שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס תרביות בריאות לטווח ארוך של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של עכברים בצפיפות נמוכה במיוחד, על מנת להקל על תיוג אימונוציטוכימיה, וחקר מנגנונים אוטונומיים של תאים עצביים. מחקר זה יכול לסייע בהבנת כמה שאלות מפתח בתחום המחקר במדעי המוח, כגון המחקרים על הספציפיות של חלבון בנוירומורפולוגיה של תפקוד ההתפתחות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לתאי עצב לגדול בצפיפות נמוכה במיוחד על החלקת כיסוי ללא תמיכה של שכבת הזנה גליאלית.

תדגים את ההליך מריאל פיצ'וביץ', סטודנטית מהמעבדה שלי. הכן שתי צלחות בצפיפות גבוהה ושתי צלחות בצפיפות נמוכה של 24 בארות. בעזרת מחט בקוטר 28, חרטו את החלק התחתון של 24 לוחות באר, כך שהפלסטיק שנעקר ישמש כתמיכה להחלקות הכיסוי עם נוירונים בצפיפות נמוכה שגדלים עליהם.

העבירו את החלקות כיסוי הזכוכית הסטריליות לשתי צלחות 24 בארות המיועדות לתרביות בצפיפות נמוכה. מצפים את כל ארבע הצלחות ב-300 מיקרוליטר של 0.1 מיליגרם למיליליטר פולי-D-ליזין מדולל במאגר בוראט, ומחזירים אותם לחממה לציפוי דגירה למשך הלילה. לפני איסוף הרקמות, הכינו שתי צלחות פטרי בגודל 10 ס"מ מלאות ב-HBSS סטרילי קר כקרח.

מתחת למיקרוסקופ, החזיקו את העובר בצוואר בעזרת המלקחיים, ובצעו את החיתוך הראשון ממש על קו האמצע, מתחת לגובה המוח הקטן. לאחר מכן, בצע חתך בצד שמאל של בסיס הגולגולת. לאחר מכן, בצע חתך נוסף בצד ימין של בסיס הגולגולת.

השאירו חלק קטן מעצם הגולגולת ורקמת העור בקצה הרוסטרלי לא חתוך, כך שניתן יהיה להפוך את כל המוח הצידה למיצוי בקלות. עכשיו העבירו את המוח לפתרון HBSS. בדוק את המוח כדי לוודא שהוא שלם ללא אזורים חתוכים ברוטו.

לאחר מכן, חזור על ההליכים כדי לאסוף את שאר מוחות העוברים בצלחת פטרי חדשה המכילה 20 מיליליטר של מאגר HBSS קר. מקם כל מוח כשהצד הגחוני כלפי מעלה. תוך כדי החזקת המוח עם מלקחיים בקצה הזנב, בצע חתך באלכסון בין נקודת הרוסטרל האמצעית לאזור הטמפורלי הזנבי בעזרת פינצטה חדה.

חזור על זה עבור חצי הכדור השני. לאחר מכן, הפרד את שתי ההמיספרות עם ההיפוקמפוס השלם משאר רקמות הגזע של המוח. חזור על ההליכים עבור כל המוחות ואגד את כל ההמיספרות המנותחות יחד.

לאחר מכן, הסר את קרומי המוח באמצעות שני זוגות פינצטה. זהה את ההיפוקמפוס המתפתח כמבנה מעוקל המקופל בתוך האונה הטמפורלית והפריד אותו מרקמות קליפת המוח הסמוכות. אסוף ואגד את כל רקמות ההיפוקמפוס יחד.

בהליך זה, העבירו את כל ההיפוקמפוס המנותח לתמיסת העיכול האנזימטית בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הניחו את הצינור בתוך אמבט מים ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות. לאחר 25 דקות, הסר בזהירות את תמיסת האנזים.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום כביסה חם כדי להביא את הנפח הכולל ל -10 מיליליטר. שטפו בעדינות את הטישו על ידי היפוך איטי של הצינור חמש פעמים. הסר את מדיום הכביסה והוסף שוב 10 מיליליטר של מדיום כביסה, לשטיפה נוספת.

לאחר מכן, הסר את מדיום הכביסה והוסף שוב שלושה מיליליטר של מדיום כביסה חם טרי. נער את הצינור ביד בקפדנות 15 פעמים כדי לעקור את הנוירונים המעוכלים מהרקמה. המדיום צריך להיות עכור ברגע שהתאים מופרדים מהרקמה למדיום הכביסה.

לאחר מכן, אסוף את תרחיף התאים בצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר, תוך השארת הרקמה הנותרת בצינור. לאחר מכן, הוסיפו עוד שני מיליליטר של מדיום כביסה לרקמה, והפרידו בעדינות את הרקמה שנותרה על ידי טריטורציה עם פיפטה מפלסטיק 15 פעמים. הניחו לתרחיף התא לשבת במשך חמש דקות לפני שאספו אותו לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר המכיל את תאי הניעור שנאספו.

לאחר מכן, ספרו את צפיפות הנוירונים בעזרת המוציטומטר. חשב את נפח תרחיף התא הדרוש כדי להניב צפיפות של 250,000 נוירונים למיליליטר, והוסף אותו לאחד משני הצינורות החרוטיים המכילים 30 מיליליטר של מדיום תרבית שלם, כדי להפיק מדיום ציפוי נוירונים בצפיפות גבוהה. העבירו 1.2 מיליליטר מתמיסת נוירונים בצפיפות גבוהה זו לעוד 30 מיליליטר של מדיום תרבית שלם, כדי להניב ריכוז של 10,000 נוירונים למיליליטר, והשתמשו בתמיסה זו כדי לזרוע את החלקות הכיסוי בצפיפות נמוכה.

בהליך זה, הניחו צלחות של 24 בארות עם תחתית חרוטה לנוירונים בצפיפות גבוהה במכסה המנוע. הסר 300 מיקרוליטר מהמדיום המותנה מראש על ידי ואקום, ואז צלח 0.6 מיליליטר של תרחיף תאים בצפיפות גבוהה ב -250, 000 נוירונים למיליליטר. הניחו את שתי הצלחות האחרות בנות 24 בארות עם החלקות כיסוי במכסה המנוע.

הסר 300 מיקרוליטר מהמדיום המותנה מראש על ידי ואקום, לפני ציפוי 0.6 מיליליטר של תרחיף תאים בצפיפות נמוכה ב-10,000 נוירונים למיליליטר על החלקות הכיסוי. לאחר מכן, החזירו את כל ארבע צלחות 24 הבארות לחממה, ודגרו במשך שעתיים. לאחר מכן, הפוך את החלקות הכיסוי בצפיפות נמוכה עם נוירונים דבוקים לתרבית בצפיפות גבוהה וודא שהנוירונים פונים זה לזה.

לאחר מכן, החזירו את שתי הצלחות עם תרבות משותפת לחממה. האכילו את התרבויות המשותפות על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של מדיום הזנה טרי ב-DIV חמש. לאחר האכלה ראשונית זו, הוסף 300 מיקרוליטר של מצע הזנה טרי ללא ציטוזין ארבינוזיד לכל באר מדי שבוע.

אם התרבות נשמרת יותר מחודש, החלף מחצית מהמדיום במדיום הזנה טרי כל שבוע מעבר לנקודת זמן של חודש. מבחינה מורפולוגית, גם נוירונים בצפיפות גבוהה וגם בצפיפות נמוכה אמורים להיראות בריאים עד שלושה חודשים. כאן, תיוג אימונוציטוכימיה משמש לחשיפת הסינפסות הגלוטמטרגיות התפקודיות שבהן תת-יחידה של קולטן NMDA NR1 ותת-יחידת קולטן ApoE GluR1 מסומנות בצביעה כפולה.

וניתן לזהות ולכמת בקלות את הסינפסות הפונקציונליות באמצעות תמונה J.נוירונים בצפיפות נמוכה מסומנים גם בנוגדנים כנגד סמן החלבון הדנדריטי MAP2 בשילוב עם סמן חלבון אקסונלי p-Tau. תיוג כפול זה מאפשר הבחנה ברורה בין דנדריטים ואקסונים. ניתן גם להעביר בהצלחה תרביות בצפיפות נמוכה עם פלסמידים של DNA בשיטות סידן פוספט, אם כי קצב הטרנספקציה בדרך כלל נמוך מאוד בשלבים מאוחרים יותר.

איור זה ממחיש כי טרנספקציה של EGFP יכולה לחשוף מורפולוגיה עצבית, ולהפוך מבני עמוד שדרה דנדריטיים עדינים לגלויים. לבסוף, כהוכחה לרעיון, ניתן לגדל נוירונים בצפיפות נמוכה במיוחד בתנאים המקדמים היווצרות אוטפס. נוירונים אוטפטיים אלה בצפיפות נמוכה במיוחד הגדלים על מיקרו-איים מצופים פולי-D-ליזין, יכולים להתקיים על ידי נוירוני ההזנה בצפיפות גבוהה מעבר לחודשיים עם פרוטוקול תרבית משותפת זה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש ביום תרבית התאים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, זה קריטי לצפות את החלקות כיסוי הזכוכית ותחתיות הצלחות של 24 בארות בפולי-D-ליזין. תחריט פשוט של תחתיות הצלחות מספיק כדי לספק תמיכה מכנית ותזונתית לנוירונים בהיפוקמפוס בצפיפות נמוכה לגדול על החלקות הכיסוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגדל נוירונים עובריים ראשוניים בהיפוקמפוס בצפיפות נמוכה במיוחד, בהיעדר שכבת הזנה גליאלית. אני מקווה שתוכל להשתמש בשיטה זו למטרת הניסוי שלך.