז. לפני הגדרת האגרוז השתמש בריסים כדי לכוון את העובר על ידי הנחת לוחית הפרספקטיבה כלפי מעלה להדמיה במיקרוסקופ זקוף, או על תחתית הזכוכית להדמיה במיקרוסקופ הפוך.

יהיו כ-40 שניות לכוון את העובר לפני שג'ל האגרוז מתייצב בהתאם לטמפרטורת החדר. כוון את העובר במהירות על ידי מניפולציה של הבלסטודרם במקום החלמון שהוא שביר מאוד. לאחר שכל העוברים מורכבים והאגרוז מוגדר, השתמש בעט/סטרפטוקוקוס EM כדי למלא את החדר כדי למנוע מהעוברים להתייבש.

בצע הדמיה של תאים חיים והתנסויות בדינמיקת תאים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. הטכניקה המודגמת בסרטון זה שימשה לניתוח תפקידו של Sin1, אחד ממרכיבי הליבה של קומפלקס TOR 2 בשליטה על נדידת תאים in vivo. סרט זה מציג את הנדידה של תאי קדם-כורד מושתלים.

תיוג אקטין מאפשר הדמיה של בליטות ציטופלזמיות עשירות באקטין. באמצעות ניתוח תדירות וכיוון נצפה כי תאים מסוג בר מייצרים לעתים קרובות בליטות ציטופלזמיות גדולות, המכוונות לכיוון קוטב החיה, ושל נדידה. כפי שניתן לראות באיור זה, אובדן התפקוד של Sin1 מוביל להפחתה דרסטית במספר הבליטות ולאקראיות של הבליטות הנותרות, מה שמדגים את החשיבות של Sin1 בשליטה על היווצרות בליטות עשירות באקטין.

מעניין שניתן להציל את הפנוטיפ Sin1 על ידי ביטוי של צורה פעילה מבחינה קונסטיטוציונלית של Rac1, מה שמרמז על כך ש-TOR C2 שולט בדינמיקת אקטין ובהיווצרות בליטת תאים באמצעות Rac1. טכניקה זו שימשה גם לניתוח תפקידו של arpin, מעכב של קומפלקס ARP2/3 בנדידת תאים. כפי שמוצג כאן, אובדן תפקוד של ארפין מוביל לעלייה בתדירות הבליטה, עקב היווצרות בליטה תכופה יותר, או עלייה ביציבות הבליטה.

מדידת אורך חיי הבליטה בהיעדר ארפין גילתה כי ההתמדה הזמנית של הבליטות הוכפלה ומצביעה על עלייה ביציבות. לאחר השליטה ניתן לבצע השתלה של כ -30 עוברים תוך 45 דקות. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לפקוח עין על התפתחות העוברים מכיוון שכל השלבים מתוזמנים באופן קריטי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה כדי לספק הדמיה טובה יותר ולענות על שאלות הנוגעות לארגון תת-התאים של אלמנטים ציטוסקוטיים, סמני קוטביות, חלבוני תוספת או כל מרכיב תא אחר. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהשתלות של אבות צלחת קדם-כורדים כדי לנתח את תפקידו של כל גן מועמד בנדידת תאים in vivo.