בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי Plasmodium Sporozoites

המטרה הכוללת של מערך נהלים זה היא לחסן עכברים עם טפילי פלסמודיום מוחלשים בקרינה. כדי להקל על ניתוח גיוס תאים מיאלואידים בעור העכבר וניקוז בלוטות הלימפה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המלריה, כגון מהם השחקנים התאיים המעורבים בתגובה החיסונית המולדת לטפילים חיים מוחלשים.

בין 18-25 יום לאחר הזיהום ארוחת דם, איסוף והרדמה קרה של יתושים נגועים בצינור של 15 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, הפוך בזהירות את הצינור לצלחת פטרי על קרח וחשוף את החרקים למינון של 12 קילו-ראד של קרינת גמא או רנטגן. אסוף את בלוטות הרוק של יתושים מוקרנות ב-15 מיקרוליטר DPBS על קרח.

ואז, מועכים בעדינות את הבלוטות כדי לשחרר את הספורוזואיטים. הזרקת תרחיף טפיל מרוכז מאוד בנפח קטן היא קריטית, ולכן חשוב לקצור מספר מספיק של בלוטות רוק מיתושים נגועים היטב כפי שמעיד ביטוי חזק של פלואורסצנטיות ירוקה. השעו מחדש את תרחיף הטפיל לפני הסינון דרך מסננת של 35 מיקרומטר המותאמת לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

בעזרת תא ספירת מיקרוסקופ, ספרו את המספר הכולל של ספורוזואיטים מבודדים והתאימו את תרחיף הטפיל ל-8.3 כפול עשר לרביעי ספורוזואיטים לריכוז מיקרוליטר ב-DPBS קר על קרח. לפני הזרקת הספורוזואיטים, יש לאשר את רמת ההרגעה הנכונה של חיית הניסוי על ידי צביטה בבוהן ולמרוח משחת עיניים למניעת ייבוש הקרנית. לאחר מכן, בעבודה מהירה, השתמש בסרט שקוף כדי לקבע בעדינות את הצד הגחוני של אפרכסת האוזן מתחת למיקרוסקופ סטריאו וטען מזרק של עשרה מיקרוליטר, המצויד במחט בגודל 35, עם 0.6 מיקרוליטר של טפילים תלויים.

לאחר מכן, הכנס בזהירות את המחט, כשהצד המשופע כלפי מעלה, מתחת לאפידרמיס בצד הגבי של האוזן והזריק 0.15 מיקרוליטר של ספורוזואיטים לאתר. פפולה אופיינית תיצפה באתר ההזרקה. לאחר הזרקת הדרמיס שלוש פעמים נוספות, כפי שהודגם זה עתה, הסר בזהירות את הסרט ועקוב אחר העכבר עד להחלמתו המלאה.

בנקודת הזמן הרצויה לאחר חיסון ספורוזואיט, הקריבו את העכבר והתחילו את ההליך מיד. ודא שהעכבר מפגין סימני מוות קליני. יש לחטא את האוזן ואת אזור הצוואר המתאים עם 70 אחוז אתנול.

לאחר מכן, בעזרת מספריים ומלקחיים סטריליים, בצע חתך באזור הצוואר היוגולו-קרוטידי. לאחר מכן מתחו את החתך בשני מלקחיים כדי לחשוף את בלוטת הלימפה המנקזת במראה אפור. צבט בזהירות והסר את רקמת החיבור ישירות מעל בלוטת הלימפה וחלץ אותה בעזרת זוג מלקחיים שני, המונח מתחתיה.

העבירו את בלוטת הלימפה למסננת של 70 מיקרון בבאר אחת של צלחת תרבית רקמה בת שש בארות, המכילה 4.5 מיליליטר של מדיום סטנדרטי, בתוספת קולגנאז ו-DNase. לאחר מכן, קצרו את כל האוזן המחוסנת והשתמשו בשני מלקחיים כדי לצבוט ולהפריד את האוזן להיבטים הגביים והגחוניים. לאחר מכן הניחו כל צד של האוזן לבאר של צלחת שנייה בת שש בארות, המכילה 4.5 מיליליטר לבאר מדיום בתוספת אנזימי עיכול, תוך הקפדה שכל רקמה תהיה שקועה לחלוטין במדיום.

כדי לבודד את תאי החיסון מבלוטות הלימפה, דגרו את צלחת רקמת הלימפה ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים CO2 תחת תסיסה עדינה. לאחר 15 דקות מוסיפים עשרה מילי-מולרי EDTA לכל באר ומניחים את הצלחת על קרח. לאחר מכן, עבור כל בלוטת לימפה, השתמש בקצה של בוכנת מזרק חדשה של חמישה מילימטר ולחץ את בלוטת הלימפה על המסננת בתנועות סיבוביות כדי לנתק את הרקמה.

כאשר נותרה רק רקמת חיבור לבנה, שטפו את המסננת פעמיים עם 500 מיקרוליטר DPBS המכילים FBS ו-EDTA והעבירו את הכביסה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את הבאר פעמיים נוספות עם 500 מיקרוליטר מה-DPBS המשלים והעבירו את הכביסה לצינור המונח על קרח. כדי לבודד את תאי החיסון מהאוזן, דגרו את עלוני האוזן ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2 בערבול עדין.

לאחר 20 דקות, חותכים את הרקמות לחתיכות קטנות יותר כדי להקל על העיכול שלהן ולהחזיר את הדגימות לחממה. לאחר 40 דקות, עצרו את העיכול עם EDTA של עשרה מילימולרית והניחו את הצלחת על קרח. בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד עם קצה חתוך, העבירו את כל תכולת כל באר לבארות חדשות המכילות מסננות של 70 מיקרון.

והשתמש בבוכנת מזרק של חמישה מיליליטר כדי לנתק את שברי רקמת האוזן בתנועות מעגליות כפי שהודגם זה עתה. כאשר נותרו רק רקמת חיבור ושיער לבנים, שטפו את המסננות והבארות עם DPBS בתוספת FBS ו-EDTA כפי שהודגם זה עתה, ואספו את השטיפות לצינור של 50 מיליליטר על קרח. לבסוף, שטפו את הבאר פעמיים עם DPBS בתוספת והעבירו את הכביסה לצינור המונח על קרח.

בסרטון זה ניתן לראות את נדידת הספורוזואיטים המוחלשים בקרינה לעור העכבר 15 דקות לאחר הזרקה תוך עורית של הטפילים. 24 שעות לאחר הזרקת ספורוזואיט תוך עורית, סך התאים מבודדים מהעור ומנקזים את בלוטת הלימפה. כפי שנצפה באיור זה, תדירות התאים המיאלואידים בעור ובבלוטות הלימפה המנקזות מוגברת מאוד בהשוואה לעכברים נאיביים.

לאחר השליטה, ניתן להשלים את השלבים הראשונים של הפרוטוקול להקרנת יתושים להזרקת ספורוזואיט תוך ארבע שעות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שספורוזואיט המבודד מבלוטות הרוק של יתושים מאבד במהירות את ההדבקה שלו. לכן יש להזריק אותם במהירות האפשרית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאים מיאלואידים מעור העכבר ומנקז בלוטות הלימפה כדי לחקור את התגובה החיסונית להזרקה תוך עורית של טפילי פלסמודיום חיים מוחלשים.