Name: שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: למדו שיטה לגידול נוירונים היפוקמפליים ראשוניים בעכברים בצפיפות אולטרה-נמוכה ללא שכבת תומכת גליאלית. טכניקה זו מאפשרת חקר מנגנונים תא-אוטונומיים בנוירונים לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH/NIMH ל-S.Q. (R00MH087628).

<ol><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Cultureing+Nerve+Cells%22">Cultureing Nerve Cells</a>. , 2nd edition, 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+microtubule-based+transport+of+dendritic+membrane+proteins+arises+in+concert+with+axon+specification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification.</a> J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Shi, Y., Ethell, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+control+dendritic+spine+plasticity+in+hippocampal+neurons+through+NMDA+receptor+and+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II-mediated+actin+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization.</a> J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures%3A+a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8, e83899(2013).</li>
<li>Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-dependent+protein+kinase+mediates+activity-regulated+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors.</a> J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).</li>
<li>Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+induces+synaptic+delivery+of+hnRNP+A2%2FB1+by+a+BDNF-dependent+mechanism+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons.</a> PLoS One. 9, e108175(2014).</li>
<li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).</li>
<li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+rat+hippocampal+neurons+at+low+density+in+serum-free+medium%3A+combination+of+the+sandwich+culture+technique+with+the+three-dimensional+nanofibrous+hydrogel+PuraMatrix%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS One. 9, e102703(2014).</li>
<li>Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+peptidomics+of+supraoptic+magnocellular+and+hippocampal+neurons+in+low-density+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures.</a> ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).</li>
<li>Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+dendrite+development+in+hippocampal+neurons+by+binding+to+p75NTR+and+modulating+the+cellular+targets+of+Notch%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch.</a> Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).</li>
<li>Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+culturing+primary+fetal+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 803930(2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Qiu, S., Weeber, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+signaling+facilitates+maturation+of+CA1+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses.</a> J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).</li>
<li>Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET+receptor+tyrosine+kinase+controls+dendritic+complexity%2C+spine+morphogenesis%2C+and+glutamatergic+synapse+maturation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus.</a> J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבות לטווח ארוך של נוירונים glutamatergic אולטרה-נמוך צפיפות בהיפוקמפוס בתנאים חופשית בסרום. ב ~ 2000 נוירונים / 2 ס&quot;מ, הצפיפות היא לפחות שני לקפל נמוך יותר מאשר ברוב ההכנות תרבות &#39;צפיפות נמוכה &quot;עם או בלי תמיכה גליה שדווח על ידי הספרות הקיימת 2,3,11,13,14. בנוסף להיותו צפיפות נמוכה במיוחד, פרוטוקול זה הוא רומן ומשמעותי בשתי דרכים יותר. ראשית, אין שכבת מזין גליה נדרשת כמו הנוירונים בצפיפות הנמוכים להשיג תמיכת גורם trop...

גידול נוירונים בהיפוקמפוס בתנאים חוץ גופית מאפשר תצפית מניפולציה ניסויית של הנוירונים האלה כי הם אחרת לא ניתן in vivo. גישה ניסויית זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחשוף את המנגנונים עצביים של צמיחה, קוטביות, מפרט neurite, סחר ולוקליזציה subcellular של חלבונים, היווצרות הסינפסה והתבגרות פונקציונלית 1. במבחנה אלו נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים, כאשר קוצרים בשלבים עובריים מאוחר, יחסית טהורים (&gt; 90%) תאי glutamatergic של מורפולוגיה פירמידת 2. בגלל נוירונים גדלו משטח 2-D בתנאים במבחנה, שיטה זו מאפשרת התבוננות קלה, כגון הדמיה לחיות או immunocytochemistry (ICC) מכתים באמצעות מטוס בודד מוקדי 3; או מניפולציות, כגון טיפול תרופתי ו transfections 3-6. כאשר גדל בצפיפות גבוהה, נוירונים נוטים להיות בעלי שיעור גבוה של הישרדות בגלל שיתוף גבוהncentrations של גורמי גדילה מופרשים בנוסף לתמיכת עיכול מתקשורת הצמיחה, וגם בגלל מנגנוני קשר תלוי neurite 7. עם זאת, נוירונים בהיפוקמפוס נמוך צפיפות רצויים ללימודי מורפולוגיים, שבו נוירון יחיד ניתן הדמיה בשלמותו או מוכתם לניתוח ICC. נוירונים בצפיפות נמוכה קשה לשמור בתרבות בשל חוסר תמיכה paracrine וכך לעיתים קרובות דורשים תמיכה trophic מתוך גליה שכבת מזין (בדרך כלל קליפת המוח astrocyte), אשר צריך להיות מוכן לפני נוירון תרבות 2. כאשר שיתוף תרבותי עם שכבת מזין תאים גליה, הנוירונים בצפיפות נמוכה גדלים על coverslips, ולאחר מכן התהפך על גבי שכבת גליה כך הנוירונים בצפיפות נמוכה גליה הם פונים זה לזה. מקום מוקף קטן בין גליה נוירונים נוצר על ידי הצבת נקודות פראפין על הפינות של coverslips, ולכן יצירת פריסה &#39;סנדוויץ&#39; 2,8,9. הנוירונים בצפיפות הנמוכים יגדלו within המוקף בין גליה ואת coverslip, אשר יוצר microenvironment מתירנית עם גורמים מרוכזים מופרשים על ידי תאי עצב גליה. גישה זו מניבה בצפיפות נמוכה, נוירונים מפותחים כי הם במרווחים סבירים, ולכן תיוג ICC להקל או בדיקות הדמיה לחיות. חסרון לכאורה של תרבות שיתוף נוירון, גליה, מלבד היותם זמן רב ומייגע, הוא בכך שהיא מונעת מחקר של נוירון הספציפי, או תאים אוטונומיים, מנגנונים. למרות מערכת זו היא הרבה פחות מורכבת מאשר vivo רקמה עצבית, השפעה גליה על פיתוח נוירון דרך מופרש, גורמים לא-עדיין-מוגדר באופן מלא יכול לבלבל הניסויים 10. לכן, בניסויים הדורשים חקירת מנגנוני נוירון ספציפיים, תנאי תרבות מוגדרות המסירים בסרום שכבת תמיכת גליה נחוצים. מחקר קודם הצליחה culturing ריכוזים נמוכים של נוירונים (~ 9,000 תאים / 2 ס&quot;מ) באמצעות המטריקס הידרוג&#39;ל ממדי רי 11. מאז אוכלוסייה עצבית יחסית טהורה יכולה להיות מתורבתת בצפיפות גבוהה בתנאים חופשיים בסרום ללא תמיכת גליה, אנו משערים כי צפיפות נמוכה במיוחד של נוירונים בהיפוקמפוס ניתן לגדל במדיום תרבות בסרום חינם שהוגדר על ידי שיתוף culturing אותם עם נוירונים בצפיפות גבוהים, ב באופן מקביל שיתוף תרבות נוירון, גליה אימצה כמקובל. אכן, תרבויות נוירון בהיפוקמפוס צפיפות גבוהה בתצורת &#39;סנדוויץ&#39; שימשו לאחרונה לתמוך במספר קטן של נוירונים האנדוקרינית magnocellular מתמחה 12. לכן, שיתוף תרבות עם נוירונים צפיפות גבוהים עלולה לאפשר נוירונים בצפיפות נמוכים כדי לקבל תמיכת גורמי trophic כי די בכך כדי לאפשר הישרדות לטווח ארוכה. פרוטוקול זה של נוירונים צפיפות נמוכה במיוחד culturing ובכך גובש ומאומת. הפרוטוקול יכול להיות מיושם בתוך ניסוי בודד אחד, על ידי הכנת צפיפות גבוהה (~ 250,000 תאים / מ&quot;ל) דיסנוירונים בהיפוקמפוס sociated הראשון, ולאחר מכן ביצוע דילול להניב צפיפות ~ 10,000 נוירונים / מ&quot;ל (~ 3,000 נוירונים / coverslip, או ~ 2,000 נוירונים / 2 ס&quot;מ), שהוא הרבה יותר נמוך מאשר רוב דיווחו תרבויות בצפיפות נמוכה 2,3,9 , 11,13. מצב תרבות זה נקרא רופף כתרבות &quot;אולטרה-נמוך צפיפות &#39;ומשתמש עם&#39; בצפיפות נמוכה &#39;בין-changeably. הנוירונים הצפיפות הגבוהים הם מצופים על 24 גם צלחות פולי- D- ליזין מצופות; בעוד נוירונים בצפיפות נמוכה הם זורעים על coverslips זכוכית פולי- D- ליזין מצופה 12 מ&quot;מ אשר ממוקמות בתוך אחר צלחת 24 גם. Coverslips עם הדבקות נוירונים בצפיפות נמוכה הם התהפכו על גבי נוירונים צפיפות הגבוהים 2 hr מאוחר יותר לאחר נוירונים הם צאצאים ומצורפים coverslips. בנוסף, במקום להשתמש נקודות פראפין לרומם את coverslips מעל שכבת נוירון צפיפות הגבוהה, מחט מזרק 18 G שמשה לחרוט בתחתית 24 הצלחות גם עם שני פסים מקבילים. Displ וכתוצאה מכךaced, פלסטיק הסמוך לספק תמיכה גבוהה עבור coverslips הזכוכית. שטח זה נמדד באופן עקבי 150-200 מיקרומטר, המאפשר בינוני חמצן והתרבות מספיק חליפין תוך מתן microenvironment עם גורמי trophic מרוכזים. תחת תנאי זה, הנוירונים בצפיפות הנמוכים לגדול בהרחבה, והוא יכול לשרוד מעבר לשלושה חודשים בתרבות. כאשר נוירונים אלה הם transfected עם פלסמיד GFP לאחר שלושה שבועות בתרבות, הדנדריטים משובצים למכביר עם הקוצים הדנדריטים. כהוכחה עקרוני, הנתונים מוצגים להראות כי מערכת שיתוף תרבות זו תומכת תרבויות צפיפות נמוכה במיוחד של נוירונים בהיפוקמפוס זורעים על &#39;-איים מיקרו&#39; פולי- D- ליזין, שבו יוצרים נוירונים קשרים autaptic שעשויים להקל חקירת התא -autonomous, מנגנוני רשת עצמאית.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>הגן מפני</td></tr><tr><td>אור תוסף B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>aliquot, אחסן בגודל 0.6 מ"ל</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>לדלל 100X&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (AA)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-096</td><td>לדלל 100X&nbsp;</td></tr><tr>מדיום <td></td><td></td><td>תרבית שלם</td><td>מדיום נוירו-בזאלי עם 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I</td></tr><tr><td>מדיום</td><td></td><td></td> שטיפה <td>זהה ל'מדיום נוירו-בזאלי'מדיום</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>הזנה</td><td>נוירובזאלי עם תוסף 1X B27</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>הכינו מלאי 100X ב-0.6 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6407</td><td>MW. 70000-150000</td></tr><tr><td>בוראט בופר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B6768 (חומצה בורית); 71997 (בורקס)</td> <td>1.24 גרם חומצה בורית ו-1.9 גרם בורקס ב-400 מ"ל H2O, pH עד 8.5 השתמש בכיסויי זכוכית עגולים HCl</td></tr><tr><td>12 מ"מ</td><td>Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH</td><td>1001/12</td><td>No. 1 זכוכית, רכישה מ-Carolina Biological Supply</td></tr><tr><td>proFection transfection kit</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>ראה פרוטוקול לפרטים</td></tr><tr><td>2X HEPES buffered salt (HBS)</td> <td>Promega</td><td>E1200</td><td>see&nbsp; פרוטוקול לפרטים</td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td>0.2um גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>ערכת הכנה לפלסמיד אנדופרי</td><td>Qiagen</td><td>12362</td> להכנת נוגדן <td>DNA פלסמיד בדרגת טרנספקציה</td></tr><tr><td>נוגדן נגד MAP2</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td>נוגדן לעכבר, שיבוט AP20</td></tr><tr><td>נוגדן נגד p-Tau</td><td>Millipore</td><td>AB10417</td><td>ארנב נוגדן פוליקלונלי</td></tr><tr><td>אנטי-NR1 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MAB1586</td><td>נוגדן עכבר, שיבוט R1JHL</td></tr><tr><td>נגד GluR1 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB1504</td><td>ארנב פוליקלונלי</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>500 מ"ל</td></tr></tbody></table>

שיטה פשוטה עבור צפיפות ultra-low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס neuron תרבות

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים במבחנת מקלת חקירת מכניסטית של היבטים רבים של התפתחות עצבית. נוירונים בהיפוקמפוס עובריים ניתקו לעתים קרובות יכולים לגדול בהצלחה על זכוכית coverslips בצפיפות גבוהה בתנאי סרום ללא, אבל תרבויות בצפיפות נמוכות בדרך כלל דורשות אספקה ​​של גורמי trophic ידי שיתוף culturing אותם בשכבה מזינה גליה, הכנה אשר יכול להיות זמן רב ומייגעת. בנוסף, הנוכחות של גליה עלולה לבלבל פרשנות של תוצאות ומחקרים ימנעו על מנגנוני נוירון ספציפי. כאן, שיטה פשוטה מוצגת צפיפות נמוכה במיוחד (~ 2,000 נוירונים / 2 סנטימטר), לטווח ארוך (&gt; 3 חודשים) תרבות נוירון בהיפוקמפוס העיקרית היא בתנאים חופשיים בסרום וללא תמיכת תא גליה. נוירונים בצפיפות נמוכים גדלים על coverslips מצופה פולי- D- ליזין, ומתהפכים על נוירונים בצפיפות גבוהים גדלו צלחת 24 גם. במקום להשתמש נקודות פרפין ליצור מרחב between את שתי שכבות עצביות, הנסיינים פשוט יכולים לחרוט בתחתית הפלסטיק של הבאר, שעליו הנוירונים בצפיפות הגבוהים מתגוררים, כדי ליצור microspace תורמת לצמיחת נוירון בצפיפות נמוכה. שיתוף התרבות יכולה להישמר בקלות&gt; 3 חודשים ללא הפסד משמעותי של נוירונים בצפיפות נמוכים, ובכך להקל על הבדיקה מורפולוגית ופיזיולוגית של הנוירונים האלה. כדי להמחיש מצב התרבות המוצלח הזה, נתונים ניתנים להראות היווצרות הסינפסה פזרנית בתאים בצפיפות נמוכים לאחר תרבות ממושכת. מערכת שיתוף תרבות זה מאפשרת גם את ההישרדות של נוירונים בודדים דלילים הגדלים איים של מצעי פולי- D- ליזין וכך היצירה של קשרי autaptic.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר צפיפות נמוכה במיוחד מוצלחת, לתרבות לטווח הארוכה של נוירונים glutamatergic הטהורים ללא הצורך של תאי גליה משמשים שכבת מזין. הפרוטוקול שרטט באיור 1, הכוללת הכנה של צפיפות גבוהה (על פולי- D- ליזין מצופה 24 בארות) ונוירונים בצפיפות נמוכה (על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין) בנפרד, ואת שיתוף התרבות שלאחר מכן שיכולה להישמר עד שלושה חודשים. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=...

תרביות בצפיפות נמוכה של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס דורשות בדרך כלל שכבת הזנה גליה כדי לספק גורמים נוירוטרופיים ולשמור על אריכות ימים. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לתרבית נוירונים בצפיפות נמוכה במיוחד על כיסויי זכוכית בנוכחות שכבת הזנה עצבית בצפיפות גבוהה, המאפשרת חקירה של מנגנונים עצביים-אוטונומיים ספציפיים.

שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להקים תרביות בריאות וארוכות טווח של נוירונים ראשוניים מהיפוקמפוס של עכבר בצפיפות נמוכה במיוחד, וזאת כדי להקל על סימון אימונוציטוכימי ועל חקר מנגנונים אוטונומיים של תאי עצב. מחקר זה יכול לסייע בהבנת שאלות מפתח בתחום מחקר מדעי המוח, כגון מחקרים על סגוליות של חלבונים במורפולוגיה של נוירונים או בתפקודי התפתחות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנוירונים לגדול בצפיפות נמוכה במיוחד על זכוכית כיסוי ללא תמיכה של שכבת תאי גליה מאכילה.את הפרוצדורה תדגים Mariel Piechowicz, סטודנטית מהמעבדה שלי. הכינו שתי פלטות של 24 בארות בצפיפות גבוהה ושתי פלטות בצפיפות נמוכה. בעזרת מחט בכישור (gauge) 28, חרצו את תחתית הפלטות בעלות 24 הבארות, כך שהפלסטיק שהוזז ישמש כתמיכה עבור כיסויי הזכוכית (cover slips) שעליהם גדלים נוירונים בצפיפות נמוכה.העבירו את כיסויי הזכוכית הסטריליים לשתי פלטות ה-24 באריים המיועדות לתרביות בצפיפות נמוכה. צפו את כל ארבע הפלטות ב-300 microliters של Poly-D-lysine בריכוז 0.1 milligram per milliliter המדולל בבופר בוראט, והחזירו אותן לאנקובטור להשכבה למשך לילה.תחת המיקרוסקופ, אחזו בעובר מהעורף באמצעות הפינצטה, ובצעו את החתך הראשון בדיוק בקו האמצע, מתחת למפלס המוזגך. לאחר מכן, בצעו חתך בצד שמאל של בסיס הגולגולת. לאחר מכן, בצעו חתך נוסף בצד ימין של בסיס הגולגולת.השאירו חלק קטן מעצם הגולגולת ומרקמת העור בקצה הרוסטרלי ללא חיתוך, כדי שניתן יהיה להזיז את המוח כולו הצידה לצורך הוצאה קלה. כעת העבירו את המוח לתוך תמיסת ה-HBSS. בדקו את המוח כדי לוודא שהוא שלם ללא אזורים שנגזרו באופן גס.לאחר מכן, חזור על הפרוצדורות כדי לאסוף את שארית מוחות העוברים לצלוחית פטרי חדשה המכילה 20 milliliters של בופר HBSS קר. מקם כל מוח כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה. תוך כדי החזקת המוח בעזרת פינצטה בקצה הקאודלי, בצע חיתוך אלכסוני בין הנקודה הרוסטרלית המרכזית לבין האזור הטמפורלי הקאודלי באמצעות פינצטה חדה.חזרו על פעולה זו עבור ההמיספירה השנייה. לאחר מכן, הפרידו את שתי ההמיספירות עם ההיפוקמפוס השלם מרשמי רקמות גזע המוח. חזרו על הפרוצדורות עבור כל המוחות וקבצו את כל ההמיספירות שחולקו יחד.לאחר מכן, הסירו את קרומי המוח באמצעות שני זוגות פינצטות. זהו את ההיפוקמפוס המתפתח כמבנה מעוקל המקופל בתוך האונה הרקתית והפרידו אותו מרקמות קליפת המוח הסמוכות. אספו ורכזו את כל רקמות ההיפוקמפוס יחד.בפרוצדורה זו, העבירו את כל ההיפוקמפוסים שנותחו אל תמיסת העיכול האנזימטית בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter. לאחר מכן, הניחו את המבחנה בתוך אמבט מים והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 25 דקות. לאחר 25 דקות, הסירו בזהירות את תמיסת האנזים.לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת שטיפה חמה כדי להביא את הנפח הכולל ל-10 מיליליטר. שטפו בעדינות את הרקמה על ידי הפיכת איטית של המבחנה חמש פעמים. הסירו את תמיסת השטיפה והוסיפו שוב 10 מיליליטר של תמיסת שטיפה לשטיפה נוספת.לאחר מכן, הסיר את תמיסת השטיפה והוסף שוב שלושה מיליליטרים של תמיסת שטיפה חמימה וטרייה. נער את המבחנה ביד בעוצמה 15 פעמים כדי לשחרר את הנוירונים שעברו עיכול מהרקמה. התמיסה צריכה להפוך לעכורה ברגע שהתאים יופרדו מהרקמה אל תוך תמיסת השטיפה.לאחר מכן, אספו את תרחיף התאים לשפופרת קונית חדשה בנפח 15 מיליליטר, והשאירו את הרקמה הנותרת בשפופרת. לאחר מכן, הוסיפו שתי מיליליטר נוספות של תמיסת שטיפה לרקמה, והפרידו בעדינות את שארית הרקמה על ידי טריטורציה בעזרת פיפטה מפלסטיק 15 פעמים. המתינו חמש דקות להשקעת תרחיף התאים לפני איסופם לשפופרת קונית חדשה בנפח 15 מיליליטר המכילה את התאים שנאספו בשלב השC-shake off.לאחר מכן, ספרו את צפיפות הנוירונים באמצעות המוציתומטר. חשבו את נפח סספנסיון התאים הדרוש כדי להגיע לצפיפות של 250,000 נוירונים למיליליטר, והוסיפו אותו לאחד משני הפרוטוקולים הקוניים המכילים 30 מיליליטר של מצע גידול מלא, כדי להכין מצע זריעה של נוירונים בצפיפות גבוהה. העבירו 1.2 מיליליטר מתמיסת הנוירונים בצפיפות גבוהה זו ל-30 מיליליטר נוספים של מצע גידול מלא, כדי להגיע לריכוז של 10,000 נוירונים למיליליטר, והשתמשו בתמיסה זו לזריעת זריעות בצפיפות נמוכה.בפרוצדורה זו, מקמו בתוך מראת התרבית פלטות בעלות 24 בארות עם תחתית חרוטה עבור נוירונים בצפיפות גבוהה. הסירו 300 µL מהמדיום שעבר התנייה מוקדמת באמצעות ואקום, ולאחר מכן זרעו 0.6 mL של תרחיף תאים בצפיפות גבוהה בריכוז של 250,000 נוירונים ל-mL. מקמו את שתי הפלטות הנוספות בעלות 24 בארות עם כיסויי זכוכית (cover slips) בתוך מראת התרבית.הסר 300 µL מהמדיום שעבר התניה באמצעות ואקום, לפני זריעה של 0.6 mL של ת сусפנזיית תאים בדחיסות נמוכה בריכוז של 10,000 נוירונים למילליליטר על לוחות הזכוכית. לאחר מכן, החזר את כל ארבעת הפלטות בעלות 24 הבארים למדגרה, והדגר למשך שעתיים. לאחר מכן, הפוך את לוחות הזכוכית בעלי הדחיסות הנמוכה עם הנוירונים הנצמדים אל התרבית בעלת הדחיסות הגבוהה, וודא שהנוירונים פונים זה אל זה.לאחר מכן, החזירו את שתי הפלטות עם התרבית המשולבת (co-culture) לאנקובטור. הזרינו את התרביות המשולבות על ידי הוספה של 300 microliters של מדיום הזנה טרי ביום DIV 5. בעקבות הזנה ראשונית זו, הוסיפו 300 microliters של מדיום הזנה טרי ללא cytosine arabinoside לכל באר בכל שבוע.במידה ויש לשמור את התרבית למשך יותר מחודש, יש להחליף מחצית מהמצע במצע הזנה טרי מדי שבוע לאחר נקודת הזמן של חודש אחד. מבחינה מורפולוגית, הן נוירונים בצפיפות גבוהה והן נוירונים בצפיפות נמוכה אמורים להיראות בריאים עד שלושה חודשים. כאן, נעשה שימוש בסימון אימונוציטוכימי כדי לחשוף סינפסות גלוטמטרגיות תפקודיות, שבהן תת-היחידה NR1 של רצפטור NMDA ותת-היחידה GluR1 של רצפטור ApoE מסומנות באמצעות צביעה כפולה.ניתן לזהות ולכמת בקלות את הסינפסות התפקודיות באמצעות Image J. נוירונים בצפיפות נמוכה מסומנים גם בעזרת נוגדן למסמן החלבוני הדנדריטי MAP2 בשילוב עם המסמן החלבוני האקסונלי p-Tau. סימון כפול זה מאפשר הבחנה ברורה בין דנדריטים לאקסונים. ניתן לבצע בהצלחה טרנספקציה של פלסמידי DNA גם לתרביות בצפיפות נמוכה באמצעות שיטות של סידן פוספט, אם כי שיעור הטרנספקציה הוא בדרך כלל נמוך מאוד בשלבים מאוחרים יותר.איור זה ממחיש כי טרנספקציית EGFP יכולה לחשוף את המורפולוגיה העצבית ולהפוך מבנים עדינים של קוצי דנדריטים לנראים. לבסוף, כהוכחה להיתכנות, ניתן לגדל נוירונים בצפיפות נמוכה במיוחד בתנאים המעודדים היווצרות של אוטפסיס (autapse). נוירונים אוטפטיים בצפיפות נמוכה במיוחד, הגדלים על מיקרו-איים מצופים ב-Poly-D-lysine, יכולים להיתמך על ידי נוירוני מאכיל (feeder neurons) בצפיפות גבוהה למשך תקופה העולה על חודשיים באמצעות פרוטוקול תרבית משותפת זה.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בשעתיים עד שלוש שעות ביום התרבית התאית, במידה שהיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, קריטי לצפות את כיסורי הזכוכית ואת תחתית פלטת 24 הבארים ב-Poly-D-lysine. צריבה פשוטה של תחתית הפלטה מספיקה כדי לספק תמיכה מכנית ותזונתית לנוירונים של ההיפוקמפוס בצפיפות נמוכה כדי שיגדלו על כיסורי הזכוכית.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן גידולם של נוירונים ראשוניים מהסבך ההיפוקמפלי של עוברי עכבר בצפיפות נמוכה מאוד, ללא שכבת תאי תמיכה גליאליים. אנו מקווים שתוכלו להשתמש בשיטה זו למטרות הניסוי שלכם.

a-simplified-method-for-ultra-low-density-long-term-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

דיסקציה וצמיחה של תאים מאזור המוח הפרט מאפשר חקירה של פרמטרים פיזיולוגיים הסלולר. אנו מתארים שיטה culturing התא הראשוני שמייצר נוירון מועשר תרבויות בסביבה בסרום חופשי.

תרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות P0 יילוד

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמיה של המיטוכונדריה לחיות הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי פני משכי זמן ארוכים. הדמיה על תקופות ממושכות נעשה באמצעות הביטוי lentivirus בתיווך של חלבון פלואורסצנטי ממוקד mitochondrially ושימוש זול הבמה העליון חממה כי תוכנן ונבנה במעבדה שלנו.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

אנו מספקים פרוטוקול תרבות מטוהרים מאוד נוירונים בהיפוקמפוס של המוח עכבר טרום לידתי ללא שימוש שכבת תא גלייה מזין.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

הסרטון מדגים שיטה לגידול תאי עצב מהיפוקמפי. בתחילה, ההיפוקמפוס עובר עיכול אנזימטי כדי לפרק את מטריצת הרקמה החוץ תאית. לאחר מכן, הרקמה המעוכלת משובשת מכנית כדי לבודד נוירונים בודדים. לבסוף, תאי עצב אלה מגודלים בתרבית על תאי הזנת גלייה.

טכניקה לתרבית תאי עצב בהיפוקמפוס עכבר

סרטון זה מדגים את השיטה של תרבית נוירונים עובריים שמורים בהקפאה, הכוללת הפשרה מבוקרת, דילול עם תווך נוירובזאלי וזריעה על צלחת מצופה פולי-L-ליזין. הדגירה הבאה תומכת בצמיחה ובתחזוקה של קשרים עצביים.

יצירת תרבית נוירונים ראשונית בצפיפות נמוכה מתאי עצב עובריים קפואים

סרטון זה מדגים את השיטה לטיפוח נוירונים בעלי צפיפות נמוכה במיוחד בנוכחות שכבת הזנה עצבית בצפיפות גבוהה. הוא מבסס תרבות משותפת של נוירונים בצפיפות משתנה, ומבטיח קרבה פיזית קרובה. גורמי הגדילה המופרשים על ידי נוירונים בעלי צפיפות גבוהה מסייעים להישרדות ולגדילה של תאי עצב, ושומרים על תאי עצב בעלי צפיפות נמוכה במיוחד למשך פרק זמן ארוך יותר.

יצירת תרבית עצבית בצפיפות נמוכה במיוחד באמצעות שכבת הזנה עצבית בצפיפות גבוהה

סרטון זה מדגים את הדיסוציאציה והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מדגימות רקמת ההיפוקמפוס באמצעות דיסוציאציות אנזימטיות ומכניות. הטיפול עם Ara-C מעכב את הצמיחה של תאים שאינם עצביים, להקל על הצמיחה הסלקטיבית של נוירונים בהיפוקמפוס.

ניתוק וטיפוח תאי עצב מדגימות רקמת ההיפוקמפוס

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול עבור culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים בצפיפות נמוכה גדלו על coverslips הזכוכית הפוך מעל בשכבת גליה. שכבות הנוירון גליה מופרדות חרוזי פראפין. הנוירונים גדלו על ידי שיטה זו מתאימים הדמיה אופטית מבחנים תפקודיים ברזולוציה גבוהה.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה כדי ללמוד חלבון שיתוף מקומי בתרבויות עצביות עיקריות.

הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים

מלאי קפוא מוכן לשימוש של נוירונים הוא כלי רב עוצמה להערכת תפקודים סינפטיים. כאן, אנו מציגים תרבית ראשונית קלה בצפיפות נמוכה ממלאי קפוא באמצעות צלחת של 96 בארות.

תרבית ראשונית קלה וניתנת לשחזור בצפיפות נמוכה באמצעות מלאי קפוא של נוירונים עובריים בהיפוקמפוס

למדו שיטה לגידול נוירונים היפוקמפליים ראשוניים בעכברים בצפיפות אולטרה-נמוכה ללא שכבת תומכת גליאלית. טכניקה זו מאפשרת חקר מנגנונים תא-אוטונומיים בנוירונים לאורך זמן.

שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

גלה סרטונים נוספים